Redox status and protein glutathionylation in binase-treated HPV16-positive SiHa Carcinoma cells

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Human papillomavirus type 16 (HPV16) belongs to the high-risk type viruses and is associated by overexpression of E6 and E7 oncoproteins, which determine the oncogenic properties of the virus such as immortalization and malignant transformation of proliferating epithelial cells. The biogenesis of redox-sensitive proteins E6 and E7 at the early stages of viral infection leads to blocking of cell antioxidant defense system and ubiquintin-dependent degradation of p53 and Rb tumor suppressors. Maintaining high rates of tumor cell proliferation contributes to an increase in the reactive oxygen species (ROS) production level and a shift in the redox balance towards oxidative processes. Reduced glutathione (GSH) provides antioxidant protection to tumor cells through S-glutathionylation of thiol groups of redox-sensitive proteins, which leads to the appearance of multidrug-resistant forms of cancer. In this regard, drugs restoring redox balance and increasing susceptibility to antitumor therapy are of particular importance. We have established that in HPV-16-positive SiHa cells of cervical squamous cell carcinoma, Bacillus pumilus RNase (binase) modulates the redox-dependent regulatory mechanisms that ensure tumor cell resistance to apoptosis. Binase in nontoxic concentrations initiates a number of pre-apoptogenic changes, i.g., decreases ROS and GSH levels, suppresses the expression of E6 oncoprotein, activates the expression of p53 tumor suppressor, and reduces the mitochondrial potential of tumor cells. Binase-induced disruption of the mitochondrial membrane integrity is a signal for the mitochondrial apoptosis pathway activation.

Full Text

Введение

Восстановленный глутатион (GSH) – трипептид, состоящий из трех аминокислотных остатков: L-глутамата, L-цистеина и глицина. GSH синтезируется в цитозоле, где его концентрация составляет 5–10 мМ; из цитозоля GSH транспортируется в митохондрии, эндоплазматический ретикулум, пероксисомы и ядро [1]. Ключевые функции GSH – вывод ксенобиотиков из клетки, антиоксидантная защита и редоксзависимая модификация тиоловых групп белков, в результате которой происходит образование дисульфидного мостика между белком и глутатионом (S-глутатионилирование) [2].

В норме на долю GSH приходится около 99% от его общего внутриклеточного содержания [1, 3]. Окислительно-восстановительный потенциал пары GSH/GSSG часто используют для определения редокс-статуса клетки [3, 4]. Нарушение внутриклеточного баланса GSH/GSSG наблюдается при ряде патологий, включая нейродегенеративные заболевания, муковисцидоз, ВИЧ и злокачественные новообразования [2, 5]. Редокс-статус опухолевых клеток кардинально отличается от здоровых вследствие повышенного содержания активных форм кислорода (АФК), вызванного гиперэкспрессией онкогенов MYC и KRAS, мутации в которых обнаруживают в 20–30% всех опухолей [6, 7]. Помимо антиоксидантной активности, GSH действует как детоксикант, образуя конъюгаты с химиотерапевтиками, которые затем выводятся из клетки эффлюкс-системой [8]. В связи с этим глутатион считают важным звеном разработок стратегии противоопухолевой терапии.

Сдвиг внутриклеточного редокс-статуса в более окисленную область, характерный для злокачественных клеток, индуцирует S-глутатионилирование редоксчувствительных белков (киназ, факторов транскрипции, ионных транспортеров). Это защищает тиоловые группы от необратимого окисления либо приводит к изменению функциональной активности белков [9, 10]. Так, вирус папилломы человека (ВПЧ) ингибирует антиоксидантные системы клетки для активации редоксчувствительных онкобелков Е6 и Е7, подавляющих активность опухолевых супрессоров p53 и Rb. Злокачественная трансформация клеток SiHa поддерживается за счет экспрессии белков E6 и E7, кодируемых ВПЧ типа 16 (ВПЧ-16), относящегося к вирусам высокого канцерогенного риска [11].

Терапевтическая эффективность препаратов, направленных на восстановление редокс-статуса клетки, уже доказана при лечении некоторых онкологических заболеваний, включая промиелоцитарный лейкоз, рак пищевода, толстой кишки, молочной железы и немелкоклеточный рак легкого [12, 13]. Установлено, что РНКазы также обладают антиоксидантными свойствами. Так, РНКаза Bacillus pumilus (биназа) снижает уровень АФК в клетках Kasumi-1, меланомы В16 и Jurkat [14–16]. Таким образом, восстановление редокс-статуса опухолевых клеток РНКазами до уровня, характерного для нормы, препятствует их неконтролируемой пролиферации и приводит к повышению чувствительности клеток к апоптозу.

Здесь проанализированы опосредованные модуляцией редокс-статуса клеток и глутатионилирования белков механизмы цитотоксического действия биназы на ВПЧ-16-положительные клетки SiHa плоскоклеточной карциномы шейки матки.

Экспериментальная часть

Культивирование клеток. Линию клеток SiHa – ВПЧ-16-позитивной плоскоклеточной карциномы шейки матки человека (АТСС, США) – культивировали на питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS; “ПанЭко”, Россия), 2 мМ глутамина (“ПанЭко”), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (“ПанЭко”), при 37°C в атмосфере 5% CO2. Клетки засевали в 12-луночные плоскодонные планшеты (“Nest”, Китай) и растили до образования 50%-ного монослоя.

