Том 69, № 3 (2024)

Повышение эффективности и точности систем геномного редактирования является актуальной задачей современной молекулярной биологии и генетической инженерии. Особый интерес вызывает создание регулируемых систем CRISPR/Cas, активностью которых можно управлять с использованием различных физико-химических стимулов, таких как облучение светом, изменение рН, температура, изменение концентраций определенных веществ и др. Многообещающим направлением в этой области является разработка подходов к регуляции активности на уровне направляющей РНК за счет введения фоточувствительных модификаций в структуру и последовательность направляющей РНК, а также вспомогательных олигонуклеотидов. Данный обзор посвящен анализу работ в области создания фоточувствительных направляющих РНК и их использования в системах редактирования генома CRISPR.

Изучение низкодозовых эффектов актуально в связи с расширением районов с антропогенной нагрузкой. Торий – один из фонообразующих элементов в природных экосистемах, его содержание может повышаться в окружающей среде в ходе добычи природных ресурсов и работы ТЭЦ. Особый интерес представляют биоэффекты тория в присутствии гуминовых веществ – природных детоксикантов. Целью работы является выявление нейтрализующего эффекта гуминовых веществ в условиях низкодозового воздействия тория-232 (< 0.04 Гр). В качестве модельного биологического объекта выбрана биолюминесцентная система ферментативных реакций, включающая бактериальную люциферазу и НАД(Ф)Н:ФМН-оксидоредуктазу. Выявлена активация биолюминесценции на начальном этапе воздействия тория-232 (до 50 мин) и увеличение содержания активных форм кислорода после 50 мин его воздействия. Показана связь интенсивности биолюминесценции и содержания активных форм кислорода (коэффициент корреляции –0.86). Присутствие гуминовых веществ нейтрализует активирующее действие тория и уменьшает содержание активных форм кислорода до контрольного значения. Продемонстрировано влияние гуминовых веществ на скорость НАДН-зависимого ферментативного редокс-процесса. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов воздействия тория-232 и нейтрализации его влияния на ферментативные процессы.

Представлены данные о том, что при изменении условий вегетации растений изменяются уровни экспрессии генов, кодирующих карбоангидразы хлоропластов, а также карбоангидразная активность компартментов хлоропласта. Результаты экспериментов с мутантами по генам хлоропластных карбоангидраз свидетельствуют, что активность карбоангидраз хлоропластов определяет характер изменений реакций фотосинтеза в ответ на изменения условий внешней среды. Предложены возможные механизмы участия карбоангидраз в протекании светозависимых процессов в хлоропласте. На основании полученных результатов высказана гипотеза о взаимосвязанном функционировании карбоангидраз в хлоропластах.

Фотосистема II – один из основных пигмент-белковых комплексов фотосинтеза, обладающий высокой чувствительностью к неблагоприятным факторам внешней среды. Неоднородность свойств фотосистемы II необходима для устойчивости автотрофных организмов к стрессовым факторам. Оценка гетерогенности фотосистемы II может быть использована в экологическом мониторинге для оперативного выявления загрязнения окружающей среды. Предлагается комплексный подход к оценке гетерогенности фотосистемы II, основанный на математическом анализе формы кривой индукции флуоресценции хлорофилла а образцов, обработанных 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевиной с помощью математической модели и параметров JIP-теста. Были проанализировали кривые индукции флуоресценции, полученные для обработанных образцов культуры клеток Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Pleurochloris и Stichococcus при выращивании на свету интенсивностью 8 и 16 Вт·м–2. Для всех случаев проведена оценка соотношения реакционных центров с различным размером антенн (альфа- и бета-центров), а также определена доля активных и неактивных кислород-выделяющих комплексов.

Исследовано влияние катионных антисептиков (в микромолярных концентрациях) на изолированные из растений шпината активные коровые комплексы ФСII с интактным комплексом окисления воды и на коровые комплексы ФСI из цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803. Из исследованных антисептиков (мирамистина, хлоргексидина, октенидина и пиклоксидина) наибольший эффект оказывал октенидин. Сделан вывод, что его влияние на ФСII заключается прежде всего в воздействии на структуру светособирающей антенны (СР43 и СР47), через которую энергия возбуждения доставляется к собственно реакционному центру. В результате происходит дестабилизация молекул хлорофиллов в данной структуре и изменение их оптических и функциональных характеристик. Сходные эффекты наблюдались также в цианобактериальных комплексах ФСI. Кроме того, антисептик влиял на скорость установления равновесного распределения возбужденных состояний по спектральным формам в антенном комплексе ФСI. Обнаружено и значительное воздействие октенидина на скорость переноса электронов в комплексе ФС I: в его присутствии рекомбинация фоторазделенных зарядов между фотоактивным пигментом Р700 и концевым акцептором FA/FB происходит в два раза быстрее.

