Том 88, № 9 (2023)

Антитела к рецептор-связывающему домену спайкового белка SARS-CoV-2 (RBD S-белка) вносят большой вклад в гуморальный иммунный ответ при коронавирусной инфекции (COVID-19) и после вакцинации. Основное внимание при изучении эпитопного состава RBD сконцентрировано на эпитопах, узнаваемых вируснейтрализующими антителами. Роль антител, связывающихся с RBD, но не способных нейтрализовать вирус, в иммунном ответе остаётся невыясненной. С этой целью провели исследование свойств двух моноклональных антител мыши к RBD (RS17 и S11). Показано, что оба антитела являются высокоаффинными, но при этом они не нейтрализуют вирус. Методом пептидного фагового дисплея локализованы эпитопы этих антител: эпитоп, узнаваемый антителом RS17, расположен на N-концевом участке RBD (348-SVYAVNRKRIS-358); эпитоп, узнаваемый антителом S11, находится внутри рецептор-связывающего мотива RBD (452-YRLFRKSN-459). На наличие сывороточных антител, конкурирующих c ненейтрализующими антителами S11 и RS17, исследовали три группы сывороток: 1) от ранее не болевших вакцинированных добровольцев; 2) от людей, перенесших COVID-19 в лёгкой форме; 3) от людей, перенесших COVID-19 в тяжёлой форме. Показано, что антитела, конкурирующие с антителом S11, с одинаковой частотой встречаются в каждой из исследованных групп сывороток. В то же время наличие в сыворотках антител, конкурирующих с антителом RS17, ассоциировано с тяжестью течения COVID-19 и достоверно чаще встречается в группе сывороток, полученных от тяжелобольных пациентов. Таким образом, несмотря на несомненную значимость анти-RBD антител для формирования эффективного иммунного ответа к SARS-CoV-2, важно также оценивать их вируснейтрализующую активность и подтверждать отсутствие нежелательных свойств у получаемых анти-RBD антител после вакцинации.

Благодаря широкому распространению скрининга комбинаторных библиотек при помощи таких методов, как фаговый дисплей, стало возможным не только осуществлять разработки новых рекомбинантных антител, но и расширить арсенал белков, связывающих интересующие мишени, за счёт многих других полипептидных скаффолдов-каркасов, негомологичных иммуноглобулинам. Такие новые синтетические связывающие белки (ССБ) в настоящее время довольно разнообразны; к ним относятся монотела/аднектины, дарпины, липокалины/антикалины и многочисленные минипротеины (аффитела, кноттины) и другие структуры, используемые в качестве модулей для создания более сложных аффинных инструментов с потенциалом применения как в диагностике, так и в терапии. Удачные скаффолды должны иметь небольшую молекулярную массу, обладать низкой иммуногенностью, а также резистентностью к различным жёстким условиям, например, к протеолизу (то есть иметь перспективу перорального применения); предпочтительно сохранение работоспособности в восстановительных условиях внутриклеточной среды. Но главное - это устойчивость скаффолда к мутациям в значительном количестве позиций, что необходимо для создания области связывания мишени достаточного размера через приготовление библиотек и скрининг с последующей препаративной экспрессией в подходящей системе. Поэтому скаффолды с высокой термодинамической стабильностью в настоящее время особенно привлекательны для создания новых ССБ, которые уже постепенно входят в клиническую практику как антагонисты онкопротеинов в сигнальных каскадах. Настоящий обзор посвящён многообразию ССБ с особым вниманием к тем из них, которые ингибируют важнейший онкопротеин KRAS, разработка специфических ингибиторов против мутантов которого до недавнего времени была затруднена.

Полипептид, транспортирующий органические анионы, OATP1B1 - один из важнейших белков-транспортёров, опосредующий проникновение многих эндогенных веществ и ксенобиотиков в гепатоциты. Для оценки взаимодействия OATP1B1 с различными веществами необходима модельная система, обеспечивающая экспрессию функционального белка. На основе клеток НЕК293 была получена линия НЕК293-OATP1B1, стабильно экспрессирующая ген SLCO1B1, кодирующий транспортёр OATP1B1. Экспрессия гена SLCO1B1 была подтверждена с помощью ПЦР-анализа в реальном времени, а наличие белка - иммунохимически. Функциональность транспортёра была оценена по транспорту аторвастатина, являющегося субстратом OATP1B1. Полученная клеточная линия, селективно продуцирующая функционально активный рекомбинантный транспортёр OATP1B1, может быть использована для его изучения, а также для тестирования лекарственных веществ на принадлежность к субстратам, индукторам и ингибиторам OATP1B1 и оценки рисков межлекарственных взаимодействий.

