The 3.6 Å cryo-em structure of the outer heptameric α-ring of human 26s immunoproteasome in the preactivation state

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The 26S proteasome is a unique multicatalytic proteinase complex, together with a ubiquitination system, providing controlled degradation of most intracellular eukaryotic proteins. The problem of studying the proteasome is the multiplicity of its intracellular forms, which are formed due to the modularity of the proteasome assembly process. In this study, using cryoelectron microscopy, we described for the first time the structure of the 26S human immunoproteasome in comparison with its constitutive form with a resolution of 3.6 Å. A detailed analysis of the structural features of the two complexes revealed the opening of the entrance in the outer heptameric 20S ring of the immunoproteasome subunit due to the separation of the N-terminal regions of the PSMA4 and PSMA5 subunits and the formation of a π–π stacking between the amino acid residues Tyr5 and Phe9 of the PSMA5 and PSMA6 subunits, respectively. The revealed removal of steric obstruction in the central channel of the 20S subunit may indicate the preactivation phenotype of the 26S human immunoproteasome, even in the absence of a bound substrate.

Full Text

Сокращения: c26S – 26S конститутивная протеасома; i26S – 26S иммунопротеасома; IFNγ – интерферон гамма; Ub – убиквитин; крио-ЭМ – криоэлектронная микроскопия.

ВВЕДЕНИЕ

Убиквитин-протеасомная система, представленная более чем тысячей белков в геноме млекопитающих, участвует во всех критических внутриклеточных процессах, таких как дифференцировка, репарация ДНК, апоптоз, аутофагия, регуляция клеточного цикла, контроль качества белка, контроль транскрипции и генерация пептидов, ассоциированных с комплексом гистосовместимости I класса [1]. Прежде чем произойдет деградация, опосредованная протеасомой, большинству белков необходимо быть ковалентно помеченными цепью в среднем из шести молекул убиквитина (Ub), что происходит благодаря каскаду убиквитин-лигаз [2]. Как правило, ε-аминогруппа лизина в полипептидной последовательности субстрата образует изопептидную связь с С-концевой карбоксильной группой аминокислотного остатка Gly76 проксимального Ub. Дальнейшая элонгация полиубиквитиновой цепи системой убиквитинирования осуществляется путем конъюгации следующей молекулы Ub с аминогруппой бокового радикала аминокислотного остатка Lys48 предыдущего Ub [3]. Открытие АТФ-зависимой системы убиквитинирования [4] было в дальнейшем комплементарно дополнено обнаружением мультикаталитического протеиназного комплекса массой 2.5 МДа, названного 26S протеасомой [5]. Дальнейшие исследования показали, что 26S протеасома содержит сложно организованную 19S регуляторную субчастицу [6], накрывающую торец 20S каталитической субчастицы, которая отвечает за распознавание [7], разворачивание [8], деубиквитинирование [9] субстрата и его транслокацию в каталитическую камеру [10].

Так называемое “каталитическое ядро” или “коровая” 20S субчастица представляет собой цилиндр, состоящий из четырех гептамерных колец – двух внешних α- и двух внутренних β-колец [11]. Из семи β-субъединиц только три – β1, β2 и β5 – обладают каталитической активностью. У челюстных позвоночных животных, включая млекопитающих, конститутивные каталитические субъединицы β1, β2 и β5 под действием IFNγ заменяются на β1i, β2i и β5i, что приводит к образованию так называемой иммунопротеасомы. Иммунопротеасома теряет активность по типу каспазы, при этом по сравнению со стандартной протеасомой усиливается трипсиноподобная и химотрипсиноподобная активность. Набор антигенных пептидов, образующихся при действии иммунопротеасомы, отличается от набора пептидов, формирующегося за счет конститутивной протеасомы [12, 13]. Из-за разницы в субстратной специфичности между конститутивной протеасомой и иммунопротеасомой антигенные пептиды, имеющие гидрофобный C-конец и вследствие этого больше подходящие по структуре для загрузки на молекулы главного комплекса гистосовместимости I класса, производятся главным образом иммунопротеасомой [14].

19S регуляторная субчастица (RP – regulatory particle, также известная как PA700 – proteasome activator 700) состоит из 19 различающихся между собой белковых субъединиц и подразделяется на “основание” (base) и “крышку” (lid). Нижний (базовый) элемент состоит из регуляторных частиц трипл-A (regulatory particle triple-A ATPase, Rpt), обладающих АТФазной активностью, и регуляторных частиц Rpn1, Rpn2, Rpn10 и Rpn13, не являющихся АТФазами (Regulatory Particle, Non-ATPase-like, Rpn) [11]. Субъединицы Rpn10 [7], Rpn13 [15] и, как показано недавно, Rpn1 [16] являются рецепторами полиубиквитиновой цепи. Верхний элемент состоит из девяти не-АТФазных субъединиц: Rpn3, 5–9, 11–12 и Rpn11, осуществляющей деубиквитинилирование субстрата.