Т4-родственный бактериофаг RB49, способен осуществлять общую трансдукцию плазмид с относительно высокой частотой. За счет этого механизма бактерии могут приобретать возможности для адаптации к изменяющимся условиям среды и осваивать новые экологически ниши. Исследовано воздействие рН, температуры и облучения длинноволновым ультрафиолетовым светом (λ = 366 нм) на характеристики препарата фага RB49, содержащего трансдуцирующие частицы с плазмидной ДНК pTurboGFP-B и вирулентные частицы с собственной ДНК. Получены данные об изменениях титра вирулентных частиц и частоты трансдукции плазмиды pTurboGFP-B фагом RB49. После воздействия УФ-излучения в течение 2 ч частота трансдукции плазмиды pTurboGFP-B фагом RB49 выросла в ~3 раза. За 40 мин хранения препарата во льду также отмечался рост частоты трансдукции в несколько раз. На основе полученных экспериментальных данных можно сделать предположение, что трансдуцирующие частицы фага RB49 могут быть более устойчивы к действию длинноволнового УФ-излучения и воздействию температур, близких к 0°C, чем вирулентные, и обеспечивать процесс трансдукции более эффективно, чем при нормальных условиях. Схожие процессы могут происходить и в хорошо освещенных водоемах, в том числе холодных, в которых могут встречаться фаги, родственные RB49. Это может свидетельствовать о возможности более интенсивного горизонтального переноса генов в водных экотопах, чем предполагалось ранее.

Продемонстрированы возможности использования тест-системы на основе живых клеток E. coli BL-21 (DE3) Сodon Plus, экспрессирующих рН-резистентную термостабильную люциферазу светляка Luciola mingrelica для изучения кинетики действия аминогликозидов (на примере гентамицина) по изменению содержания АТФ и люциферазы внутри и вне клеток. Показано, что через 3 ч инкубации бактерий с антибиотиком становится возможным оценить изменение жизнеспособности клеток, эффективность действия антибиотика и прогнозировать образование персистеров. Метод перспективен при проведении быстрого первичного высокопроизводительного скрининга антибактериальных агентов и лекарственных форм для оценки их эффективности и механизма их действия.

Представлены результаты исследований люминесцентной системы культуры гриба Mycena gombakensis, выделенной из образцов древесины. Описаны изменения, произошедшие за 10 лет хранения образцов в нестерильных условиях, и динамика люминесцентных сигналов. Методом филогенетического анализа выполнена видовая идентификация гриба. Представлен ряд уникальных особенностей M. gombakensis, расширяющих представления о свойствах люминесцентных грибов. Данные исследований свидетельствуют о перспективности использования M. gombakensis как в биотехнологии, так и в изучении биофизики сложной системы базидиомицетов.

Развитие методов дистанционного и проксимального мониторинга ранних фотосинтетических ответов при действии стрессоров является важной сельскохозяйственной и экологической задачей. Фотохимический индекс отражения (photochemical reflectance index, PRI), который преимущественно рассчитывается на основании величин отраженного света на 531 и 570 нм, является потенциально чувствительным к быстрым изменениям фотосинтеза под действием неблагоприятных факторов. Считается, что механизмы изменений PRI включают в себя сжатие хлоропластов и агрегацию светособирающих комплексов, переходы в цикле ксантофиллов и изменения концентрации хлорофиллов и каротиноидов, что затрудняет использование PRI для мониторинга состояния растений. Применение импульсного измерительного света, исследование светоиндуцированных изменений PRI и анализ модифицированных PRI являются подходами для повышения эффективности применения индекса. Нельзя исключать и другие пути для такого повышения (например, развитие методов оценки на PRI-основе RGB-имиджинга). Развитие методов измерения и анализа PRI имеет значительные перспективы для мониторинга стрессовых ответов фотосинтеза у растений.

