Том 58, № 5 (2024)

Ассоциированное с возрастом изменение характера метилирования считается важным предиктором биологического возраста человека. Изменение уровня метилирования CpG-динуклеотидов способствует сдвигу в работе ряда генов, в том числе ассоциированных с функционированием иммунной системы. В число этих генов входит ген CSF1, белковый продукт которого ассоциирован с воспалительным старением, что делает его важным биомаркером возрастзависимых заболеваний. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии определен профиль метилирования ассоциированного с промотором CpG-островка гена CSF1. Проведен поиск зависимостей между характером метилирования CpG-сайтов внутри исследуемых регионов и относительным уровнем мРНК гена CSF1 и его белковым продуктом у лиц разных возрастных групп. Показан высокий уровень корреляции двух CpG-сайтов с исследуемыми параметрами и установлено, что эти CpG-динуклеотиды входят в состав сайтов связывания факторов транскрипции семейства NFI и фактора EGR1. Предполагается, что эти CpG-сайты играют важную роль в регуляции экспрессии гена CSF1.

Cерин/треониновая протеинкиназа ATM (ataxia-telangiectasia mutated) выполняет в клетке ряд функций, связанных с процессом старения – участвует в регуляции клеточного ответа на повреждение ДНК, а также фосфорилирует вакуолярную АТРазу, что ведет к деградации лизосом и клеточному старению. В данной работе геропротекторный потенциал KU-60019, селективного ингибитора ATM, проанализирован на трех видах Drosophila с разной продолжительностью жизни. Показано, что KU-60019 увеличивает продолжительность жизни особей долгоживущего вида (D. virilis) и вида с умеренной продолжительностью жизни (D. melanogaster). Однако продолжительность жизни особей короткоживущего вида D. kikkawai сокращается после обработки KU-60019. При этом KU-60019 повышает выживаемость дрозофил трех видов в условиях гипертермии, окислительного стресса и голодания, но не оказывает влияния на возрастзависимое изменение уровня локомоторной активности. Подавление экспрессии гена tefu, кодирующего гомолог ATM, с помощью РНК-интерференции также приводит к увеличению продолжительности жизни и стрессоустойчивости особей D. melanogaster по сравнению с мухами контрольных линий. Таким образом, влияние KU-60019 на продолжительность жизни варьирует в зависимости от вида Drosophila, что может быть связано с установленными нами ранее различиями транскриптомов у исследуемых видов и требует дальнейшего экспериментального изучения.

Мобильные генетические элементы (МГЭ) способствуют повышению частоты спонтанных мутаций в геноме, а также способны изменять структуру генов или влиять на их экспрессию, поэтому важно иметь представление об активности МГЭ и их положении в геноме. В представленной работе показано преимущество сочетания двух методов секвенирования для поиска инсерций МГЭ и хромосомных перестроек: полногеномного нанопорового секвенирования и секвенирования транскриптома методом Illumina. Полногеномное нанопоровое секвенирование позволяет обнаружить инсерции МГЭ, а секвенирование транскриптома на платформе Illumina – оценить влияние инсерций на экспрессию генов. В работе использованы данные секвенирования геномов линий Drosophila melanogaster с фенотипом flamenco SS (w¹, мутант flamenco) и MS (w¹, мутант flamenco, активная копия gypsy). В качестве контроля использована лабораторная линия дикого типа Д32. В линиях SS, MS и линии дикого типа обнаружены инсерции и делеции МГЭ в эухроматиновых районах генома и в интронах генов относительно референсного генома (NCBI GCF_000001215.4). В анализируемых геномах проведен поиск инсерций и делеций в генах системы РНК-интерференции и в генах, дифференциально экспрессируемых у мух линий SS и MS. В результате обнаружены инсерции МГЭ в различных регионах генов AGO3, CG17147, Su(var)3-3, Gasz, CG43348, moody, CG17752. Не обнаружено корреляции между изменением положения МГЭ и уменьшением или увеличением экспрессии большинства анализируемых генов. В гене vig найдена хромосомная перестройка, затрагивающая 3´-нетранслируемую область. На основании результатов секвенирования длинными прочтениями получена сборка генома линии MS de novo. Установлено, что повышение экспрессии генов CR45822 и pst в линиях SS и MS связано с трипликацией, а не с изменением регуляторных последовательностей генов или инсерцией МГЭ.

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (Pancreatic Ductal AdenoCarcinoma, PDAC) характеризуется неблагоприятным прогнозом и плохо поддается современным методам лечения. Моделью развития PDAC может служить ряд клеточных культур, отражающих различные степени дифференцировки и злокачественности опухоли. Высокодифференцированные низкозлокачественные клетки отличаются повышенной экспрессией гена KLF5. Белок KLF5 – яркий представитель многофункциональных факторов транскрипции, участвует во множестве клеточных процессов, в частности, связанных с различными видами рака. Методом циркулярной идентификации конформации хромосомы (4C-seq) нами изучена пространственная организация хроматина, включающего регуляторные области гена KLF5, в высокодифференцированных клетках PDAC Capan2 с высоким уровнем экспрессии KLF5 и в низкодифференцированных клетках PDAC MIA PaCa2 c низким уровнем экспрессии этого гена. Выявлены существенные различия в числе и распределении контактов регуляторной области KLF5 с другими областями хроматина в этих типах клеток: в клетках Capan2 число контактов значительно выше. Существует корреляция между уровнем экспрессии соседствующих с KLF5 генов и интенсивностью их контактов с регуляторной областью KLF5, что указывает на согласованность их экспрессии, возможно, в рамках транскрипционной фабрики. Для Capan2 характерен высокий уровень контактов регуляторной области KLF5 со свободным от генов участком генома, содержащим кластер ассоциированных с PDAC полиморфных сайтов (SNP/InDel). Таким образом, при повышении степени злокачественности клеток наблюдается снижение общего числа контактов промоторной области гена KLF5 и уровня экспрессии большинства окружающих KLF5 генов.