Впервые установлена структура гена химозина (Хн) сибирской косули (Capreolus pygargus) и определена его экзон/интронная организация. Методом Golden Gate реконструирована и получена в виде ДНК-клона кодирующая часть гена Хн C. pygargus. Сравнительный анализ последовательностей прохимозинов (ПроХн) косули, коровы и одногорбого верблюда выявил ряд аминокислотных замен на участках, формирующих субстрат-связывающую полость фермента и затрагивающих субсайты специфичности S4 и S1′ + S3′. С использованием интеграционного вектора pIP1 сконструирована рекомбинантная плазмида pIP1-Cap для экспрессии гена ПроХн косули в клетках CHO-K1. Получен поликлон клеток CHO-K1-CYM-Cap, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного ПроХн в культуральную жидкость. В результате активации зимогена получен препарат рекомбинантного Хн косули с общей молокосвёртывающей активностью 468,4 ± 11,1 IMCU/мл (IMCU - International Milk Clotting Units, международные единицы молокосвертывающей активности). Выход рекомбинантного Хн косули составил 500 мг/л или ≈ 468 000 IMCU/л, что превышает показатели выхода генно-инженерных Хн в большинстве используемых систем экспрессии. Основные биохимические свойства полученного фермента сравнивали с коммерческими препаратами рекомбинантных Хн одногорбого верблюда (Camelus dromedarius) и коровы (Bos taurus). Удельная молоко-свёртывающая активность рекомбинантного Хн C. pygargus составила 938 ± 22 IMCU/мг белка и была сопоставима с показателями ферментов сравнения. Неспецифическая протеолитическая активность рекомбинантного Хн косули оказалась в 1,4-4,5 раза выше, чем у ферментов коровы и верблюда. По коагуляционной специфичности рекомбинантный Хн C. pygargus занимал промежуточное положение между генно-инженерными аналогами Хн B. taurus и C. dromedarius. Порог термостабильности рекомбинантного Хн косули был равен 55 °С. При 60 °С фермент сохранял < 1% от исходной молокосвёртывающей активности, а его полная термоинактивация наблюдалась при 65 °С.

Холера является опасным инфекционным заболеванием, вероятность заражения которым резко возрастает в условиях ограниченного доступа к чистой питьевой воде. Эффективным способом предотвращения холеры является применение вакцин. Одним из их компонентов может служить белок CtxB - β-субъединица холерного токсина. В настоящей работе мы создали генетическую систему для наработки рекомбинантного CtxB в клетках Escherichia coli и подобрали условия для синтеза и очистки целевого продукта на уровне лабораторной культуры. Установлено, что наиболее простым и эффективным способом выделения рекомбинантного белка является выращивание культуры E. coli на синтетической среде М9 с глицерином с последующей очисткой CtxB из среды культивирования методом металл-хелатной хроматографии. После 48-часовой индукции концентрация целевого продукта в среде может достигать значений 50 мг/литр, при этом белок сохраняет свою пентамерную структуру, что позволяет рассматривать созданную систему как перспективный инструмент промышленного синтеза рекомбинантного CtxB в медицинских и исследовательских целях.

Генетический токсин-антитоксиновый элемент hok/sok из плазмиды R1 Escherichia coli обеспечивает сегрегационную стабильность плазмид. Бактериальные клетки, потерявшие все копии плазмиды, кодирующей короткоживущий антитоксин, гибнут под действием долгоживущего токсина. Элемент hok/sok в составе векторных плазмид для бактериальной экспрессии может увеличивать продуктивное время биосинтеза рекомбинантных белков, замедляя накопление в популяции непродуцирующих клеток, лишенных целевой плазмиды. В настоящей работе были исследованы различные варианты расположения и ориентации элемента hok/sok в составе стандартной плазмиды pET28a с индуцибельным промотором T7lac и геном устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что элемент hok/sok сохраняет функциональную активность вне зависимости от расположения на плазмиде и ориентации, бактериальные клетки сохраняли плазмиды с hok/sok после 4-х дней культивирования без антибиотика и теряли контрольную плазмиду без данного элемента. На примере трех целевых белков - аспаргиназы E. coli тип II, гормона роста человека и нуклеопротеина вируса SARS-CoV-2 было продемонстрировано, что для цитоплазматических целевых белков максимальная продуктивность бактерий сохраняется только при расположении элемента hok/sok на плазмиде выше промотора целевого гена. В случае периплазматической локализации белка продуктивность бактерий уменьшается для всех вариантов расположения hok/sok при культивировании с антибиотиком, а при периодическом культивировании бактерий без антибиотика продуктивность лучше сохраняется также при расположении элемента hok/sok выше промотора целевого гена. Данный вариант векторной плазмиды pEHU позволяет увеличить биосинтез нерастворимого в цитоплазме бактерий гормона роста человека более, чем в 2 раза при культивировании бактерий без антибиотика, а также поддерживать биосинтез аспарагиназы при периодическом культивировании без антибиотика в течение 4-х дней на уровне не менее 10 мг/литр. Разработанный сегрегационно стабилизированный плазмидный вектор может быть использован для получения в клетках E. coli различных рекомбинантных белков без применения антибиотиков.