На настоящий момент удалось изучить и описать молекулярный механизм, который лежит в основе гидролиза полиубиквитинилированных субстратов протеасомой [17]. На первом этапе субстрат связывается посредством полиубиквитиновой цепи с UIM-доменами в составе убиквитиновых рецепторов регуляторной субчастицы протеасомы. Далее неструктурированный участок субстрата взаимодействует с верхними элементами субъединиц АТФазного кольца. Каскадный гидролиз АТФ в субъединицах Rpt1–6 приводит к перестройке АТФазного кольца в новую конфигурацию, вызывая уширение и выравнивание центрального канала, ведущего в протеолитическую полость 20S субчастицы. Одновременно с этим Rpn11 смещается в центральное положение непосредственно над входом в протеолитическую полость, благодаря чему активный сайт деубиквитиназы получает возможность отделить полиубиквитиновую цепь от субстрата по мере его транслокации. Недавно опубликованные данные свидетельствуют о ключевом значении аминокислотных остатков тирозина в составе Rpt-субъединиц, которые формируют спиральную опоясывающую структуру вокруг транслоцируемой полипептидной цепи субстрата [10]. Каскадный гидролиз молекул АТФ в Rpt-субъединицах приводит к их кооперативному смещению вниз, которое, в свою очередь, поступательно проталкивает полипептидную цепь субстрата в протеолитическую субчастицу.

Цель настоящей работы – методом криоэлектронной микроскопии впервые получить структуру 26S иммунопротеасомы человека с разрешением 3.6 Å и осуществить сравнительный анализ данной структуры с 26S протеасомой конститутивного фенотипа в том же разрешении.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и обработка данных криоэлектронной микроскопии препаратов 26S конститутивной протеасомы и 26S иммунопротеасомы. В результате распознавания частиц из экспериментальных данных криоэлектронной микроскопии был получен массив из 239 705 и 146 134 проекций для конститутивной и иммунной форм 26S протеасомных субчастиц соответственно. Полученные проекции импортировали в cryoSPARC (версия 4.2.1) [18] для дальнейшей обработки и анализа. С помощью нескольких последовательных раундов двумерной классификации (2D classification) были исключены ложноположительные проекции, а также загрязнения образца различного рода, попавшие в выборку.

Финальный результат классификации, вместе с характерными исходными усредненными изображениями, приведен на рис. 1. Поскольку данные представляют собой смесь из 20S, 26S и 30S протеасомных субчастиц, с помощью процедуры ab-initio реконструкции (Ab-Initio Reconstruction) было получено предварительное разбиение выборок на три структурные группы и соответствующие начальные модели низкого разрешения (12 Å). Далее с помощью процедуры гетерогенного уточнения (Heterogeneous Refinement), используя только коровую 20S часть в качестве начальной модели, выборки были классифицированы с большей точностью, при этом выравнивание карт трех различных структурных модификаций протеасомы было выполнено по общей центральной 20S субчастице (рис. 2). Сходимость неоднородного уточнения (Non-uniform Refinement) [19] карт для 26S субчастиц вместе с локальной коррекцией дефокусировки для каждой проекции (Local CTF Refinement) и уточнением аберраций более высоких порядков (Global CTF Refinement) не было ограничено пространственной частотой Найквиста при данном физическом размере пикселя (разрешение ограничено 3.6 Å) и достигло 3.9 Å в области 20S, оцененное в соответствии со стандартным пороговым критерием FSC = 0.143 (здесь и далее) для функции корреляции (Fourier Shell Correlation, FSC) между двумя картами (half-maps), независимо реконструированными в соответствии со случайным разбиением исходного массива на две равные подвыборки проекций [20, 21]. Далее 81 714 и 45 782 проекций 26S субъединицы конститутивной и иммунной протеасомы соответственно вместе с необходимыми метаданными (координаты проекций и относительные сдвиги изображений в стеке, найденные в процессе предобработки) экспортировали в RELION (версия 4.0.1) для оценки траекторий движения частиц, вызванного взаимодействием пучка электронов с образцом, с помощью метода на основе регрессии гауссовского процесса (Bayesian polishing) [22], который позволяет с большей точностью корректировать локальные смещения частиц, возникающие в процессе детектирования изображения.

 

Рис. 1. (a) – Характерное исходное крио-ЭМ-изображение протеасомных субчастиц конститутивной (c26S) и иммунной (i26S) формы; (б) – результат двумерной классификации исходного набора проекций; (в) – подвыборки проекций 26S протеасомных субчастиц.

