Том 57, № 1 (2023)

Изучение роли цитокинов при различных патологических состояниях организма – одно из актуальных направлений современной биомедицины. В 1990 году в фиброцитоподобных стромальных клетках костного мозга обнаружили интерлейкин-11 (IL-11), повышенный интерес к которому наблюдается в последнее время. IL-11 локально экспрессируется нервными клетками и участвует в патогенетических механизмах формирования ряда заболеваний нервной системы. В представленном обзоре обобщены данные, указывающие на участие IL-11 в развитии патологий головного мозга. Вероятно, этот цитокин сможет найти применение в коррекции механизмов, связанных с формированием патологических состояний нервной системы.

Выявление широчайшего спектра локализованных в некодирующих участках генома однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с заболеваниями человека и патогенетически значимыми признаками, остро поставило вопрос по идентификации механизмов, объясняющих эти связи. Ранее нами выявлен ряд ассоциаций полиморфных вариантов генов, кодирующих белки репарации ДНК, с многофакторными заболеваниями. Для выяснения возможных механизмов, лежащих в их основе, нами проведена подробная аннотация регуляторного потенциала изучаемых маркеров с использованием ряда on-line ресурсов (GTXPortal, VannoPortal, Ensemble, RegulomeDB, Polympact, UCSC, GnomAD, ENCODE, GeneHancer, EpiМap Epigenomics 2021, HaploReg, GWAS4D, JASPAR, ORegAnno, DisGeNet, OMIM). В статье охарактеризован регуляторный потенциал следующих полиморфных вариантов: rs560191 (в гене TP53BP1), rs1805800 и rs709816 (NBN), rs473297 (MRE11), rs189037 и rs1801516 (ATM), rs1799977 (MLH1), rs1805321 (PMS2), rs20579 (LIG1). Приведена как общая характеристика изученных маркеров, так и информация по их влиянию на экспрессию “своего” и корегулируемых генов, на аффинность связывания факторов транскрипции. Рассмотрены опубликованные данные по адаптогенному и патологическому потенциалу этих SNP и о колокализованных с ними модификациях гистонов. Потенциальная вовлеченность на различных уровнях в регуляцию функционирования не только генов, в состав которых входят исследованные маркеры, но и близлежащих генов может объяснять ассоциированность изученных SNP с заболеваниями и их клиническими фенотипами.

Дофаминовая, серотониновая и глутаматная системы тесно взаимодействуют в патогенезе и фармакотерапии шизофрении. Мы сформулировали гипотезу, согласно которой полиморфные варианты генов GRIN2A, GRM3 и GRM7 могут быть ассоциированы с развитием гиперпролактинемии у больных шизофренией, принимающих конвенциональные и атипичные антипсихотики в качестве базовой терапии. Обследовано 432 пациента славянских национальностей с установленным диагнозом шизофрения. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови стандартным фенол-хлороформным методом. Для пилотного генотипирования выбрано 12 SNP в гене GRIN2A, четыре SNP в гене GRM3 и шесть в гене GRM7. Аллельные варианты этих полиморфизмов определяли методом ПЦР в реальном времени. Уровень пролактина определяли иммуноферментным методом. В группах пациентов с нормальным и повышенным уровнем пролактина, принимающих конвенциональные антипсихотики, выявлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов GRIN2A rs9989388 и GRIN2A rs7192557, а также различия в уровнях сывороточного пролактина в зависимости от генотипов полиморфного варианта GRM7 rs3749380. Обнаружены статистически значимые различия в частотах генотипов и аллелей полиморфного варианта GRM3 rs6465084 в группах пациентов с гиперпролактинемией и без нее, чьим базовым препаратом был атипичный антипсихотик. Впервые показана ассоциация полиморфных вариантов генов GRIN2A, GRM3 и GRM7 с развитием гиперпролактинемии у больных шизофренией, принимающих конвенциональные и атипичные антипсихотики. Эти ассоциации не только подтверждают роль глутаматергической системы в развитии шизофрении, но и показывают, что следует учитывать генетическую составляющую в терапии больных с данным расстройством.