Измерения спектрального состава света на границе фотической зоны в семи прибрежных водоемах, в разной степени изолированных от моря, на морской акватории и в пресном озере показали, что в морских и солоноватых водоемах до нее доходит преимущественно зеленый свет, а в озерах c пресным верхним слоем – оранжевый, красный и дальний красный. В меромиктических водоемах фотическая зона была ограничена окрашенной прослойкой воды с массовым развитием фототрофных микроорганизмов. Их пигментный состав хорошо согласуется со спектральным составом проходящего света. В морских бухтах и лагунах доминировали таксоны, обладающие красными пигментами: криптофитовые водоросли с фикоэритрином-545, либо пурпурные серные бактерии с каротиноидом океноном, либо коричнево-окрашенные зеленые серные бактерии с изорениератином и бактериохлорофиллом e. В озерах с пресным верхним слоем воды развивались одноклеточные водоросли либо зеленые серные бактерии с хлоробактином и бактериохлорофиллом d. Спектральный диапазон может служить селективным фактором, определяющим состав сообщества фототрофов соструктурно различными антеннами, но схожими спектрами поглощения света.

Исследована in vitro кинетика замедленной флуоресценции и фосфоресценции фотосенсибилизатора эритрозина во фрагментах нормальных тканей и злокачественных опухолей молочной железы пациенток онкологического диспансера. Показано, что кинетика замедленной флуоресценции красителя формируется как суперпозиция сигналов термоактивированной люминесценции и свечения, возникающего в результате синглет-триплетной аннигиляции молекул фотосенсибилизатора и синглетного кислорода. Обнаружено тушение аннигиляционной составляющей замедленной флуоресценции при возбуждении молекул серией из n импульсов с частотой 5–10 Гц. Форма кривой замедленной флуоресценции, интенсивность и длительность послесвечения молекул красителя определяются соотношением скоростей потребления/восстановления содержания кислорода в тканях. Установлена корреляция показателей замедленной флуоресценции с клинико-морфологическими характеристиками опухолей, обсуждается применение результатов в оптической экспресс-диагностике тканей.

Исследована слюна спортсменов с анаэробной (легкоатлеты) и аэробной (пловцы) физической нагрузкой. Слюна отобрана до (состояние физического покоя) и после тренировки. Определено, что физические нагрузки достоверно повышали концентрацию общего белка в слюне и водородный показатель (рН) слюны спортсменов. Активность каталазы в слюне достоверно повышена лишь после аэробной физической нагрузки в отличие от анаэробной. Биолюминесцентный показатель слюны достоверно повышен для спортсменов, занятых аэробной физической нагрузкой по сравнению с анаэробной. Значимое влияние на усиление светоизлучения в биолюминесцентной биферментной реакции способны оказывать такие биомаркеры слюны, как концентрация лактата и общего белка, активность каталазы, концентрация ионов кальция, калия, магния и содержание амидов группы IV. Содержание амидов группы IV и комплекса олигосахаридов, полисахаридов, фосфатазы, фосфолипидов в слюне спортсменов, занятых анаэробной физической нагрузкой, способны сильнее ингибировать биолюминесцентное свечение, чем концентрация триеновых конъюгатов и содержание амидов группы II в слюне спортсменов, занимающихся аэробной физической нагрузкой. Таким образом, в слюне спортсменов, занятых аэробной или анаэробной физической нагрузкой, выявлены значимые биомаркеры физиологического состояния организма, которые способны оказывать влияние на интегральный ответ биолюминесцентного ферментативного биотеста. Изменение интегрального биолюминесцентного показателя слюны в зависимости от вида физической нагрузки для спортсмена может быть использовано в спортивной медицине для профилактики физических перегрузок.

Фотобиология – это динамично развивающаяся область знаний и практической деятельности. Российское фотобиологическое общество содействует развитию творческой деятельности и коммуникации ученых и практиков в области фотобиологии и смежных дисциплин. В сентябре 2023 г. состоялся X Съезд Российского фотобиологического общества с конференцией «Современные проблемы фотобиологии». В статье приводятся определения фотобиологии, биофотоники, фотобиотехнологии, биолюминесценции. Описана краткая история Российского фотобиологического общества, а также обзор программы и результатов X съезда и конференции, включая резюме статей, подготовленных по материалам докладов на съезде, наиболее близкиx по своей тематике к биофизике.