Ферментативная обработка клеток. В работе использовали биназу – РНКазу B. pumilus дикого типа (EC 3.1.27.3, 109 а.о., Mr 12.3 кДа, pI 9.5), полученную как описано ранее [17]. Учитывая данные V. Mitkevich и др. [18] по коэффициенту цитотоксичности биназы (CC50 – 50% cytotoxicity concentration) для клеток SiHa, который составляет 1.2 ± 0.2 мкM за 72 ч инкубации, мы использовали фермент в концентрации 0.8 мкМ. Клетки инкубировали с биназой в течение 24, 48 и 72 ч.

Цитофлуориметрический анализ. Внутриклеточные параметры оценивали с помощью проточного цитофлуориметра BD LSRFortessa™ (“Becton Dickinson”, США).

Процент клеток с поврежденной мембраной в популяции определяли с помощью йодида пропидия (PI; “Sigma-Aldirch”, США). Краситель в конечной концентрации 10 мкг/мл вносили в суспензию клеток за 1 мин до проведения измерений. Окрашенные PI (PI+) клетки определяли как мертвые (некротические) и исключали из рассмотрения при оценке уровня АФК, глутатиона и митохондриального потенциала.

Для определения уровня АФК клетки обрабатывали дигидрородамином 123 (DHR123; “Invitrogen”, США) в концентрации 10 мкМ.

Содержание восстановленного глутатиона, GSH, в клетках определяли с использованием красителя ThiolTrackerTM Violet (“Invitrogen”), конечная концентрация которого составляла 7.5 мкМ.

Величину митохондриального потенциала (ΔΨm) в клетках с неповрежденной мембраной оценивали с использованием красителя MitoProbe™ DiIC1(5) (“Invitrogen”) в конечной концентрации 0.5 мкМ.

Обработанные красителями клетки инкубировали при 37°C в темноте в течение 30 мин. В клетках с неповрежденной мембраной содержание АФК и GSH оценивали по интенсивности флуоресценции зеленого цвета для соответствующих красителей, а изменение митохондриального потенциала – по изменению интенсивности флуоресценции красного цвета для красителя DiIC1(5).

Иммуноблотинг. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл лизирующего буфера RIPA (25 мМ Трис-HCl, pH 7.6, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet P40, 0.1% SDS, 1% дезоксихолата натрия). Суспензию инкубировали при 4°С в течение 1 ч при перемешивании, после чего центрифугировали (10 000 g, при 4°C) и собирали супернатант. Концентрацию белка в клеточных лизатах определяли методом Лоури. Электрофоретическое разделение белков проводили в денатурирующем 10%-ном ПААГ. После разделения белки переносили на PVDF-мембрану с использованием системы Trans-Blot Turbo (“Bio-Rad”, США). По окончании процесса мембраны инкубировали сначала в течение 30 мин в блокирующем буфере, содержащем 5% обезжиренного молока в PBST (50 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.05% Tween 20), а затем при 4°С в течение ночи с мышиными моноклональными антителами против следующих белков: p53 (“Santa Cruz Biotechnology”, США; в разведении 1 : 1 000), Е6, Na,K-АТPазы-α1 (“Sigma-Aldrich”; 1 : 10 000), β-актина (“Invitrogen”; 1 : 10 000), глутатиона (“Sigma-Aldrich”; 1 : 1 000) – или с кроличьими антителами против р53, глутатионилированного по Cys141 (“Sigma-Aldrich”; 1 : 1 000). После тщательной промывки в PBST мембраны инкубировали с меченными пероксидазой хрена козьими антителами против IgG соответственно мыши или кролика. Для визуализации результатов использовали набор SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (“Thermo Fisher Scientific”, США) на гель-документаторе ChemiDoc MP (“Bio-Rad”). Денситометрический анализ содержания белков проводили с использованием программного пакета Image Lab (“Bio-Rad”).

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проведены в трех биологических повторах. Для статистической обработки данных использовали t-тест Стьюдента. Значение p ≤ 0.05 отражало статистически значимые различия. Для статистического анализа использовали программные пакеты STATISTICA 10.0 и MS Excel 2020 (p ≤ 0.05).

Результаты исследования

Влияние биназы на редокс-статус клеток линии SiHa

Повышенный уровень продукции АФК – следствие высоких темпов пролиферации опухолевых клеток. Адаптация клеток к избыточному уровню АФК посредством глутатионилирования редоксчувствительных белков способствует увеличению их выживаемости и появлению агрессивных опухолей, обладающих лекарственной устойчивостью [19]. Влияние биназы на редокс-статус клеток SiHa оценивали по изменению уровня АФК и восстановленного глутатиона. Инкубация клеток с биназой в течение 24 ч приводила к снижению уровня АФК в клетках SiHa на 25%; при увеличении времени инкубации до 48 и 72 ч антиоксидантный эффект биназы сохранялся (рис. 1а). Уровень восстановленного глутатиона достоверно снижался только через 72 ч инкубации с биназой (рис. 1б).