 

Рис. 2. Результат гетерогенного уточнения (Heterogeneous Refinement) в случае конститутивной с26S (а) и иммунной i26S (б) форм протеасомы. Показаны ортогональные срезы крио-ЭМ-карт вдоль трех осей для трех структурных организаций протеасомных субчастиц. Указаны абсолютные количества соответствующих проекций в выборке данных после двумерной классификации.

 

Данный подход позволил получить карты с разрешением 3.7 Å в случае глобального уточнения (выравнивание по коровой 20S субчастице) и 4.5 Å в случае локального уточнения (Local refinement) для подвижной 19S регуляторной субчастицы с вычитанием сигнала 20S субчастицы. Для локального уточнения коровой 20S субчастицы уточнение достигло максимального разрешения 3.6 Å для данного физического размера пикселя. Для описания непрерывной конформационной динамики 19S в составе 26S протеасомы был применен новый метод уточнения (3D Flexible Refinement) [23], позволяющий с помощью генеративного моделирования параметризовать подвижность на уровне вторичной структуры в виде скрытых переменных. Результаты глобального уточнения использовали в качестве усредненной по всем конформациям консенсус-карты и подавали на вход процедуры, пространство скрытых переменных было ограничено двумя измерениями, все прочие параметры были выбраны по умолчанию.

Разрешение полученных карт составило 3.6 Å (для наиболее стабильных областей), разрешение в области 19S значительно улучшено относительно глобального уточнения. Корреляционные кривые FSC для четырех полученных криоЭМ-изображений в каждом из двух экспериментов показаны на рис. 3. Для всех карт выполнена оценка локального разрешения (рис. 4) с помощью реализованной в cryoSPARC стандартной процедуры, аналогичной алгоритму Blocres [24], локальная фильтрация, а также проведена постобработка с помощью алгоритма DeepEMhancer [25], что позволило качественно повысить интерпретируемость карт в областях высокой подвижности. Карты электронных плотностей депонированы в базу данных EMDB (Electron Microscopy Data Bank) под референсными номерами EMD-19571 и EMD-19572.

 

Рис. 3. Корреляционные кривые (Fourier Shell Correlation, FSC) в случае конститутивной c26S (а) и иммунной i26S (б) форм протеасомной субчастицы. Показаны кривые для локального уточнения 19S субчастицы (19S local, синий), локального уточнения коровой 20S субчастицы (20S local, оранжевый), глобального уточнения 26S субчастицы с выравниванием относительно 20S (26S global, зеленый) и уточнения с помощью метода 3D Flexible Refinement (26S 3Dflex, красный). Пунктирными линиями показаны два стандартных пороговых значения корреляций 0.5 и 0.143.

 

Рис. 4. Результат анализа локального разрешения в случае конститутивной c26S (а) и иммунной i26S (б) форм протеасомной субчастицы, а также распределение проекций 26S в соответствии с найденными угловыми ориентациями. Для визуализации локального разрешения использованы крио-ЭМ-карты, полученные с помощью 3D Flexible Refinement и дополнительно обработанные с помощью DeepEMhancer. Показаны боковой вид, центральный срез и вид сверху.

 

Анализ особенностей структурной организации 26S иммунопротеасомы человека. В настоящей работе нами были получены структуры 26S протеасомы человека в конститутивной и иммунной формах с разрешением 3.6 Å. Сравнительный анализ общей структуры двух комплексов не выявил значимых различий с референсной структурой 26S протеасомы человека [26] (рис. 5). Анализ электронной плотности в субстрат-связывающих карманах гексамерного АТФазного кольца подтвердил наличие всех шести молекул АТФ в связанном состоянии в обоих комплексах (рис. 6а), а также заякоривание HbYX-мотивов субъединиц Rpt3 и Rpt6 в гидрофобные полости гептамерного α-кольца (рис. 6б). В иммунопротеасоме конститутивные каталитические субъединицы β1, β2 и β5 под действием IFNγ заменяются на β1i, β2i и β5i. Мы подтвердили наличие иммуносубъединиц в протеасоме, выделенной из клеток HeLa, предварительно обработанных IFNγ, на основании изменения электронной плотности (рис. 6в) в положениях характеристических аминокислотных остатков протеасомы иммунного фенотипа [27].

 

Рис. 5. Сравнительный анализ глобальной структуры 26S протеасомы человека в конститутивной (c26S) и иммунной (i26S) формах. Структура 26S протеасомы человека PDB 5GJR дана в качестве референса.