Персонализация подходов к лечению рака желудка (РЖ) является актуальной проблемой, учитывая клиническую гетерогенность и агрессивное течение заболевания. В 2014 г. на основании молекулярных характеристик исследователи The Cancer Genome Atlas выделили четыре подтипа РЖ: Эпштейн‒Барр-позитивный (ВЭБ⁺), микросателлитно-нестабильный (МСН), хромосомно-нестабильный (ХН), геномно-стабильный (ГС). На сегодняшний день не существует унифицированной методики идентификации ХН и ГС подтипов, в то время как определение МСН и ВЭБ применяется в рутинной практике и имеет большое клиническое значение. Мы проанализировали статус МСН, провели качественный анализ наличия ДНК ВЭБ, а также поиск соматических мутаций в кодонах 12‒13 (экзон 2), 61 (экзон 3), 146 (экзон 4) гена KRAS, кодонах 597–601 (экзон 15) гена BRAF и кодонах 542‒546 (экзон 9), 1047‒1049 (экзон 20) гена PIK3CA в 159 образцах РЖ. ВЭБ выявлен в 8.2% образцов, МСН – в 13.2%. ВЭБ⁺ и МСН-фенотипы были взаимоисключающими. Средний возраст манифестации ВЭБ⁺ и MCH рака составил 54.8 и 62.1 г. соответственно. В 92.3% случаев ВЭБ⁺рак выявлен у мужчин, в 76.2% – в группе старше 50 лет, диффузный рак и аденокарцинома кишечного типа встречались в 6 (46.2%) и 5 (38.5%) случаях соответственно. МСН рак встречался в приблизительно равной доле у мужчин и женщин (n = 10; 47.6% /n = 11; 52.4%) с превалированием кишечного гистотипа (71.4%) и поражением малой кривизны (28.6%). В одном образце ВЭБ⁺ рака обнаружен вариант E545K в гене PIK3CA. Во всех образцах МСН опухолей выявлено сочетание клинически значимых вариантов генов KRAS и PIK3CA. Не обнаружено мутации V600E в гене BRAF, специфичной для МСН колоректального рака. Показано, что ВЭБ подтип связан с лучшим прогнозом: общая пятилетняя выживаемость при BЭБ⁺ и МСН раке составила 100.0 и 54.7% соответственно.

Уровень экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях служит важным показателем эффективности работы генов. Тонкая настройка экспрессии трансгенов ограничена небольшим репертуаром известных на данный момент эффективных промоторов. Нами клонирован и охарактеризован тканеспецифичный фрагмент промотора гена хитиназы класса I сои (GmChi1). Промотор GmChi1 (GmChi1P) клонировали из сои сорта Jungery. Последовательность промотора содержит ряд предполагаемых цис-действующих элементов, включая тканеспецифичные мотивы и мотивы, регулируемые в условиях стресса. По результатам гистохимического анализа самая высокая активность репортерного фермента β-глюкуронидазы (GUS), находящегося под контролем GmChi1P, обнаружена в корнях трансгенного растения, Nicotiana tabacum cv. NC89, на стадии формирования ростка с четырьмя листьями. Интересно, что обработка салициловой кислотой эффективно подавляла высокую активность GUS в корнях трансгенного табака. Делеционным анализом GmChi1P установлено, что последовательности, расположенные между позициями ‒719 и ‒382, содержат ключевые цис-элементы, ответственные за экспрессию репортерного гена uidA (кодирующего GUS) в листьях, корнях и местах поранения Nicotiana tabacum. Кроме того, согласно результатам флуорометрического анализа, активность укороченных промоторов: от ChiP(‒1292) до ChiP(‒719) ‒ в корнях трансгенного табака значительно подавляется абсцизовой кислотой и полностью ‒ салициловой. Обнаружено также, что промотор ChiP(‒382) экспрессируется исключительно в рыльце цветков трансгенного растения. С использованием репортерного фермента GUS не обнаружено окрашивания в других органах цветка трансгенного Nicotiana tabacum, включая чашелистики, лепестки, пыльники, нити и завязи, а также ни в одной из вегетативных тканей. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагмент промотора ChiP(‒382) может быть использован в тканеспецифичной регуляции экспрессии генов и генной инженерии растений.

Белки семейства ArdB подавляют активность белков системы рестрикции–модификации I типа (RM-I). Механизм действия ArdB к настоящему моменту остается неизвестным; спектр ингибируемых ими мишеней исследован недостаточно. Нами показано, что присутствие гена ardB из конъюгативной плазмиды R64 подавляет активность EcoAI – представителя семейства IB системы рестрикции–модификации. Ввиду обнаруженного отсутствия специфичности ArdB к определенному семейству рестриктаз системы RM-I (ингибирует как IA-, так и IB-семейство) можно предполагать, что механизм антирестрикционной активности этого белка не зависит от последовательности как ДНК в сайте узнавания, так и структуры рестриктазы системы RM-I.