 

Рис. 1. Цитофлуориметрический анализ содержания АФК (а) и восстановленного глутатиона (б) в клетках SiHa, инкубированных с биназой (0.8 мкМ) в течение 24, 48 и 72 ч. Результаты представлены как сигнал флуоресценции красителей DHR123 (АФК) и ThiolTrackerTM Violet (GSH), полученный от клеток, инкубированных с биназой, относительно необработанных. *p ≤ 0.05.

 

Проапоптотический эффект биназы

Снижение митохондрильного потенциала – один из ярких маркеров внутреннего (митохондриального) пути апоптоза. Изменения митохондриального потенциала в клетках после обработки биназой в концентрации ниже СС50 (0.8 vs 1.2 мкМ) оценивали с помощью флуоресцентного трекера DilC1(5), накапливающегося в митохондриях. Анализ изменения доли живых клеток со сниженным митохондриальным потенциалом в течение 72 ч инкубации с биназой приведен на рис. 2а. Как видно, резкий рост доли клеток со сниженным митохондриальным потенциалом зарегистрирован через 72 ч; при этом увеличения доли мертвых клеток не наблюдали (рис. 2б).

 

Рис. 2. Цитофлуориметрический анализ содержания клеток со сниженным митохондриальным потенциалом (а) и мертвых клеток (б) после обработки биназой (0.8 мкМ) в течение 24, 48 и 72 ч. *p ≤ 0.05.

 

Влияние биназы на глутатионилирование p53 и Na,K-АТPазы

Чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическому действию биназы зависит от экспрессии специфических онкогенов: KIT, RUNX1 (AML1-ETO), FLT3 и KRAS [20–22]. Линия клеток SiHa, ВПЧ-16-положительной плоскоклеточной карциномы шейки матки, характеризуется экспрессией редоксчувствительных вирусных онкобелков Е6 и Е7. Их основная функция заключается в блокировании антиоксидантных систем и подавлении опухолевых супрессоров р53 и Rb. Так, вирусный белок Е6 индуцирует убиквинтинзависимую деградацию онкосупрессора р53 [23]. Кроме того, известно, что в условиях оксидативного стресса белок p53 подвергается редоксзависимому глутатионилированию, что препятствует его связыванию с ДНК и, как следствие, реализации противоопухолевой активности [24].

Как видно из данных, представленных на рис. 3, инкубация клеток SiHa с биназой в концентрации 0.8 мкМ приводит к снижению экспрессии вирусного белка Е6 и усилению биогенеза р53. Это согласуется с результатами, полученными нами ранее для более высоких концентраций фермента (8 мкМ) [18]. Кроме того, в присутствии биназы снижен уровень глутатионилирования белка р53 (рис. 3), что повышает его онкосупрессорный потенциал.

 

Рис. 3. Влияние биназы на уровни белков Е6 ВПЧ-16 и р53 в клетках SiHa. а – Электрофоретический анализ белков в лизатах клеток SiHa. Здесь и далее: M – маркеры молекулярной массы белков PageRuler Prestained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, США), контроль – необработанные клетки; биназа – клетки инкубировали с 0.8 мкМ биназой в течение 48 ч. б – Относительное содержание белков р53 и Е6 в лизатах, обработанных биназой клеток SiHa. За 100% принят уровень соответствующих белков в контроле. в – Изменение степени глутатионилирования белка р53 (GSS-р53) при обработке клеток SiHa биназой. Кратность изменения рассчитывали как GSS-р53/р53; за единицу принято значение GSS-р53/р53 в контроле. *p ≤ 0.05.

 

Na,K-АТPаза относится к ключевым редоксчувствительным белкам клетки. Функциональная активность этого фермента напрямую зависит от окислительно-восстановительного статуса клетки и снижается при окислительном стрессе, гипоксии и глутатионилировании каталитической α1-субъединицы [25]. Раковые клетки характеризуются повышенной активностью Na,K-АТPазы, поэтому ингибиторы ее ферментативной активности относятся к перспективным препаратам для лечения онкологических заболеваний [26, 27].

Нами показано, что в клетках SiHa, инкубированных с биназой в концентрации 0.8 мкМ в течение 48 ч, уровень Na,K-АТPазы снижался на 45% относительно необработанных клеток; при этом на 20% повышалось содержание глутатионилированной формы каталитической α1-субъединицы фермента (рис. 4). Все эти процессы приводит к ингибированию АТPазной активности фермента и, как следствие, к нарушению ионного гомеостаза и последующему апоптозу клеток. Таким образом, конечным результатом действия биназы даже в нетоксичной концентрации можно считать ее проапоптотический эффект.

 

Рис. 4. Влияние биназы на уровень α1-субъединицы Na,K-АТPазы в клетках SiHa. а – Электрофоретический анализ содержания α1-субъединицы Na,K-АТPазы в клетках SiHa. Обозначения см. в подписи к рис. 3. Изменение степени глутатионилирования (б) и содержания (в) α1-субъединицы Na,K-АТPазы в лизатах клеток SiHa, обработанных биназой. За единицу приняты значения в контроле. *p ≤ 0.05.