 

Рис. 6. (а) – Анализ электронной плотности в субстрат-связывающих карманах гексамерного АТФазного кольца; (б) – заякоривание HbYX-мотивов субъединиц Rpt3 и Rpt6 в гидрофобные полости гептамерного α-кольца; (в) – присутствие иммуносубъединиц в протеасоме, изолированной из клеток HeLa, предварительно обработанных IFNγ, на основании изменения электронной плотности в положениях характеристических аминокислотных остатков протеасомы иммунного фенотипа.

 

Сравнительный анализ проксимального (непосредственно взаимодействующего с 19S регуляторной субчастицей) и аксиального (удаленного) гептамерного α-кольца выявил кооперативный сдвиг N-концевых областей α-субъединиц в структуре иммунопротеасомы в сравнении с протеасомой конститутивного фенотипа (рис. 7). N-Концевые фрагменты субъединиц PSMA1, PSMA4 и PSMA6 поступательно сместились в направлении субъединицы PSMA2. Визуализация электронной плотности проксимального α-кольца в области входа во внутреннюю камеру каталитической 20S субчастицы выявила снижение стерической затрудненности в центральном канале иммунопротеасомы в сравнении с конститутивной формой (рис. 8а). Подобный эффект вызван разобщением системы ионных связей, наблюдаемой в случае конститутивной протеасомы, между аминокислотными остатками Arg5 субъединицы PSMA7 и аспартатом субъединицы PSMA5 в положении 9, Arg10 субъединицы PSMA5 и Asp7 субъединицы PSMA1, а также аспарагина субъединицы PSMA1 в положении 8 и Arg3 субъединицы PSMA4 в структуре иммунопротеасомы (рис. 8б). При этом наблюдаемый сдвиг N-концевых последовательностей субъединиц PSMA способствует образованию π-π-укладки между остатками Tyr5 и Phe9 субъединиц PSMA4 и PSMA6 соответственно, что, в свою очередь, фиксирует их N-концевые фрагменты в удалении от центрального канала (рис. 8в).

 

Рис. 7. Сравнительный анализ проксимального (непосредственно взаимодействующего с 19S регуляторной субчастицей) и аксиального (удаленного) гептамерного α-кольца (а) N-концевых областей α-субъединиц в структуре иммунопротеасомы в сравнении с протеасомой конститутивного фенотипа (б); (в) – кооперативный сдвиг N-концевых фрагментов субъединиц PSMA1, PSMA4 и PSMA6 в направлении субъединицы PSMA2.

 

Рис. 8. (а) – Визуализация электронной плотности проксимального α-кольца в области входа во внутреннюю камеру каталитической 20S субчастицы; (б) – разобщение системы ионных связей, наблюдаемой в случае конститутивной протеасомы, между аминокислотными остатками Arg5 PSMA7 и Asp9 PSMA5, Arg10 PSMA5 и Asp7 PSMA1, а также Asn8 PSMA1 и Arg3 PSMA4 в структуре иммунопротеасомы; (в) – образование π-π-укладки между остатками Tyr5 и Phe9 субъединиц PSMA4 и PSMA6.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение и очистка препаратов протеасомы с различным каталитическим фенотипом. Клетки HeLa (аденокарцинома шейки матки человека) были получены из исследовательского центра “Коллекция культур клеток позвоночных” Института цитологии РАН. Клеточные линии млекопитающих культивировали в среде DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США). В среду добавляли 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% антибиотика-антимикотика (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США). Клеточные линии культивировали в инкубаторе с постоянным увлажнением при 37°C и 5% CO2. Все клеточные культуры рутинно тестировали на наличие микоплазмы при помощи набора MycoReport (Евроген, Россия) согласно инструкции производителя. Получение стабильных клеточных линий HeLa, сверхэкспрессирующих субъединицу протеасомы человека PSMD14 с тегом HTBH, а также выделение препаратов протеасомы проводили согласно ранее опубликованной методике [28]. Для индукции экспрессии иммуносубъединиц клетки HeLa перед выделением протеасомы обрабатывали IFNγ (Фармаклон, Россия) в дозировке 400 U/мл и инкубировали в течение 96 ч.

