Том 68, № 6 (2023)

Пандемия вируса гриппа А остается значительной угрозой для здоровья населения планеты. Для борьбы с пандемией в основном используется один класс противовирусных препаратов, а именно, ингибиторы специфического вирусного фермента – нейраминидазы, к которым относятся занамивир (Relenza™) и озельтамивир (Tamiflu™). Отметим, что устойчивость вируса к этому классу соединений неуклонно растет. Протонный канал M2 вируса гриппа А является альтернативной, клинически доказанной мишенью противовирусной терапии. Однако многие циркулирующие штаммы вируса имеют аминокислотные мутации в белке M2, вызывающие устойчивость к препаратам адамантанового ряда – блокаторам М2, таким как римантадин и амантадин. Следовательно, ингибиторы, способные воздействовать на мутантные формы канала M2, крайне необходимы для биобезопасности населения. Представлен обзор структурно-функциональных взаимодействий экспериментальных лекарственных препаратов с белком-мишенью – трансмембранным доменом протонного канала M2 вируса гриппа. Проведен анализ экспериментальных и модельных структурных данных, находящихся в открытом доступе.

Создан высокоэффективный штамм-продуцент Escherichia coli C3030/pET23d⁺-EcHGPRT, позволяющий получать рекомбинантную гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу из E. coli (EcHGPRT) в растворимой форме. Разработана методика выделения и очистки рекомбинантного белка. Определена удельная активность в отношении природного субстрата и производных пиразин-2-карбоксамида. Методом встречной диффузии в капилляре выращены кристаллы комплексов EcHGPRT с 3-гидроксипиразин-2-карбоксамидом (T-1105) и с 6-фтор-3-гидроксипиразин-2-карбоксамидом (T-705), пригодные для рентгеноструктурного исследования. Дифракционные наборы до разрешения соответственно 2.4 и 2.5 Å собраны на синхротроне ESRF (Франция, станция ID23-1) при температуре 100 K. Кристаллы относятся к пр. гр. P3(1)21, в независимой части ячейки содержатся две молекулы фермента.

Коронавирус SARS-CoV-2 стал причиной глобальной пандемии COVID-19, унесшей миллионы жизней по всему миру. Одним из подходов к терапии тяжелых форм этого заболевания является использование препаратов вируснейтрализующих антител к рецепторсвязывающему домену (RBD) спайкового белка (S) вируса. Детальная структурная информация о конкретных эпитопах, узнаваемых такими вируснейтрализующими антителами, является важным аспектом усовершенствования существующих антител с целью расширения спектра узнаваемых вирусных штаммов. Получен стехиометрический комплекс вируснейтрализующего однодоменного антитела P2C5 и гликозилированной формы RBD S-белка SARS-CoV-2. Несмотря на большое количество условий, при которых наблюдается рост кристаллов комплекса, последние не дифрагируют предположительно ввиду гетерогенности, связанной с гликозилированием RBD. С целью повышения качества кристаллов в бактериальной системе экспрессии получена дегликозилаза PNGase F и проведено дегликозилирование RBD. Несмотря на сниженную растворимость дегликозилированной формы RBD, она сохраняет способность связываться с наноантителом P2C5, что приводит к формированию прочного гетеродимерного комплекса при гель-фильтрации. Получены кристаллы такого комплекса, дифрагирующие на лабораторном и синхротронном источниках до сходного разрешения ~4 Å. Установлены пространственная группа симметрии, параметры кристаллической ячейки и ее белковый состав.