 

Обсуждение результатов

Антиоксидантный потенциал биназы

Антиоксидантная функция восстановленного глутатиона, GSH, заключается в предотвращении развития окислительного стресса, защите белков от необратимого окисления и поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в клетках. GSH взаимодействует с окисленными формами молекул и АФК как напрямую, так и в качестве косубстрата фермента глутатионпероксидазы. В ходе ферментативной реакции глутатионпероксидаза восстанавливает H2O2 и перекиси липидов до воды и соответствующих спиртов [28]. Детоксикация ксенобиотиков также одна из важнейших функций GSH. В реакции, катализируемой глутатион-S-трансферазой, GSH образует конъюгаты с электрофильными ксенобиотиками. Такие конъюгаты (GS-X) выбрасываются из клетки ABC-транспортером MRP1 (multidrug resistance protein 1), что приводит к развитию лекарственной устойчивости опухолевых клеток [29, 30].

Изучению антиоксидантной активности РНКаз животного и бактериального происхождения посвящен ряд исследований. Так, B. Ardelt с соавт. [31] установили снижение АФК в клетках канальцевой карциномы молочной железы и фибросаркомы после обработки РНКазой из ооцитов лягушки Rana pipiens (онконазой). На модели опухолевых клеток Kasumi-1 В. Митькевич (Mitkevich) с соавт. [15] выявили дозозависимое снижение продукции АФК под действием биназы. Интересно отметить, что оно коррелировало с ростом внутриклеточного кальция и процента апоптических клеток. Подавление окислительного стресса в клетках Jurkat после обработки биназой коррелировало со снижением уровня экспрессии транскрипционного фактора NF-êB1, при этом возрастала доля клеток в состоянии апоптоза [16]. Онконаза также снижала уровень экспрессии NF-êB1 в клетках мезотелиомы [32]. Известно, что повышенное содержание АФК в клетках индуцирует экспрессию NF-êB, что приводит к активации генов пролиферации и снижению чувствительности клеток апоптозу. По-видимому, подавление продукции АФК и снижение уровня NF-êB характерны для цитотоксичных РНКаз различного происхождения. Установленное нами снижение уровня АФК в клетках SiHa после инкубации с биназой в нетоксичной концентрации, по-видимому, тоже связано с этим механизмом. Наблюдаемое под действием биназы снижение уровня АФК в клетках SiHa, предшествующее снижению уровня глутатиона и индукции падения митохондриального потенциала, является еще одним подтверждением важности антиоксидантной активности РНКаз в реализации их цитотоксического действия.

Проапоптотический потенциал биназы

Более 200 белков млекопитающих участвует в тиол-дисульфидном обмене [33, 34]. Установлено, что S-глутатионилирование ингибирует активность ядерного фактора NF1, актина, транскрипционного фактора NF-êB, опухолевого супрессора р53 и киназы IêB (IKK). Функционирование клеточного актина происходит при посредничестве обратимого S-глутатионилирования, нарушение которого меняет структурную организацию стресс-фибрилл актинового цитоскелета [35]. Сохранение оптимального соотношения восстановленного глутатиона к окиcленному (GSH/GSSG) в клетке – ключевой фактор ее нормального функционирования. Дисбаланс GSH/GSSG, вызванный ингибированием синтеза GSH, приводит к редоксзависимой активации сигнальных путей ERK/JNK/p38 и запуску апоптоза [36–38]. Баланс GSH/GSSG сдвигается в сторону GSSG при развитии окислительного стресса, что индуцирует глутатионилирование белков [25]. Таким образом, повышенный уровень АФК, характерный для опухолевых клеток, индуцирует глутатионилирование белков, что в ряде случаев изменяет их функционирование. Так, глутатионилирование транскрипционного фактора р53 препятствует его связыванию с молекулой ДНК. Это приводит к тому, что опухолевые клетки реализуют механизм адаптации, который подавляет развитие апоптотического ответа на ранней стадии окислительного стресса, и тем самым избегают немедленной гибели [39]. Здесь нами показано, что снижение уровня АФК в клетках SiHa под действием биназы приводит к уменьшению степени глутатионилирования p53 (рис. 3в). Ранее V. Mitkevich и др. [18] показали, что под действием биназы в этих клетках снижалась экспрессия белка Е6 ВПЧ-16, что сопровождалось повышением уровня р53. Таким образом, биназа даже в низкой, нетоксичной концентрации оказывает проапоптотический эффект на клетки SiHa. Увеличение транскриптов белка p53 под действием биназы ранее было показано и на моделях опухолевых клеток HEKhSK4 [40].