Белок CP190 – один из ключевых компонентов инсуляторных комплексов дрозофилы, изучение которого важно для понимания механизмов регуляции генов в процессе дифференцировки клеток. Однако мутанты по гену Cp190 погибают, не доживая до взрослого состояния, что существенно усложняет изучение функций этого гена в клетках взрослого организма. Чтобы преодолеть эту проблему и исследовать регуляторные эффекты CP190 в развитии тканей имаго, мы разработали систему условного спасения мутантов Cp190. Спасающая конструкция, содержащая кодирующую последовательность гена Cp190, направленно удаляется при помощи Cre/loxP-опосредованной рекомбинации только в половых клетках семенников, что позволяет изучать эффекты мутации в клетках мужского зародышевого пути. С использованием высокопроизводительного транскриптомного анализа установлено, что инактивации CP190 влияет на экспрессию генов в клетках зародышевого пути. Обнаружено, что мутация Cp190 противоположным образом влияет на тканеспецифичные гены, экспрессия которых подавляется CP190, и гены домашнего хозяйства, активатором которых выступает CP190. Мутация Cp190 также приводила к активации экспрессии субпопуляции генов дифференцировки сперматоцитов, которые регулируются транскрипционным комплексом tMAC. Полученные результаты указывают на то, что основной функцией CP190 в процессе сперматогенеза является координация взаимодействий между генами дифференцировки и специфичными для них транскрипционными активаторами.

Жидкофазное разделение белков происходит в ряде биологических процессов, таких как регуляция транскрипции, процессинг и созревание РНК. Sm-подобный белок 4 (LSM4) участвует во множестве процессов, включая сплайсинг пре-мРНК и сборку P-телец. Перед проведением исследований по участию LSM4 в разделении двух жидких фаз в ходе процессинга или созревания РНК необходимо сначала обнаружить эту способность белка LSM4 в системе in vitro. Плазмиду, экспрессирующую белок mCherry-LSM4, получали на основе вектора pET30a и использовали для выделения белка mCherry-LSM4 из прокариотических клеток (Escherichia coli штамм BL21). Белок mCherry-LSM4 очищали с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе, а затем жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC). Широкопольную флуоресцентную микроскопию Delta-Vision использовали для наблюдения за динамическим разделением фаз жидкость‒жидкость в препаратах белка LSM4 in vitro. В ходе анализа структуры белка LSM4 с помощью базы данных Predictor of Natural Disordered Regions установлено, что его С-конец содержит домен низкой сложности. Из E. coli получен очищенный препарат полноразмерного белка LSM4 человека. Показано, что LSM4 человека обеспечивает зависимое от концентрации разделение фаз жидкость‒жидкость in vitro в буфере с краудинг-агентами. Соли в высокой концентрации и 1,6-гександиол блокируют LSM4-индуцированное разделение двух жидких фаз. Кроме того, in vitro наблюдается слияние капель белка LSM4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что полноразмерный белок LSM4 человека обладает способностью образовывать жидкие включения и вызывать разделение фаз жидкость‒жидкость in vitro.

Повышение точности предсказания структуры и функций белков в последнее время связано в основном с применением и совершенствованием методов машинного обучения. Кодирование информации, содержащейся в последовательности аминокислот, ‒ первый этап предсказания структуры, и поэтому оно играет фундаментальную роль в конечном успехе этих методов. Мы предлагаем единую методику генерации предикторов сложного вида, позволяющую формализовать предположения о факторах, которые влияют на структуру и функцию белка. Кроме того, в рамках этой задачи предложен подход к созданию и использованию баз данных структурных свойств, предоставляющих новые возможности для статистического описания и анализа структурных свойств. Предложенные методы позволяют создавать и тестировать наборы предикторов (описывающих факторы, которые влияют на структуру и функцию белка) как для конкретных задач, так и универсальных. Статистические методы построения моделей, которые мы используем, позволяют отбирать статистически значимые предикторы и улучшать таким образом предсказательные модели. На классическом примере предсказания вторичной структуры белка мы показали эффективность данного подхода, получив точность предсказания для трех классов DSSP: Q3 = 81.3%. Предложенный метод реализован в виде мультиплатформенной программы на языке С++ для командной строки. Исходный код и использованные в этой работе данные расположены по ссылке https://github.com/Milchevskiy/protein-encoding-projects

Ферменты пути транссульфурации и продукции сероводорода – цистатионин-β-синтаза (CBS), цистатионин-γ-лиаза (CSE) и 3-меркаптопируват-сульфотрансфераза (3-МST) – играют важную цитопротекторную роль в организме. Ранее с помощью технологии CRISPR/Cas9 мы получили линии Drosophila melanogaster с делециями генов cbs, cse, mst, а также с двойной делецией генов cbs и cse. Нами проанализировано влияние этих делеций на паттерн белкового синтеза в слюнных железах личинок третьего возраста и в яичниках половозрелых мух. В слюнных железах линий с делециями cbs и cse обнаружено снижение накопления белка FBP2, содержащего 20% остатков метионина. В яичниках выявлены изменения в уровне экспрессии и в точках изофокусирования белков, участвующих в защите клеток от окислительного стресса, гипоксии и в деградации белков. Показано, что степень окисленности белков в линиях мух с делециями ферментов транссульфурации сходна со степенью окисленности в контрольной линии. Обнаружено снижение общего количества протеасом и их каталитических субъединиц в линиях с делециями генов cbs и cse.