Бактерии Klebsiella oxytoca являются возбудителями различных внебольничных и внутрибольничных инфекций, в том числе инфекций мочевыводящих путей, внутрибольничной пневмонии, антибиотик-ассоциированной диареи, однако факторы вирулентности данного вида изучены недостаточно. С помощью разных субстратов нами охарактеризован адгезивный потенциал урологического изолята K. oxytoca NK-1. Показано, что этот штамм эффективно адгезирует к эпителиальным клеточным линиям, гликозилированным и негликозилированным белкам и полистиролу, а также вызывает агглютинацию клеток дрожжей, что указывает на наличие фимбрий типа 1 и 3 – органелл, обеспечивающих адгезию энтеробактерий к широкому кругу субстратов. В геноме K. oxytoca NK-1 обнаружены опероны фимбрий типа 1 и типа 3; оперон фимбрий типа 3 представлен двумя копиями. Сконструированы мутанты с инактивированными генами этих фимбрий. Показано, что инактивация генов фимбрий типа 1 не влияет на адгезию бактерий, в то время как инактивация генов фимбрий типа 3 повышает адгезию K. oxytoca NK-1 к клеткам эпителия легких (линия H1299); дополнительным индуктором повышенной адгезивности является манноза. При этом адгезия данного мутанта к другим субстратам не меняется. Полученные данные указывают на многофакторность аппарата адгезии K. oxytoca и возможность компенсаторной экспрессии или сверхэкспрессии генов других адгезинов в отсутствие фимбрий типа 1 и / или 3.

Вирус папилломы человека 16 типа (ВПЧ-16) относится к группе вирусов высокого риска и характеризуется гиперэкспрессией онкобелков Е6 и Е7, определяющих онкогенные свойства вируса: иммортализацию и злокачественную трансформацию пролиферирующих эпителиальных клеток. Биогенез редоксчувствительных белков Е6 и Е7 на ранних этапах вирусной инфекции приводит к блокированию антиоксидантных систем клетки и убиквинтинзависимой деградации опухолевых супрессоров р53 и Rb. Поддержание высоких темпов пролиферации опухолевых клеток способствует повышению уровня продукции активных форм кислорода (АФК) и смещению окислительно-восстановительного баланса в сторону окислительных процессов. Восстановленный глутатион (GSH) через S-глутатионилирование тиоловых групп редоксчувствительных белков обеспечивает антиоксидантную защиту опухолевых клеток, что приводит к появлению лекарственно устойчивых злокачественных новообразований. В связи с этим особое значение приобретают лекарственные препараты, действие которых направлено на восстановление редокс-баланса в раковых клетках и тем самым на повышение их чувствительности к химиотерапии. Нами установлено, что в ВПЧ-16-положительной линии клеток SiHa плоскоклеточной карциномы шейки матки РНКаза Bacillus pumilus (биназа) модулирует редоксзависимые регуляторные механизмы, обеспечивающие нечувствительность этих клеток к апоптозу. Действие биназы в нетоксичных концентрациях (0.8 мкМ) инициирует ряд начальных апоптогенных изменений, а именно: снижает уровень АФК и GSH, ингибирует экспрессию онкобелка Е6, активирует экспрессию супрессора опухоли р53, снижает уровень глутатионилирования р53 и повышает глутатионилирование Na,K-АTРазы. Индуцированное биназой нарушение целостности мембран митохондрий является сигналом к активации митохондриального пути апоптоза.

Праймаза-полимераза PrimPol человека – ключевой участник механизма реинициации синтеза ДНК при остановке репликативной вилки на поврежденных участках. PrimPol обладает ДНК-праймазной активностью и синтезирует ДНК-праймеры, которые используются процессивными ДНК-полимеразами для продолжения репликации. Привлечение PrimPol к поврежденному участку ДНК, а также активация каталитической активности PrimPol происходят за счет взаимодействия с репликативным белком А (RPA), связывающим оцДНК. В С-концевом домене PrimPol расположен отрицательно заряженный мотив связывания с RPA (RBM, RPA-binding motif), мутации которого нарушают взаимодействие двух белков. Мотив RBM участвует также в негативной регуляции взаимодействия PrimPol c ДНК. Делеция RBM резко повышает аффинность PrimPol к ДНК и активность PrimPol. Механизм опосредованной RBM регуляции активности PrimPol не установлен. Свой вклад во взаимодействие PrimPol c RPA и ДНК потенциально может вносить относительно сильный отрицательный заряд RBM. В RBM можно отдельно выделить участки RBM-A и RBM-B. В представленной работе мы дополнительно добавили (замена V546E) или понизили (замена D547H) отрицательный заряд в RBM-B PrimPol и биохимически охарактеризовали мутантные варианты. Показано, что локальное изменение заряда RBM-B не влияет на взаимодействие PrimPol с ДНК и RPA, а также на каталитическую активность фермента.