Интересно отметить, что при инкубации с биназой уровень глутатионилирования мембранного белка Na,K-АТPазы возрастает (рис. 4а,б), а это, как показано нами ранее [25], приводит к ингибированию ее активности и, как следствие, снижению выживаемости опухолевых клеток. Возрастание глутатионилирования Na,K-АТPазы под действием биназы (0.8 мкМ) было нами показано ранее и на клетках Kasumi-1 миелогенного лейкоза [41]. Ключевая функция Na,K-АТPазы в клетке заключается в поддержании ионного гомеостаза и трансмембранного потенциала. В раковых клетках активность Na,K-АТPазы часто повышена в связи с особенностями их метаболизма. Во многих типах раковых клеток замечена активация каталитической α1-субъединицы этого фермента [42]. Кроме того, в опухолевых клетках некаталитическая β-субъединица Na,K-АТPазы играет ключевую роль в механизмах клеточной адгезии и миграции, а ее блокирование приводит к опухолевой инвазии и метастазированию [43]. В связи с этим Na,K-АТPаза может служить перспективной мишенью для противоопухолевой терапии. Кардиотонические стероиды (КТС), содержащиеся в том числе в организме человека, относятся к специфическим ингибиторам и регуляторам Na,K-АТРазы. Длительное время КТС применяли для лечения сердечной недостаточности, так как ингибирование Na,K-АТPазы и, как следствие, увеличение концентрации кальция приводит к усилению сердечных сокращений [44]. В ряде исследований показана эффективность таких КТС, как уабаин, дигиталин и буфалин, в лечении рака простаты [45, 46], хотя для некоторых препаратов этой группы повышен риск возникновения онкологических заболеваний [47]. Терапевтический индекс большинства КТС, обладающих противоопухолевой активностью, достаточно низок, что ограничивает перспективы их применения в лечении онкологических заболеваний. В то же время биназа в концентрации 0.8 мкМ блокирует активность Na,K-АТРазы, снижая адаптивный потенциал опухолевых клеток, что обосновывает возможность применения в противоопухолевой терапии даже малых доз этой РНКазы.

Митохондрии играют ключевую роль в инициации Bcl-2-зависимого механизма апоптоза опухолевых клеток. Падение митохондриального мембранного потенциала (∆Ψm) приводит к изменению проницаемости мембран, ускорению высвобождения апоптотических факторов (цитохром c, Smac/Diablo и AIF), активации каспаз и, как следствие, к гибели клеток [48]. Так, в диабетических кардиомиоцитах стресс-индуцированное окисление митохондриального GSH приводило к снижению ∆Ψm, активации каспазы-9 и каспазы-3 [49]. В клетках В-клеточной лимфомы человека АФК-зависимое снижение митохондриального глутатиона (mGSH) инициировало апоптоз и сопровождалось резким падением ∆Ψ, высвобождением цитохрома с и активацией каспазы-3 [50]. Нами показано, что в клетках SiHa через 72 ч инкубации с биназой снижается как уровень глутатиона, так и величина митохондриального потенциала, то есть нарушается работа митохондрий. Ранее показано, что индуцированный биназой апоптоз клеток Kasumi-1 и HEKhSK4 опосредован деполяризацией мембран митохондрий и повышением содержания Ca2+ внутри клеток [15, 51]. Вероятно, снижение митохондриального потенциала в клетках SiHa также служит ранним маркером последующих апоптотических изменений.

Таким образом, нами установлено, что биназа в низких концентрациях приводит к снижению уровня АФК, индуцируя снижение глутатионилирования p53, повышению уровня немодифицированного p53 и тем самым способствует восстановлению нормальной функции белка p53 в клетках SiHa – ВПЧ-16-положительной плоскоклеточной карциномы. Падение уровня восстановленного глутатиона под действием биназы, вероятно, вносит вклад в падение митохондриального потенциала, что индуцирует развитие митохондриального пути апоптоза. Под действием биназы уровень Na,K-АТPазы снижается и увеличивается доля глутатионилированной формы. Логично предположить, что это приводит к падению ферментативной активности Na,K-АТPазы в клетке, а значит и нарушению ионного гомеостаза. Следовательно, в низких концентрациях биназа снижает защитные свойства раковых клеток за счет нормализации работы редоксчувствительных систем и изменения глутатионилирования ряда белков. Полученные результаты позволяют рассматривать биназу в качестве агента, регулирующего редокс-баланс опухолевых клеток в составе комплексной терапии онкопатологий.

Работа выполнена в рамках программы “Приоритет-2030” Министерства науки и высшего образования Российской Федерации при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 21-74-10036) и гранта ICGEB (CRP/RUS20-01).

Настоящее исследование проводилось без использования биологических материалов, полученных от людей и животных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

A. I. Nadyrova

Kazan Federal University

Author for correspondence.
Email: alsu.nadyrova@yandex.ru

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, 420008

I. Y. Petrushanko

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: alsu.nadyrova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. A. Mitkevich

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: alsu.nadyrova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