Первичные процессы фотосинтеза у пурпурных фотосинтезирующих бактерий происходят в светособирающих комплексах (Light-Harvesting, LH). В состав комплекса LH2 входят полипептиды, бактериохлорофилл и в большинстве случаев каротиноиды. Известны три пространственные структуры комплексов LH2 из пурпурных несерных бактерий, однако для пурпурных серных бактерий структуры с высоким разрешением не установлены. Описываются структурные исследования двух светособирающих комплексов LH2 из пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila, проведенные методом криоэлектронной микроскопии. Получены изображения каротиноидсодержащего (LH2+) и бескаротиноидного (LH2–) вариантов комплекса, демонстрирующие характерную архитектуру объектов данного типа. Проведена трехмерная реконструкция LH2+ с разрешением 4.5 Å, совпадающая с ранее установленной кристаллической структурой. Для LH2– показано наличие частиц различной морфологии.

Проведенные ранее исследования пространственной структуры комплексов гость–хозяин макроциклических кавитандов кукурбитурилов с рядом нитроксильных радикалов методами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), ЯМР и кристаллографии показали, что в водных растворах с использованием в качестве молекул-гостей ряда нитроксильных радикалов могут возникать упорядоченные агрегаты в форме равностороннего треугольника из трех монокомплексов гость–хозяин в его вершинах. Получены экспериментальные результаты по малоугловому рентгеновскому рассеянию водных растворов комплексов гость–хозяин кукурбит[8]урила со стабильным нитроксильным радикалом – протонированным темпоамином и проведено ab initio-моделирование на их основе формы агрегатов комплексов, находящихся в естественном состоянии в растворе. При поиске моделей формы агрегатов либо не использовали никакой дополнительной информации об их структуре, либо вводили наличие оси третьего порядка. ЭПР применен в качестве независимого метода исследования агрегации комплексов в растворе. Показано, что форма частиц комплексов при больших концентрациях кавитанда и гостя в водном растворе близка по своим параметрам к равностороннему треугольнику, что согласуется с известными кристаллографическими данными и ЭПР.

Определена структура белка Hfq из бактерии Chromobacterium haemolyticum, формирующая кристаллы в двух различных пространственных группах. В обоих случаях белок имеет характерную четвертичную структуру кольцевого гексамера. Полученная структура показала ранее не описанный вариант взаимодействия С-концевой неструктурированной части Hfq с аминокислотными остатками проксимального РНК-связывающего участка белка. Такой контакт может вносить вклад в регуляцию связывания молекул РНК с белком Hfq.

Кристаллы фермента пуриннуклеозидфосфорилазы из экстремофильной бактерии Halomonas chromatireducens AGD 8-3, подходящие для рентгеноструктурного исследования, выращены методом диффузии паров. Дифракционный набор от полученных кристаллов собран до разрешения 1.8 Å на станции белковой кристаллографии “Белок” синхротрона Национального исследовательского центра “Курчатовский институт” при температуре 100 K. Набор данных обработан для пр. гр. P1, Р2, Р2₁ и Р622. Решение методом молекулярного замещения с учетом двойникования было найдено для групп Р2₁ и P1, содержащих в независимой части элементарной ячейки один и два гексамера фермента соответственно.

D-циклосерин ингибирует пиридоксаль-5'-фосфат (PLP)-зависимые ферменты как обратимо, так и необратимо. Как ингибитор аланинрацемазы D-циклосерин применяется в лекарственной терапии при лечении туберкулеза. Известны несколько продуктов взаимодействия D-циклосерина и PLP в активном центре фермента. Представлена кристаллическая структура комплекса PLP-зависимой трансаминазы D-аминокислот из бактерии Aminobacterium colombiense (Amico) с D-циклосерином, полученная с разрешением 1.9 Å, в которой впервые обнаружен аддукт PLP и D-циклосерина с раскрытым кольцом. Кроме того, взаимодействие D-циклосерина и Amico охарактеризовано кинетическими и спектральными методами, определены разнообразные продукты взаимодействия D-циклосерина и PLP в активном центре трансаминазы, проанализирована координация аддуктов D-циклосерина и PLP в активном центре Amico. В ходе исследований установлено, что продуктами взаимодействия D-циклосерина с PLP в активном центре Amico являются несколько соединений, в том числе аддукты PLP и DCS в циклической и разомкнутой формах, оксим, образованный PMP и β-аминоокси-D-аланином, а также PMP и β-аминооксипируват.

