Том 50, № 3 (2024)

На сегодняшний день морские многощетинковые черви или полихеты остаются малоизученным классом беспозвоночных животных с точки зрения выяснения особенностей функционирования их иммунной системы и, в частности, биоразнообразия антимикробных пептидов (АМП), играющих ключевую роль в защите организма-хозяина от окружающих патогенов и регулирующих видовой состав симбиотических микроорганизмов. Изучение биосинтеза защитных АМП у полихет выявило интересную закономерность, а именно наличие так называемого BRICHOS-домена в составе белков-предшественников целого ряда таких пептидов. Консервативная структура этого домена позволяет проводить биоинформатический поиск предшественников АМП в транскриптомах полихет. В данной работе нами был обнаружен и исследован новый BRICHOS-ассоциированный АМП из пескожила Arenicola marina, представляющий не выявленное ранее у морских червей структурное семейство дефенсин-подобных пептидов, стабилизированных четырьмя дисульфидными связями. Пептид, содержащий 44 а.о. и названный нами AmBRI-44a, был получен путем гетерологической экспрессии в бактериальной системе Escherichia coli. Показано, что AmBRI-44a обладает специфической активностью в отношении узкого спектра грамположительных бактерий и не проявляет выраженного цитотоксического действия на эукариотические клетки линии HEK293T. Генетический и фенотипический анализ отобранных бактерий Bacillus licheniformis B-511, устойчивых к AmBRI-44a, указывает на возможный механизм антибактериального действия пептида, связанный с ингибированием биосинтеза клеточной стенки бактерий. Полученные результаты позволяют рассматривать новый АМП AmBRI-44a в качестве кандидатного соединения для создания антибиотического средства, которое потенциально может быть эффективным при лечении инфекционных заболеваний, опосредованных грамположительными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.

Гибридные гены и транскрипты могут являться маркерами и быть причинами развития опухоли за счет дополнительной функциональности получающихся генных продуктов. Современные алгоритмы и методы высокопроизводительного секвенирования, позволяющие детектировать гибридные гены, развиваются как взаимно дополняющие ключи к разгадке вопроса возникновения и диагностики опухоли, а также к фундаментальному вопросу возникновения гибридов и их влияния на молекулярные процессы. Разработаны десятки алгоритмов для детектирования гибридных генов, отличающиеся скоростью, чувствительностью и специфичностью, а также ориентированные на определенный дизайн эксперимента. В зависимости от длины прочтения (50–300 п.н. – короткие прочтения, 5000–100 000 п.н. – длинные прочтения) существуют три типа алгоритмов: работающие только с короткими, только с длинными прочтениями или совмещающие возможности обоих подходов. Кроме того, сами программы разделяют на: 1) программы-картировщики на геном/транскриптом, которые осуществляют поиск прочтений по ряду признаков, например, поиск таких прочтений, которые картируются одновременно на экзоны разных генов и, тем самым, подтверждают наличие гибрида в образце (STAR-Fusion, Arriba); 2) программы-сборщики генома/транскриптома de novo с последующим отбором гибридных транскриптов (Fusion-Bloom); 3) программы, использующие “псевдовыравнивание” (Kallisto&Pizzly), когда реального картирования не происходит, а идет сравнение предварительно вычисленного индекса для подпоследовательности транскрипта с индексом, вычисляемым для подпоследовательности конкретного прочтения. В данном обзоре рассмотрены основные классы имеющихся программных инструментов для детектирования гибридных генов, приведены характеристики этих программ, их достоинства и недостатки. Наиболее ресурсоемкими и медленными на сегодняшний момент по-прежнему остаются алгоритмы, осуществляющие сборку генома, их опережают алгоритмы-картировщики. Наиболее быстрыми и сберегающими компьютерные ресурсы являются алгоритмы, осуществляющие псевдовыравнивание, что снижает качество выравнивания в целом.

Ранозаживление – сложный процесс, основанный на регуляции пролиферации и миграции клеток эпителия. Хронически незаживающие раны характеризуются повышенной пролиферацией и отсутствием миграции клеток эпидермиса. Секретируемый белок человека SLURP-2 регулирует рост и дифференцировку эпителиальных клеток. Ранее было показано, что мишенью действия SLURP-2 являются различные типы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR), а также мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, участвующие в регуляции гомеостаза эпителиальных клеток. В данной работе мы обнаружили, что показанное ранее ускорение миграции кератиноцитов под действием белка SLURP-2 обусловлено его взаимодействием с nAChR α7-типа. С помощью аланин-сканирующего мутагенеза мы показали, что мутация R20A молекулы SLURP-2 увеличивает ингибирующую активность SLURP-2 по отношению к α7-nAChR и приводит к еще большей стимуляции миграции кератиноцитов Het-1A и при этом, в отличие от SLURP-2, не стимулирует, а подавляет пролиферацию клеток Het-1A. В то же время другие мутации SLURP-2 приводят одновременно к ингибированию α7-nAChR, пролиферации и миграции кератиноцитов. Таким образом, была получена новая информация о локализации участков молекулы SLURP-2, замена которых может приводить к направленному изменению биологической активности SLURP-2. Дальнейшие исследования возможности регуляции активности SLURP-2 и создание на его основе препаратов направленного действия могут быть полезны для разработки новых лекарств, стимулирующих ранозаживление.