O. N. Ilinskaya

Kazan Federal University

Email: alsu.nadyrova@yandex.ru

Institute of Fundamental Medicine and Biology

Russian Federation, Kazan, 420008

References

  1. Green R.M., Graham M., O’Donovan M.R., Chipman J.K., Hodges N.J. (2006) Subcellular compartmentalization of glutathione: correlations with parameters of oxidative stress related to genotoxicity. Mutagenesis. 21, 383–390. doi: 10.1093/mutage/gel043
  2. Kennedy L., Sandhu J.K., Harper M.E., Cuperlovic-Culf M. (2020) Role of glutathione in cancer: from mechanisms to therapies. Biomolecules. 10, 1429. doi: 10.3390/biom10101429.
  3. Schafer F.Q., Buettner G.R. (2001) Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radic. Biol. Med. 30, 1191–1212. doi: 10.1016/s0891-5849(01)00480-4
  4. Buettner G.R., Wagner B.A., Rodgers V.G. (2013) Quantitative redox biology: an approach to understand the role of reactive species in defining the cellular redox environment. Cell Biochem. Biophys. 67, 477–483. doi: 10.1007/s12013-011-9320-3
  5. Townsend D.M., Tew K.D., Tapiero H. (2003) The importance of glutathione in human disease. Biomed. Pharmacother. 57, 145–155. doi: 10.1016/S0753-3322(03)00043-X
  6. Vafa O., Wade M., Kern S., Beeche M., Pandita T.K., Hampton G.M., Wahl G.M. (2002) c-Myc can induce DNA damage, increase reactive oxygen species, and mitigate p53 function: a mechanism for oncogene-induced genetic instability. Mol. Cell. 9, 1031–1044. doi: 10.1016/S1097-2765(02)00520-8
  7. Weinberg F., Hamanaka R., Wheaton W.W., Weinberg S., Joseph J., Lopez M., Kalyanaraman B., Mutlu G., Budinger S., Chandel N.S. (2010) Mitochondrial metabolism and ROS generation are essential for Kras-mediated tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8788–8793. doi: 10.1073/pnas.1003428107
  8. Ballatori N., Krance S.M., Marchan R., Hammond C.L. (2009) Plasma membrane glutathione transporters and their roles in cell physiology and pathophysiology. Mol. Aspects Med. 30, 13–28. doi: 10.1016/j.mam.2008.08.004
  9. Mieyal J.J., Gallogly M.M., Qanungo S., Sabens E.A., Shelton M.D. (2008) Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein S-glutathionylation. Antioxid. Redox Signal. 10, 1941–1988. doi: 10.1089/ars.2008.2089
  10. Miller O.G., Mieyal J.J. (2015) Sulfhydryl-mediated redox signaling in inflammation: role in neurodegenerative diseases. Arch. Toxicol. 89, 1439–1467. doi: 10.1007/s00204-015-1496-7
  11. Xue X., Wang B., Du W., Zhang C., Song Y., Cai Y., Cen D., Wang L., Xiong Y., Jiang P., Zhu S., Zhao K.N., Zhang L. (2016) Generation of affibody molecules specific for HPV16 E7 recognition. Oncotarget. 7, 73995–74005. doi: 10.18632/oncotarget.12174
  12. Wondrak G.T. (2009) Redox-directed cancer therapeutics: molecular mechanisms and opportunities. Antioxid. Redox Signal. 11, 3013–3069. doi: 10.1089/ars.2009.2541
  13. Tew K.D., Townsend D.M. (2011) Redox platforms in cancer drug discovery and development. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 156–161. doi: 10.1016/j.cbpa.2010.10.016
  14. Mironova N.L., Petrushanko I.Y., Patutina O.A., Sen’kova A.V., Simonenko O.V., Mitkevich V.A., Markov O.V., Zenkova M.A., Makarov A.A. (2013) Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells. Cell Cycle. 12, 2120–2131. doi: 10.4161/cc.25164
  15. Mitkevich V.A., Kretova O.V., Petrushanko I.Y., Burnysheva K.M., Sosin D.V., Simonenko O.V., Ilinskaya O.N., Tchurikov N.A., Makarov A.A. (2013) Ribonuclease binase apoptotic signature in leukemic Kasumi-1 cells. Biochimie. 95, 1344–1349. doi: 10.1016/j.biochi.2013.02.016
  16. Бурнышева К.М., Петрушанко И.Ю., Спирин П.В., Прасолов В.С., Макаров А.А., Митькевич В.А. (2016) Рибонуклеаза биназа вызывает гибель клеток острого Т-лимфобластного лейкоза, индуцируя в них апоптоз. Молекуляр. биология. 50, 347–352. doi: 10.7868/S0026898416020038
  17. Шульга А.А., Окороков А.Л., Панов К.И., Курбанов Ф.Т., Чернов Б.К., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П. (1994) Суперпродукция рибонуклеазы Bacillus intermedius 7P (биназы) в E. coli. Молекулярная биология. 28(2), 453–463.
  18. Mitkevich V.A., Burnysheva K.M., Petrushanko I.Y., Adzhubei A.A., Schulga A.A., Chumakov P.M., Makarov A.A. (2017) Binase treatment increases interferon sensitivity and apoptosis in SiHa cervical carcinoma cells by downregulating E6 and E7 human papilloma virus oncoproteins. Oncotarget. 8, 72666–72675. doi: 10.18632/oncotarget.20199
  19. Pal D., Rai A., Checker R., Patwardhan R.S., Singh B., Sharma D., Sandur S.K. (2021) Role of protein S-glutathionylation in cancer progression and development of resistance to anti-cancer drugs. Arch. Biochem. Biophys. 704, 108890. doi: 10.1016/j.abb.2021.108890
  20. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova V., Kayumov A., Barreto G. (2016) Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase). Biochim. Biophys. Acta. 1863, 1559–1567. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.04.005
  21. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V., Fedorova T.V., Kretova O.V., Tchurikov N.A., Prassolov V.S., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. (2011) Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and АML1-ETO oncogenes. Cell Cycle. 10, 4090–4097. doi: 10.4161/cc.10.23.18210
  22. Митькевич В.А., Орлова Н.Н., Петрушанко И.Ю., Симоненко О.В., Спирин П.В., Прокофьева М.М., Горностаева А.С., Stocking C., Макаров А.А., Прасолов В.С. (2013) Экспрессия онкогена FLT3-ITD сообщает предшественникам B-клеток мыши линии BAF3 чувствительность к цитотоксическому действию биназы. Молекуляр. биология. 47, 282–282. https://doi.org/10.7868/s0026898413020092
  23. Zur Hausen H. (2002) Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat. Rev. Cancer. 2, 342–350. doi: 10.1038/Nrc798
  24. Velu C.S., Niture S.K., Doneanu C.E., Pattabiraman N., Srivenugopal K.S. (2007) Human p53 is inhibited by glutathionylation of cysteines present in the proximal DNA-binding domain during oxidative stress. Biochemistry. 46, 7765–7780. doi: 10.1021/bi700425y
  25. Petrushanko I.Y., Yakushev S., Mitkevich V.A., Kamanina Y.V., Ziganshin R.H., Meng X., Anashkina A.A., Makhro A., Lopina O.D., Gassmann M., Makarov A.A., Bogdanova A. (2012) S-glutathionylation of the Na, K-ATPase catalytic α subunit is a determinant of the enzyme redox sensitivity. J. Biol. Chem. 287, 32195–32205. doi: 10.1074/jbc.M112.391094