Подготовка образцов для крио-ЭМ. Для подготовки образцов для крио-ЭМ использовали медные сетки Quantifoil R1.2/1.3 400 mesh (Lot #211014, Quantifoil Micro Tools GmbH, Германия), имеющие основную углеродную подложку толщиной 10–12 нм с массивом регулярных отверстий диаметром 1.2 мкм и периодом 2.5 мкм, а также тонкую (толщина < 1 нм) подложку из оксида графена, нанесенную сверху. Перед использованием сетки хранили в вакуумном эксикаторе при комнатной температуре и давлении 0.9 МПа, что обеспечивает достаточную гидрофильность поверхности подложки. Чтобы сохранить целостность подложки и исключить дополнительное влияние на ориентацию частиц при взаимодействии с поверхностью подложки, сетки не были предварительно обработаны в тлеющем разряде. Подготовленные препараты 26S протеасомных субчастиц с концентрацией 0.9 мг/мл и объемом 3 мкл в буфере 30 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl2, 1 мM ATP, 1 мM TCEP наносили на сетки в камере установки для витрификации Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, США) при следующих параметрах: степень сжатия при промакивании (blot force) – 0 усл. ед., время промакивания (blot time) – 3 с, температура в камере – 4°C, относительная влажность в камере – 100%. После удаления излишков сетки с тонким слоем препарата быстро погружали в жидкий этан, за счет чего обеспечивали условия витрификации (образование слоя аморфного льда с препаратом).

Криоэлектронная микроскопия препаратов 26S конститутивной и 26S иммунопротеасомы. Подготовленные сетки препаратов протеасомы и иммунопротеасомы были перенесены в жидком азоте в криоэлектронный просвечивающий микроскоп Titan Krios 60-300 (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенный источником полевой эмиссии электронов типа Шоттки (FEI XFEG, Нидерланды), корректором сферических аберраций (CEOS GmbH, Германия) и КМОП (CMOS) устройством прямого детектирования электронов Falcon II (Thermo Fisher Scientific, США). В автоматическом режиме с помощью программного обеспечения EPU (версия 1.9.1.16REL; Thermo Fisher Scientific, США) получено 1106 и 1130 наборов изображений для конститутивной и иммунной формы 26S протеасомных субчастиц соответственно, детектируемых в течение времени экспозиции 3 с. Микроскоп работал при ускоряющем напряжении 300 кВ, номинальном увеличении 37 000× и соответствующем калиброванном размере пикселя 1.8 Å на уровне образца, объективной линзой в режиме дефокусировки с номинальными значениями в интервале от –0.8 до –2.5 мкм с шагом 0.2 мкм и величиной суммарной дозы 60 e–/Å2, равномерно распределенной по стеку изображений из 20 кадров. Основные параметры эксперимента сведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Параметры подготовки образцов, обработки данных и разрешения криоэлектронных структур конститутивной и иммунной 26S протеасомы человека

Подготовка образцов

Сетки (производитель, тип основания, диаметр отверстий в мкм/расстояние между отверстиями в мкм основной подложки, тип верхнего слоя)

Quantifoil, 400 mesh (Cu), R1.2/1.3, Graphene oxide

Концентрация, мг/мл

0.9

Установка для витрификации

Vitrobot Mark IV

Параметры витрификации (blot time, blot force, температура, влажность)

0 усл. ед., 3 с, 4°C, 100%

Сбор данных

ПЭМ

Titan Krios

Детектор

Falcon II

Ускоряющее напряжение, кВ

300

Номинальное увеличение

37 000×

Размер пикселя, Å

1.8

Номинальный интервал дефокусировки, мкм

от –0.8 до –2.5

Суммарная доза за время экспозиции, e–/Å2

60

Время экспозиции, с

5

Размер стека изображений

20

Доза на одно изображение в стеке, e–/Å2

3

Диаметр объективной апертуры, мкм

100

Обработка данных

Конститутивная (c26S)

Иммунная (i26S)

Исходное количество стеков изображений

1106

1130

Размер бокса, пкс

400

400

Исходное количество проекций

239 705

146 134

Количество проекций 26S субчастиц

81 714

45 782

Код депонирования в EMDB

EMD-19571

EMD-19572

Разрешение (c26S)

19S (local)

20S (local)

26S (global)

26S (3D flex)

Итоговое разрешение (FSC0.5), Å

6.64

3.88

4.08

4.17

Итоговое разрешение (FSC0.143), Å

4.43

3.6*

3.68

3.6*

Разрешение (i26S)

19S (local)

20S (local)

26S (global)

26S (3D flex)

Итоговое разрешение (FSC0.5), Å

6.89

3.90

4.17

4.25

Итоговое разрешение (FSC0.143), Å

4.51

3.6*

3.68

3.6*

* Уточнение крио-ЭМ-карт достигло предельно возможного разрешения при данном физическом размере пикселя исходного изображения с учетом выбранного порогового значения FSC (рис. 4).

