Биохимия

Синтез алармонов (p)ppGpp (гуанозинтетрафосфата и гуанозинпентафосфата) вносит значительный вклад в процессы торможения метаболизма бактерий, контроля над скоростью их роста, вирулентности, бактериальной персистенции и формирования биоплёнок. Продукцию регуляторных молекул (p)ppGpp осуществляют бактериальные ферменты (p)ppGpp-синтетазы суперсемейства гомологов RelA/SpoT двух типов: длинные бифункциональные RSH-белки и малые алармонсинтетазы. В данной работе при помощи методов ферментативной кинетики и концентрационно-зависимого ингибирования исследуются детали механизма действия 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановой кислоты (ДМНП) в отношении белков Rel_Msm и RelZ, (p)ppGpp-синтетаз Mycolicibacterium smegmatis обоих типов, и белка Rel_Mtb Mycobacterium tuberculosis. Обнаружена способность соединения ДМНП подавлять активность белка Rel_Mtb. В соответствии с результатами исследований ферментативной кинетики ДМНП проявляет себя как неконкурентный ингибитор, действующий на белки Rel_Msm и RelZ. Анализ молекулярного докинга позволил определить вероятное место связывания ДМНП – вблизи активного сайта синтетазного домена (p)ppGpp-синтетаз. Исследование вносит вклад в разработку нового класса соединений ингибиторов алармонсинтетаз, к которым относится релацин и его производные, а также изучаемое соединение ДМНП – синтетический аналог метаболита морских кораллов эрогоргиаена. В отличие от традиционных антибиотиков, ингибиторы алармонсинтетаз оказывают влияние на метаболические пути, связанные со строгим ответом. Хотя эти пути не являются ключевыми для бактерий, они регулируют формирование адаптационных механизмов. Сочетание традиционных антибиотиков, действующих на растущие клетки, и новых соединений, блокирующих адаптацию микроорганизмов, потенциально способно решить актуальные проблемы резистентности к антибиотикам и бактериальной персистенции.

Ионные жидкости (ИЖ) – органические соли с низкой температурой плавления, которая обусловлена тем, что боковые алкильные цепи, химически связанные с ионом, затрудняют кристаллизацию ИЖ. Низкая температура плавления ИЖ привела к их широкому использованию в качестве относительно безвредных растворителей. Однако ИЖ обладают токсическими свойствами, механизм которых в значительной степени неизвестен, поэтому идентификация клеточных мишеней ИЖ имеет практическое значение. В работе мы показали, что имидазолиевые ИЖ не способны проникать через модельные мембраны, не повреждая их. Мы также обнаружили, что инактивация помп множественной лекарственной устойчивости в клетках дрожжей не увеличивает их чувствительность к имидазолиевым ИЖ. Последнее указывает, что мишень токсичности имидазолиевых ИЖ находится не в цитоплазме. Таким образом, можно предположить, что нарушение барьерных свойств плазматической мембраны является основной причиной токсичности небольших концентраций имидазолиевых ИЖ. Мы также показали, что добавки имидазолиевых ИЖ восстанавливают рост клеток с кинетически заблокированным гликолизом. По-видимому, вызванное ИЖ небольшое нарушение плазматической мембраны в некоторых случаях может быть полезным для клетки.

Фокальные контакты (ФК) – это механосенсорные структуры, которые способны преобразовывать физические стимулы в химические сигналы, управляющие миграцией клеток. Существует корреляция между параметрами ФК и показателями клеточной подвижности для отдельных мигрирующих клеток. Однако какие именно параметры ФК являются критическими для движения эпителиальных клеток в составе монослоя, остаётся неизвестным. Мы использовали прижизненную съёмку клеток для описания взаимосвязи между параметрами ФК и миграцией иммортализованных эпителиальных кератиноцитов (HaCaT) и клеток карциномы лёгкого (A549) в условиях ингибирования или подавления транскрипции белков ФК винкулина и киназы фокальной адгезии (FAK). Чтобы оценить взаимосвязь между морфологией ФК и миграцией клеток, мы использовали субстраты разной эластичности в модели зарастания экспериментальной раны. ФК с максимальной площадью и максимальная скорость миграции в рану, а также высокий уровень экспрессии мРНК FAK и винкулина были показаны для клеток на фибронектине, тогда как минимальная площадь ФК и замедление скорости миграции в рану были характерны для клеток на стекле. Как в нормальных, так и в опухолевых клетках подавление экспрессии винкулина приводило к уменьшению размера ФК и интенсивности их флуоресценции, однако не влияло на скорость миграции клеток внутрь раны. Подавление экспрессии или ингибирование активности FAK не влияло на размер ФК, однако снижало время жизни ФК и значительно замедляло скорость миграции клеток внутрь раны как в клетках HaCaT, так и в A549. Наши данные показывают, что определяющим параметром для миграции эпителиальных клеток в составе монослоя является время жизни ФК. Показанное влияние киназы FAK на скорость миграции клеток в составе монослоя делает FAK многообещающей мишенью для противоопухолевой терапии аденокарциномы лёгких.