Цитохром CYP102A1 (P450 BM3) из Priestia megaterium (bas. Bacillus megaterium) имеет ряд уникальных функциональных особенностей, которые делают его идеальным объектом для направленной эволюции и других синтетических приложений. Ранее был получен мутант CYP102A1-LG23 с 14 мутациями в гем-связывающей части белка, осуществляющий 7β-гидроксилирование стероидных субстратов ряда андростанов с образованием продуктов, обладающих противовоспалительной и нейропротекторной активностью. В настоящем исследовании синтетический ген cyp102A1-LG23, кодирующий мутантный вариант P450 BM3, экспрессирован в клетках Mycolicibacterium smegmatis в составе моно- и бицистронных оперонов совместно с синтетическими генами gdh или zwf2, кодирующими глюкозодегидрогеназу (ГДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФД) соответственно. Показана функциональная активность рекомбинантных ферментов in vivo на примере гидроксилирования андрост-4-ен-3,17-диона (АД) до 7β-гидрокси-АД (7β-OH-AД) в растущих культурах миколицибактерий. Биокаталитическая активность увеличена вдвое за счет повышения растворимости белка CYP102A1-LG23 в клетке и организации дополнительной системы регенерации кофакторов путем введения ГДГ и Г6ФД. Максимальный выход 7β-OH-AД, составляющий 37,68% мольн., был достигнут коэкспрессией в M. smegmatis генов cyp102A1-LG23 и gdh. Результаты свидетельствуют о перспективности использования синтетических генов для получения рекомбинантных ферментов, расширяют представления о гидроксилировании стероидных соединений бактериальными цитохромами и могут быть востребованы для разработки методов микробиологического получения 7β-гидроксистероидов с помощью генетически модифицированных миколицибактерий.

Метилотрофные дрожжи Komagataella phaffii активно используются в биотехнологии для синтеза рекомбинантных белков. В связи с высокой практической значимостью этих дрожжей необычайно важным является тщательный подбор условий культивирования и оптимизация состава сред. В данной работе на уровне транскриптома было изучено влияние дефицита биотина на экспрессию генов у этих дрожжей. Было показано, что ответ клеток K. phaffii на недостаток биотина сильно зависит от источника углерода в среде. В средах, содержащих глицерин, дефицит биотина приводил к активации генов метаболизма биотина, глиоксилатного цикла и синтеза ацетил-CоА в цитоплазме, а также подавлению генов глюко- и липогенеза. В средах, содержащих метанол, дефицит биотина в первую очередь приводил к подавлению генов, вовлеченных в синтез белков, и активации ответа клетки на окислительный стресс.

Гепатоэнцефалопатия (ГЭ) как медицинский термин нервно-психического расстройства, развивающегося у пациентов с тяжелым нарушением функции печени, известна уже более века, однако патогенетические механизмы дисфункции головного мозга при заболеваниях печени до сих пор полностью не выяснены. Концептуально, основной причиной ГЭ является накопление аммиака в головном мозге вследствие нарушения детоксикационной функции печени или возникновения портосистемного шунта. Доказано, что токсическое действие аммиака опосредовано гиперактивацией глутаматных NMDA-рецепторов (NMDA-R) и распространяется на многие процессы аэробного метаболизма, обеспечивающего энергией мириады специфических функций и жизнеспособность нервных клеток. Недавнее открытие функциональных NMDA-R в эритроцитах и отклонения от нормы многих гематологических параметров, свидетельствующих о нарушении гемодинамики и снижении кислородтранспортной функции эритроцитов у большинства пациентов с ГЭ, указывали на наличие взаимосвязи между повреждением эритроцитов и дисфункцией мозга. Чтобы понять, как в условиях гипераммониемии (ГА) прогрессирование аэробного энергетического кризиса мозга приводит к энцефалопатии, необходимо определить вклад в эту патологию аммоний-индуцированного окислительного стресса в эритроцитах, приводящего к нарушению их кислородтранспортной функции. Для обнаружения вышеуказанного недостающего звена активность антиокислительных ферментов и концентрация GSH, GSSG и H₂O₂ были измерены в эритроцитах животных с ГА в присутствии неконкурентного антагониста NMDA-R, МК-801. Было выявлено, что аммиак, содержащийся в крови гипераммониемированных животных, накапливается в значительном количестве в эритроцитах крыс и делает эти клетки, лишенные аммиак-обезвреживающих ферментов, наиболее восприимчивыми к его прооксидантному действию, проявляющемуся по развитию окислительного стресса, показатели которого полностью или частично восстанавливаются МК-801. Полученные данные обеспечивают основу для выявления дополнительных факторов риска в развитии когнитивных нарушений и неблагоприятного прогноза, связанного с гипоперфузией у пациентов с повышенной концентрацией аммиака в крови.