 

Исходные данные криоэлектронной микроскопии в данном случае представляли собой стек (набор) из 20 изображений-кадров, полученных за время экспонирования одной области образца и объединенных в единый MRC-файл [29]. Предобработку данных выполняли с помощью программного обеспечения Warp (версия 1.0.9) [30]. Стек изображений был условно разбит на 5 × 5 локальных областей, для каждой из которых оценивали локальное значение дрейфа образца и дефокусировки, таким образом достигалось более точное моделирование функции передачи контраста. Поиск координат проекций частиц на скорректированных изображениях производили с помощью предобученной сверточной нейронной сети BoxNet2Mask_20180918. Для более точного распознавания частиц было проведено три раунда переобучения с помощью случайных выборок из 10 изображений с различной дефокусировкой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном исследовании впервые была определена структура 26S иммунопротеасомы человека с использованием криоэлектронной микроскопии с разрешением 3.6 Å с последующим проведением сравнительного анализа данной структуры с 26S протеасомой конститутивного фенотипа при том же разрешении. Транслокация субстрата в каталитическую полость – одна из ключевых и времязатратных стадий гидролиза белков 26S протеасомой. Так, известно, что мутантные варианты протеасомы с делетированным N-концевым участком субъединицы α3 проявляют повышенную активность по гидролизу как низкомолекулярных субстратов in vitro, так и белков непосредственно в клетках [31]. В научной литературе имеется ряд свидетельств, что 26S иммунопротеасома гидролизует клеточные субстраты быстрее [32]. Данное наблюдение было подтверждено в отношении оснОвных белков [33, 34] и потенциально связано с захватом положительно заряженных субстратов иммунопротеасомами с регуляторными субчастицами PA28 [35, 36]. Также известно об альтернативной укладке каталитических иммуносубъединиц в β-гептамерном кольце и структурно различном механизме активации 20S конститутивной и иммунной протеасомы комплексами типа PA28 [27]. Суммируя данные наблюдения с нашими результатами, можно предположить, что аллостерический эффект каталитических иммуносубъединиц, находящихся непосредственно под внешним α-кольцом, приводит к бóльшему разведению N-концевых фрагментов α-субъединиц при присоединении регуляторной 19S субчастицы и, в свою очередь, возникновения у 26S иммунопротеасомы “предактивационного” фенотипа.

БЛАГОДАРНОСТИ

Экспериментальная часть работы была выполнена на оборудовании Ресурсного центра зондовой и электронной микроскопии (Курчатовский комплекс НБИКС-технологий, НИЦ “Курчатовский институт”).

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено в рамках гранта Российского научного фонда № 23-74-00053 “Молекулярные механизмы действия модуляторов активности протеасомы химической и белковой природы”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

G. A. Saratov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: belogurov@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

T. N. Baymukhametov

National Research Center, “Kurchatov Institute”

Email: belogurov@ibch.ru
Russian Federation, pl. Academica Kurchatova 1, Moscow, 123182

A. L. Konevega

National Research Center, “Kurchatov Institute”; Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre, Kurchatov Institute; Institute of Biomedical Systems and Biotechnologies, Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University

Email: belogurov@ibch.ru
Russian Federation, pl. Academica Kurchatova 1, Moscow, 123182; mcr. Orlova Roshcha 1, Gatchina, 188300; ul. Politekhnicheskaya 29, St. Petersburg, 195251

А. A. Kudriaeva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: belogurov@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

А. А. Belogurov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Author for correspondence.
Email: belogurov@ibch.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; ul. Delegatskaya 20/1, Moscow, 127473