  26. Alevizopoulos K., Calogeropoulou T., Lang F., Stournaras C. (2014) Na+/K+ ATPase inhibitors in cancer. Curr. Drug Targets. 15, 988–1000. doi: 10.2174/1389450115666140908125025
  27. Bejček J., Spiwok V., Kmoníčková E., Rimpelová S. (2021) Na+/K+-ATPase revisited: on its mechanism of action, role in cancer, and activity modulation. Molecules. 26, 1905. doi: 10.3390/molecules26071905
  28. Lushchak V.I. (2012) Glutathione homeostasis and functions: potential targets for medical interventions. J. Amino Acids. 2012, 736837. doi: 10.1155/2012/736837
  29. Zou J., Shang X., Li C., Ouyang J., Li B., Liu X. (2019) Effects of cadmium on mineral metabolism and antioxidant enzyme activities in Salix matsudana Koidz. Pol. J. Environ. Stud. 28, 989–999. doi: 10.15244/pjoes/81697
  30. Allocati N., Masulli M., Di Ilio C., Federici L. (2018) Glutathione transferases: substrates, inihibitors and pro-drugs in cancer and neurodegenerative diseases. Oncogenesis. 7, 8. doi: 10.103/s41389-017-0025-3
  31. Ardelt B., Juan G., Burfeind P., Salomon T., Wu J.M., Hsieh T.C., Li X., Sperry R., Pozarowski P., Shogen K., Ardelt W., Darzynkiewicz Z. (2007) Onconase, an anti-tumor ribonuclease suppresses intracellular oxidative stress. Int. J. Oncol. 31, 663–669. doi: 10.3892/ijo.31.3.663
  32. Tsai S.Y., Ardelt B., Hsieh T.C., Darzynkiewicz Z., Shogen K., Wu J.M. (2004) Treatment of Jurkat acute T-lymphocytic leukemia cells by onconase (Ranpirnase) is accompanied by an altered nucleocytoplasmic distribution and reduced expression of transcription factor NF-B. Int. J. Oncol. 25, 1745–1752. doi: 10.3892/ijo.25.6.1745
  33. Fratelli M., Gianazza E., Ghezzi P. (2004) Redox proteomics: identification and functional role of glutathionylated proteins. Expert Rev. Proteomics. 1, 365–376. doi: 10.1586/14789450.1.3.365
  34. Dalle-Donne I., Rossi R., Giustarini D., Colombo R., Milzani A. (2007) S-glutathionylation in protein redox regulation. Free Radic. Biol. Med. 43, 883–898. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2007.06.014
  35. Fiaschi T., Cozzi G., Raugei G., Formigli L., Ramponi G., Chiarugi P. (2006) Redox regulation of β-actin during integrin-mediated cell adhesion. J. Biol. Chem. 281, 22983–22991. doi: 10.1074/jbc.M603040200
  36. Lu G.D., Shen H.M., Chung M.C., Ong C.N. (2007) Critical role of oxidative stress and sustained JNK activation in aloe-emodin-mediated apoptotic cell death in human hepatoma cells. Carcinogenesis. 28, 1937–1945. doi: 10.1093/carcin/bgm143
  37. Cuadrado A., Garcia-Fernandez L.F., Gonzalez L., Suarez Y., Losada A., Alcaide V., Martinez T., Fernandez-Sousa J.M., Sanchez Puelles J.M., Munoz A. (2003) Aplidin induces apoptosis in human cancer cells via glutathione depletion and sustained activation of the epidermal growth factor receptor, Src, JNK, and p38 MAPK. J. Biol. Chem. 278, 241–250. doi: 10.1074/jbc.M201010200
  38. Ji L., Shen K., Jiang P., Morahan G., Wang Z. (2011) Critical roles of cellular glutathione homeostasis and jnk activation in andrographolide-mediated apoptotic cell death in human hepatoma cells. Mol. Carcinog. 50, 580–591. doi: 10.1002/mc.20741
  39. Velu C.S., Niture S.K., Doneanu C.E., Pattabiraman N., Srivenugopal K.S. (2007) Human p53 is inhibited by glutathionylation of cysteines present in the proximal DNA-binding domain during oxidative stress. Biochemistry. 46, 7765–7780. doi: 10.1021/bi700425y
  40. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Kretova O.V., Zelenikhin P.V., Prassolov V.S., Tchurikov N.A., Ilinskaya O.N., Makarov A.A. (2010) Oncogenic c-kit transcript is a target for binase. Cell Cycle. 9, 2674–2678. doi: 10.4161/cc.9.13.12150
  41. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Makarov A.A. (2019) RNases disrupt the adaptive potential of malignant cells: perspectives for therapy. Front. Pharmacol. 10, 922. doi: 10.3389/fphar.2019.00922
  42. Mijatovic T., Dufrasne F., Kiss R. (2012) Na+/K+-ATPase and cancer. Pharm. Pat. Anal. 1, 91–106. doi: 10.4155/ppa.12.3
  43. Eskiocak U., Ramesh V., Gill J.G., Zhao Z., Yuan S.W., Wang M., Vandergriff T., Shackleton M., Quintana E., Frankel A., Johnson T., DeBerardinis R., Morrison S.J. (2016) Synergistic effects of ion transporter and MAP kinase pathway inhibitors in melanoma. Nat. Commun. 7, 12336. doi: 10.1038/ncomms12336
  44. Ren J., Gao X., Guo X., Wang N., Wang X. (2022) Research progress in pharmacological activities and applications of cardiotonic steroids. Front. Pharmacol. 13, 902459. doi: 10.3389/fphar.2022.902459
  45. Ayogu J.I., Odoh A.S. (2020) Prospects and therapeutic applications of cardiac glycosides in cancer remediation. ACS Comb. Sci. 22, 543–553. doi: 10.1021/acscombsci.0c00082
  46. Chang Y.M., Shih Y.L., Chen C.P., Liu K.L., Lee M.H., Lee M.Z., Hou H.T., Huang H.C., Lu H.F., Peng S.F.., Chen K.W., Yeh M.Y., Chung J.G. (2019) Ouabain induces apoptotic cell death in human prostate DU 145 cancer cells through DNA damage and TRAIL pathways. Environ. Toxicol. 34, 1329–1339. doi: 10.1002/tox.22834
  47. Osman M.H., Farrag E., Selim M., Osman M.S., Hasanine A., Selim A. (2017) Cardiac glycosides use and the risk and mortality of cancer; systematic review and meta-analysis of observational studies. PloS One. 12, e0178611. doi: 10.1371/journal.pone.0178611
  48. Ortega A.L., Mena S., Estrela J.M. (2011) Glutathione in cancer cell death. Cancers. 3, 1285–1310. doi: 10.3390/cancers3011285
  49. Ghosh S., Pulinilkunnil T., Yuen G., Kewalramani G., An D., Qi D., Abrahani A., Rodrigues B. (2005) Cardiomyocyte apoptosis induced by short-term diabetes requires mitochondrial GSH depletion. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H768–H776. doi: 10.1152/ajpheart.00038.2005
  50. Armstrong J.S., Steinauer K.K., Hornung B., Irish J.M., Lecane P., Birrell G.W., Peehl D.M., Knox S.J. (2002) Role of glutathione depletion and reactive oxygen species generation in apoptotic signaling in a human B lymphoma cell line. Cell Death Differ. 9, 252–263. doi: 10.1038/sj.cdd.4400959
  51. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. (2008) Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. BioEssays. 30, 781–790. doi: 10.1002/bies.20789