Зиксин – консервативный механочувствительный LIM-доменный белок, регулирующий сборку F-актиновых филаментов в клеточных контактах. В то же время при механических воздействиях на клетки он может перемещаться из фокальных адгезий к стресс-фибриллам и в ядро, где оказывает влияние на генную экспрессию. С использованием метода вестерн-блоттинга и антител к N-концевой и С-концевой областям зиксина мы обнаружили, что в клетках эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus laevis этот белок представлен двумя полноразмерными и двумя короткими изоформами. Определена внутриклеточная локализация этих изоформ и их количество в зависимости от стадии развития эмбрионов. Показано, что полноразмерные формы с различной электорофоретической подвижностью отличаются по локализации в клетке, а самая короткая изоформа, содержащая LIM-домены, стабильна в ходе развития, преимущественно находится в ядре и может участвовать в регуляции экспрессии генов. Впервые полученные данные об изоформах зиксина, их стабильности и распределении между ядром и цитоплазмой представляют большой интерес для изучения функций LIM-доменных белков-механотрансдукторов в процессах взаимного влияния морфогенеза и дифференцировки на ранних этапах развития позвоночных.

Сконструированы гены гибридных белков, включающих протеородопсин Exiguobacterium sibiricum (ESR) и различные N-концевые растворимые домены. Эффективный синтез в клетках Escherichia coli наблюдался только в случае гибридов с шапероном Caf1M и мальтозосвязывающим белком MBP, экспрессируемых в виде предшественников с собственными сигнальными последовательностями. Изучение выделенного белка MBP-ESR в составе мицелл и протеолипосом продемонстрировало формирование и распад основных интермедиатов фотоцикла при рН > 8. Фотоэлектрический ответ гибридных белков Caf-ESR и MBP-ESR сопоставим по амплитуде с ответом ESR дикого типа, что указывает на их гомогенную ориентацию в мембране протеолипосом. Полученные конструкции могут быть использованы для создания систем бактериальной экспрессии различных ретинальных белков, обеспечивающих их единообразное встраивание в протеолипосомы.

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) с негативным контрастированием препаратов раствором уранилацетата была использована для изучения морфологических различий между почвенными гуминовыми кислотами (ГК) и их фракциями A, B и C + D, полученными сочетанием препаративной эксклюзивной хроматографии низкого давления и аналитического электрофореза в полиакриламидном геле. Электрофоретическая подвижность фракций изменялась в порядке C + D > B > A. Анализ распределения различных морфологических элементов между фракциями показал, что крупные структуры типа везикулоподобных образований длиной 70–150 нм и шириной 30–80 нм с четкими краями были обнаружены исключительно во фракции A и занимали ~55% площади ПЭМ-изображений. С другой стороны, длинные фибриллы длиной 60–100 нм, шириной 4–6 нм и толщиной 2–3 нм, а также их пучки длиной >150 нм и диаметром 30–70 нм были идентифицированы только во фракции C + D и занимали ~59% площади ПЭМ-изображений. Более мелкие морфологические элементы, такие как точечные частицы диаметром 2–3 нм, кольцевые частицы диаметром 4–6 нм, червеподобные короткие частицы длиной 20–30 нм и сфероиды диаметром 10–30 нм, наблюдали во всех образцах, но в различном количестве. Значительные морфологические различия между фракциями могут быть объяснены их составом, установленным ранее с помощью комплекса физико-химических методов. Отношение C_аром(165–108 м.д.)/C_алиф(10–0 м.д.), или индекс ароматичности, рассчитанный на основании ¹³С-ЯМР, является одним из вероятных показателей формирования различных морфологических структур. Полученные результаты дают визуальное представление о морфологических особенностях почвенных ГК и фракций, доказывая их супрамолекулярную организацию.

Методом молекулярной динамики установлена пространственная организация DiB3-F53L/F74L/L129M – тройного мутанта флуоресцентного нековалентного комплекса генно-инженерного варианта бактериального белка липокалина Blc с синтетическим GFP-подобным хромофором M739. Установлено, что область связывания хромофора в исследуемом комплексе близка к DiB1 и отличается от альтернативной области в DiB3. Данный комплекс отличается повышенной яркостью флуоресценции по сравнению с комплексами хромофора с другими генно-инженерными вариантами липокалина, что выдвигает его в число перспективных маркеров биологических объектов в клеточной биологии.