References

  1. Ciechanover A. // Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2017. V. 30. P. 341–355. https://doi.org/10.1016/j.beha.2017.09.001
  2. Kudriaeva A.A., Livneh I., Baranov M.S., Ziganshin R.H., Tupikin A.E., Zaitseva S.O., Kabilov M.R., Ciechanover A., Belogurov A.A., Jr. // Cell Chem. Biol. 2021. V. 28. P. 1192–1205. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.02.009
  3. Chau V., Tobias J.W., Bachmair A., Marriott D., Ecker D.J., Gonda D.K., Varshavsky A.A. // Science. 1989. V. 243. P. 1576–1583. https://doi.org/10.1126/science.2538923
  4. Ciechanover A., Heller H., Katz-Etzion R., Hershko A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. P. 761–765. https://doi.org/10.1073/pnas.78.2.761
  5. Arrigo A.P., Tanaka K., Goldberg A., Welch W. // Nature. 1988. V. 331. P. 192–194. https://doi.org/10.1038/331192a0
  6. Lander G.C., Estrin E., Matyskiela M.E., Bashore C., Nogales E., Martin A. // Nature. 2012. V. 482. P. 186–191. https://doi.org/10.1038/nature10774
  7. Deveraux Q., Ustrell V., Pickart C., Rechsteiner M. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 7059–7061. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)37244-7
  8. Smith D.M., Kafri G., Cheng Y., Ng D., Walz T., Goldberg A.L. // Mol. Cell. 2005. V. 20. P. 687–698. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.10.019
  9. Verma R., Aravind L., Oania R., McDonald W.H., Yates J.R., 3rd, Koonin E.V., Deshaies R.J. // Science. 2002. V. 298. P. 611–615. https://doi.org/10.1126/science.1075898
  10. de la Peña A.H., Goodall E.A., Gates S.N., Lander G.C., Martin A. // Science. 2018. V. 362. P. eaav0725. https://doi.org/10.1126/science.aav0725
  11. Kudriaeva A.A., Belogurov A.A. // Biochemistry (Moscow). 2019. V. 84. P. S159–S192. https://doi.org/10.1134/S0006297919140104
  12. Chapiro J., Claverol S., Piette F., Ma W., Stroobant V., Guillaume B., Gairin J.E., Morel S., Burlet-Schiltz O., Monsarrat B., Boon T., Van den Eynde B.J. // J. Immunol. 2006. V. 176. P. 1053–1061. https://doi.org/10.4049/jimmunol.176.2.1053
  13. Chen W., Norbury C.C., Cho Y., Yewdell J.W., Bennink J. R. // J. Exp. Med. 2001. V. 193. P. 1319–1326. https://doi.org/10.1084/jem.193.11.1319
  14. Sijts E.J., Kloetzel P.M. // Cell. Mol. Life Sci. 2011. V. 68. P. 1491–1502. https://doi.org/10.1007/s00018-011-0657-y
  15. Husnjak K., Elsasser S., Zhang N., Chen X., Randles L., Shi Y., Hofmann K., Walters K.J., Finley D., Dikic I. // Nature. 2008. V. 453. P. 481–488. https://doi.org/10.1038/nature06926
  16. Shi Y., Chen X., Elsasser S., Stocks B.B., Tian G., Lee B.H., Shi Y., Zhang N., de Poot S.A., Tuebing F., Sun S., Vannoy J., Tarasov S.G., Engen J.R., Finley D., Walters K.J. // Science. 2016. V. 351. P. aad9421. https://doi.org/10.1126/science.aad9421
  17. Matyskiela M.E., Lander G.C., Martin A. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. V. 20. P. 781–788. https://doi.org/10.1038/nsmb.2616
  18. Punjani A., Rubinstein J.L., Fleet D.J., Brubaker M.A. // Nat. Methods. 2017. V. 14. P. 290–296. https://doi.org/10.1038/nmeth.4169
  19. Punjani A., Zhang H., Fleet D.J. // Nat. Methods. 2020. V. 17. P. 1214–1221. https://doi.org/10.1038/s41592-020-00990-8
  20. van Heel M., Schatz M. // J. Struct. Biol. 2005. V. 151. P. 250–262. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2005.05.009
  21. Rosenthal P.B., Henderson R. // J. Mol. Biol. 2003. V. 333. P. 721–745. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2003.07.013
  22. Zivanov J., Nakane T., Scheres S.H.W. // IUCrJ. 2019. V. 6. P. 5–17. https://doi.org/10.1107/S205225251801463X
  23. Punjani A., Fleet D.J. // Nat. Methods. 2023. V. 20. P. 860–870. https://doi.org/10.1038/s41592-023-01853-8
  24. Cardone G., Heymann J.B., Steven A.C. // J. Struct. Biol. 2013. V. 184. P. 226–236. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2013.08.002
  25. Forsberg B.O., Shah P.N.M., Burt A. // Nat. Commun. 2023. V. 14. P. 5802. https://doi.org/10.1038/s41467-023-41478-1
  26. Huang X., Luan B., Wu J., Shi Y. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2016. V. 23. P. 778–785. https://doi.org/10.1038/nsmb.3273
  27. Chen J., Wang Y., Xu C., Chen K., Zhao Q., Wang S., Yin Y., Peng C., Ding Z., Cong Y. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 739. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21028-3
  28. Saratov G.A., Vladimirov V.I., Novoselov A.L., Ziganshin R.H., Chen G., Baymukhametov T.N., Konevega A.L., Belogurov A.A., Jr., Kudriaeva A.A. // Int. J. Mol. Sci. 2023. V. 24. P. 2091. https://doi.org/10.3390/ijms24032091
  29. Cheng A., Henderson R., Mastronarde D., Ludtke S.J., Schoenmakers R.H., Short J., Marabini R., Dallakyan S., Agard D., Winn M. // J. Struct. Biol. 2015. V. 192. P. 146–150. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2015.04.002
  30. Tegunov D., Cramer P. // Nat. Methods. 2019. V. 16. P. 1146–1152. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0580-y
  31. Choi W.H., de Poot S.A., Lee J.H., Kim J.H., Han D.H., Kim Y.K., Finley D., Lee M.J. // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 10963. https://doi.org/10.1038/ncomms10963
  32. Seifert U., Bialy L.P., Ebstein F., Bech-Otschir D., Voigt A., Schröter F., Prozorovski T., Lange N., Steffen J., Rieger M., Kuckelkorn U., Aktas O., Kloetzel P.M., Krüger E. // Cell. 2010. V. 142. P. 613–624. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.07.036
  33. Raule M., Cerruti F., Cascio P. // Biochim. Biophys. Acta. 2014. V. 1843. P. 1942–1947. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2014.05.005
  34. Kuzina E.S., Chernolovskaya E.L., Kudriaeva A.A., Zenkova M.A., Knorre V.D., Surina E.A., Ponomarenko N.A., Bobik T.V., Smirnov I.V., Bacheva A.V., Belogurov A.A., Gabibov A.G., Vlasov V.V. // Dokl. Bio. Bioph. 2013. V. 453. P. 300–303. https://doi.org/10.1134/S1607672913060070
  35. Kudriaeva A., Kuzina E.S., Zubenko O., Smirnov I.V., Belogurov A., Jr. // FASEB J. 2019. V. 33. P. 6852–6866. https://doi.org/10.1096/fj.201802237R
  36. Belogurov A., Jr., Kuzina E., Kudriaeva A., Kononikhin A., Kovalchuk S., Surina Y., Smirnov I., Lomakin Y., Bacheva A., Stepanov A., Karpova Y., Lyupina Y., Kharybin O., Melamed D., Ponomarenko N., Sharova N., Nikolaev E., Gabibov A. // FASEB J. 2015. V. 29. P. 1901–1913. https://doi.org/10.1096/fj.14-259333