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Cytofluorimetric analysis of ROS (a) and reduced glutathione (б) content in SiHa cells incubated with binase (0.8 μM) for 24, 48, and 72 h. Results are presented as the fluorescence signal of DHR123 (ROS) and ThiolTrackerTM Violet (GSH) dyes obtained from cells incubated with binase relative to untreated cells. *p ≤ 0.05.

Download (246KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Cytofluorimetric analysis of the content of cells with reduced mitochondrial potential (a) and dead cells (б) after treatment with binase (0.8 μM) for 24, 48 and 72 h. *p ≤ 0.05.

Download (255KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Effect of binase on the levels of HPV-16 E6 and p53 proteins in SiHa cells. a – Electrophoretic analysis of proteins in SiHa cell lysates. Here and below: M – molecular weight markers of proteins PageRuler Prestained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, USA), control – untreated cells; binase – cells were incubated with 0.8 μM binase for 48 h. б – Relative content of p53 and E6 proteins in lysates of SiHa cells treated with binase. The level of the corresponding proteins in the control is taken as 100%. в – Change in the degree of glutathionylation of the p53 protein (GSS-p53) upon treatment of SiHa cells with binase. The fold change was calculated as GSS-p53/p53; the value of GSS-p53/p53 in the control is taken as one. *p ≤ 0.05.

Download (154KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Effect of binase on the level of α1-subunit of Na,K-ATPase in SiHa cells. a – Electrophoretic analysis of the content of α1-subunit of Na,K-ATPase in SiHa cells. For designations, see the legend to Fig. 3. Change in the degree of glutathionylation (б) and content (в) of α1-subunit of Na,K-ATPase in lysates of SiHa cells treated with binase. The values ​​in the control are taken as one. *p ≤ 0.05.

Download (85KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».