Известно, что некоторые трициклические антидепрессанты (ТЦА), включая амитриптилин (ATL), кломипрамин (CLO) и дезипрамин (DES), эффективны для купирования нейропатической боли. Ранее было установлено, что ATL, CLO и DES способны потенциал-зависимо блокировать трансмембранные глутаматные NMDA-рецепторы (NMDAR), играющие ключевую роль в патогенезе нейропатической боли. Несмотря на схожую структуру, ATL, CLO и DES взаимодействуют с NMDAR с разной эффективностью. Цель представленного исследования – методами компьютерного моделирования изучить связывание ATL, CLO и DES с NMDAR и выявить структурные особенности препаратов, определяющие их ингибиторную активность по отношению к NMDAR. Был проведен молекулярный докинг исследуемых ТЦА в канал NMDAR, методом молекулярной динамики (МД) рассчитаны конформационные изменения полученных комплексов в липидном бислое. Внутри канала NMDAR выявлен один сайт для связывания третичных аминов ATL и CLO (верхний) и два сайта для вторичного амина DES (верхний и нижний), расположенных вдоль оси канала на разном расстоянии от внеклеточной стороны мембраны. Методом МД установлено, что положение DES в нижнем сайте стабилизируется только в присутствии катиона натрия внутри канала NMDAR. За счет одновременного взаимодействия двух атомов водорода своей катионной группы с аминокислотными остатками аспарагина в ионной поре DES прочнее связывается с NMDAR, по сравнению с ATL и CLO, чем могут быть обусловлены его более сильные побочные эффекты. Выдвинуто предположение, что ATL менее эффективно связывается с NMDAR, по сравнению с DES и CLO, из-за меньшей конформационной подвижности. Выявленные особенности структурно- и катион-зависимого механизма взаимодействия ТЦА с NMDAR помогут дальнейшей разработке эффективной и безопасной противоболевой терапии.

В исследовании выполнен анализ содержания гомоцистеина, цианокобаламина (витамина В12), фолиевой кислоты (витамина В9) и пиридоксина (витамина В6) в крови у детей с подтверждённым демиелинизирующим поражением ЦНС. Определены генотипы по основным полиморфизмам генов фолатного цикла – C677T и A1298C гена MTHFR, A2756G гена MTR и A66G гена MTRR. Сравнение исследуемых показателей проводили для пяти групп: контрольная группа – здоровые дети до 18 лет, дети в стадии дебюта рассеянного склероза (РС; с длительностью заболевания не более полугода), здоровые взрослые без неврологической патологии, взрослые пациенты с РС в стадии дебюта заболевания и пациенты с длительно протекающим РС. Выявлено значимое увеличение содержания гомоцистеина у детей в дебюте РС в сравнении со здоровыми детьми соответствующего возраста. Установлена высокая прогностическая ценность определения содержания гомоцистеина у детей. Продемонстрировано, что повышение уровня гомоцистеина выше безопасных значений не сопровождается наличием витаминодефицитного состояния, оцениваемого по содержанию фолиевой кислоты, витамина В6 и витамина В12 в крови. Отсутствие корреляции между лабораторными признаками витаминодефицитного состояния и содержанием гомоцистеина может быть обусловлено носительством полиморфных вариантов генов фолатного цикла, а повышение уровня гомоцистеина должно рассматриваться как маркер функциональных нарушений обмена фолатов, сопутствующих развитию патологического процесса при педиатрическом варианте РС. Выявленные закономерности могут быть использованы для разработки методов лечения и профилактики демиелинизирующего процесса у детей с РС.