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. (a) – Representative initial cryo-EM image of proteasome subunits of constitutive (c26S) and immune (i26S) forms; (b) – result of two-dimensional classification of the initial set of projections; (c) – subsamples of 26S proteasome subunits projections.

Download (258KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Heterogeneous Refinement result for the constitutive c26S (a) and immune i26S (b) forms of the proteasome. Orthogonal sections of cryo-EM maps along three axes for three structural organizations of proteasome subunits are shown. Absolute numbers of the corresponding projections in the data set after two-dimensional classification are indicated.

Download (178KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Correlation curves (Fourier Shell Correlation, FSC) for the constitutive c26S (a) and immune i26S (b) forms of the proteasome subunit. Shown are curves for local refinement of the 19S subunit (19S local, blue), local refinement of the core 20S subunit (20S local, orange), global refinement of the 26S subunit aligned with 20S (26S global, green), and refinement using the 3D Flexible Refinement method (26S 3Dflex, red). The dotted lines indicate two standard correlation thresholds of 0.5 and 0.143.

Download (101KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. The result of the local resolution analysis for the constitutive c26S (a) and immune i26S (b) forms of the proteasome subunit, as well as the distribution of 26S projections according to the found angular orientations. Cryo-EM maps obtained with 3D Flexible Refinement and additionally processed with DeepEMhancer were used to visualize the local resolution. A lateral view, a central slice, and a top view are shown.

Download (252KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Comparative analysis of the global structure of the human 26S proteasome in constitutive (c26S) and immune (i26S) forms. The structure of the human 26S proteasome PDB 5GJR is given as a reference.

Download (178KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. (a) – Analysis of electron density in the substrate-binding pockets of the hexameric ATPase ring; (b) – anchoring of HbYX motifs of Rpt3 and Rpt6 subunits in hydrophobic cavities of the heptameric α-ring; (c) – presence of immunosubunits in the proteasome isolated from HeLa cells pre-treated with IFNγ, based on changes in electron density at the positions of characteristic amino acid residues of the proteasome of the immune phenotype.

Download (743KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. Comparative analysis of the proximal (directly interacting with the 19S regulatory subunit) and axial (remote) heptameric α-ring (a) of the N-terminal regions of α-subunits in the structure of the immunoproteasome in comparison with the proteasome of the constitutive phenotype (b); (c) – cooperative shift of the N-terminal fragments of the PSMA1, PSMA4 and PSMA6 subunits in the direction of the PSMA2 subunit.

Download (610KB)
Indexing metadata
9. Fig. 8. (a) – Visualization of the electron density of the proximal α-ring in the region of the entrance to the inner chamber of the catalytic 20S subunit; (b) – dissociation of the system of ionic bonds observed in the case of the constitutive proteasome, between the amino acid residues Arg5 PSMA7 and Asp9 PSMA5, Arg10 PSMA5 and Asp7 PSMA1, as well as Asn8 PSMA1 and Arg3 PSMA4 in the structure of the immunoproteasome; (c) – formation of the π-π-fold between the residues Tyr5 and Phe9 of the PSMA4 and PSMA6 subunits.

Download (618KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».