Модифицированный алгоритм “имитации отжига”, реализованный в программе DAMMINV, позволяет получать 10–15 различных моделей наночастицы, приближающих данные малоуглового рентгеновского рассеяния. Основой метода является режим перемежающихся весовых коэффициентов целевой функции, в котором балансируются вклады от штрафных коэффициентов, отвечающих за реалистичность модели, и вклад от невязки между экспериментальной и модельной кривыми рассеяния. Исследовано влияние шума на кривых рассеяния на качество восстановления трехмерной формы спирали, а также проведено сравнение результатов с полученными стандартными программами. Метод протестирован на модельных данных, свободных от шума и с наложением пуассоновского шума на примере спиральной частицы с толщиной витков, сопоставимой с характерным размером пространства между ними. Проведен сравнительный анализ восстановленных моделей с 3D-формами, полученными алгоритмами “имитации отжига” в стандартном режиме работы.

С помощью метода ускоренной молекулярной динамики проведено моделирование поведения димера, выделенного из кристаллической структуры тетрагонального лизоцима. Моделируемое время составило 240 нс. Проведено сравнение полученных данных с данными, полученными ранее с применением классической молекулярной динамики. Показано, что исследуемый димер стабилен в обоих экспериментах, однако метод ускоренной молекулярной динамики позволил выявить дополнительные конформационные изменения молекул лизоцима.

Современная эпидемиологическая обстановка, в том числе новый вирус SARS-CoV-2 и его высокая мутагенность, требуют принципиально новых сроков создания вакцин, что может быть достигнуто только за счет применения современных вычислительных технологий и моделирования. С использованием методов иммуноинформатики найдены эпитопы в спайковом белке вируса SARS-CoV-2, для найденных эпитопов предсказаны их аллергенность и иммуногенность, показано, что на основе данных эпитопов возможно сконструировать вакцину против SARS-CoV-2.

Проанализирован геном африканской чумы свиней и выявлен белок, способный служить иммуногеном. Для водорастворимого фрагмента данного белка методом молекулярной динамики показано, что он стабилен в водно-солевом растворе. Иммуномоделирование показало, что данный фрагмент вызывает клеточный ответ, следовательно, может быть использован в качестве прототипа вакцины.

С помощью методов двумерной дифракции и рентгеновской рефлектометрии проведены исследования, посвященные изучению молекулярных механизмов взаимодействия противоопухолевого антибиотика доксорубицина с липидными моделями клеточных мембран. В качестве модельных систем использованы монослои четырех видов фосфолипидов, относящихся к основным компонентам мембран животных клеток. Получена новая информация о процессах повреждения кристаллической решетки фосфолипидных монослоев под действием доксорубицина. Установлено, что действие доксорубицина на монослои анионных фосфолипидов определяется электростатическим взаимодействием: положительно заряженные молекулы доксорубицина встраиваются между отрицательно заряженными функциональными группами фосфолипида. В случае нейтральных фосфолипидов основная роль принадлежит гидрофобному взаимодействию: молекулы доксорубицина координируются с углеводородными хвостами фосфолипида в неупорядоченных областях.

Исследована минерализация карбонатом кальция многослойных оболочек эмульсионных капсул, сформированных методом послойной сборки полиэлектролитов. Найдены оптимальные условия создания микрокапсул с ядром из масла ши и органико-неорганической оболочкой из синтетических полиэлектролитов и карбоната кальция. Исследованы морфология оболочки, стабильность капсул в водной суспензии при нагревании, а также проведена оценка их цитотоксичности в отношении клеток фибробластов человека. Показано, что минерализация эмульсионных полиэлектролитных капсул карбонатом кальция в форме ватерита приводит к укреплению стенок капсул и повышению их биосовместимости.