Том 92, № 4 (2023)

Планктомицеты являются типичными обитателями северных болотных экосистем. В настоящей работе новый планктомицет рода Paludisphaera, штамм Pla2^T, был выделен из низинного болота бореальной зоны России. Изолят был представлен розово-пигментированными, одиночными или собранными в небольшие группы неподвижными сферическими клетками, размножающимися почкованием. Штамм Pla2^T являлся хемоорганотрофным психротолерантным мезофилом с оптимумом роста при pH 5.5‒6 и температуре 15‒20°C. Предпочтительными ростовыми субстратами нового планктомицета являлись полисахариды ксилан, ксантановая камедь и фитагель, а также некоторые сахара. Наиболее высокое сходство последовательности гена 16S рРНК штамма Pla2^T (97.9%) наблюдалось с последовательностью планктомицета “Paludisphaera soli” JC670^Т, выделенного из почвы высокогорья Гималаев. С другими представителями рода Paludisphaera, “P. rhizosphae-rae” JC665^Т и P. borealis PX4^Т, это сходство составляло 97.0 и 93.8% соответственно. Геном штамма Pla2^T, размером 8.21 млн п.о., содержал около 6.5 тыс. белок-кодирующих генов и 3 копии оперона рРНК. Содержание пар Г + Ц в ДНК составляло 67 мол. %. Сходство нуклеотидных последовательностей генома штамма Pla2^Т и ранее описанных представителей рода Paludisphaera составило от 79.4 до 82.6%. Эти генотипические отличия, а также ряд фенотипических особенностей позволили отнести планктомицет из низинного болота к новому виду рода Paludisphaera, Paludisphaera mucosa sp. nov. с типовым штаммом Pla2^T (=KCTC92668^T = VKM B-3698^T).

В результате проведенного исследования впервые установлена роль структурных groESL, dnaJ и регуляторного генов hrcA, кодирующих синтез белков теплового шока, в синтезе биосурфактантов бактериями R. pyridinivorans 5Ар. Для регуляторного белка, кодируемого геном hrcA, сайты связывания CIRCE выявлены в промоторных участках генов groESL, groEL2 и fmdB. Установлено, что по сравнению с температурой 28°С в поздней логарифмической фазе роста в среде с гексадеканом при 42°С экспрессия генов groESL и groEL2 возрастала в 4.4 и в 5.3 раза соответственно. В то же время при разных температурных режимах (28 и 42°С) изменение экспрессии генов hrcA и fmdB не регистрировали. В отсутствии негативного регулятора HrcA увеличивалась экспрессия генов groESL в 14.4 и 3.5 раза, гена groEL2 – в 9.6 и 2.7 раза и гена fmdB – в 1.82 и 2.52 раза при температуре 28 и 42°С соответственно. Продукты генов dnaJ и hrcA необходимы для синтеза трегалолипидов при разных температурных режимах, причем их роль возрастала при повышенной температуре (у мутанта с нарушенным геном dnaJ синтез трегалолипидов при температуре 28 и 42°С снижался в 1.8 и в 2.5 раз соответственно, а у мутанта с нарушенным геном hrcA – в 1.5 и в 6.6 раз соответственно). В то же время эмульгирующая активность не изменялась у всех мутантных вариантов при 28°С и уменьшалась при температуре 42°С в 1.4 и 1.9 раз, соответственно, у мутантов с нарушенным геном groESL и hrcA. Полученные результаты свидетельствуют о сложной химической природе биоПАВ, продуцируемых бактериями R. pyridinivorans 5Ар (эмульгаторы, включающие трегалолипиды и соединения иного химического состава). В синтезе этих соединений при разных температурных режимах ключевую роль играют шапероны Gro и регуляторный белок HrcA, тогда как продукт гена dnaJ необходим только для синтеза трегалолипидов.

Экзополифосфатаза Ррх1 дрожжей ‒ конститутивный белок, локализованный преимущественно в цитоплазме. Очищенный фермент гидролизует неорганические полифосфаты с высокой активностью, но у нокаут-мутанта ∆ppx1 Saccharomyces cerevisiae не выявлено изменений в физиологических свойствах. С целью выяснения функций этого фермента мы изучили физиологические особенности штамма Saccharomyces cerevisiae, сверхэкcпрессирующего полифосфатазу Ppx1. При культивировании на среде YPD штамм не проявил особенностей роста по сравнению с родительским штаммом. В клетках S. cerevisiae, сверхэкспрессирующих полифосфатазу Ррх1, в стационарной фазе роста в 9 раз увеличился уровень АТФ, значительно снизилась активность вакуолярной АТФазы, увеличилась чувствительность к перекиси по сравнению с родительским штаммом. Уровень АФК при этом был почти вдвое выше, чем у родительского штамма, по степени окисленности липидов различий не наблюдали. Cверхэкспрессия Рpx1 в использованных условиях культивирования не повлияла на уровень полифосфатов, поэтому эти полимеры не являются регуляторами вышеописанных изменений. Известно, что реакции на окислительный стресс и активность вакуолярной АТФазы у дрожжей регулируются цАМФ, а Ррх1 способна к гидролизу этого сигнального соединения. Мы предполагаем, что одной из функция Ррх1 в клетках дрожжей является участие в регуляции уровня цАМФ. В связи с тем, что сверхэкcпрессирующий Ррх1 штамм не отличался от родительского по содержанию неорганических полифосфатов, предположено, что наблюдаемые изменения обусловлены влиянием этого фермента на уровень цАМФ, который является его субстратом.

В результате исследования установлено, что бактерии Rhodococcus pyridinivorans 5Ар дикого типа являются высокоэффективными деструкторами нафталина и полностью утилизируют данное соединение в концентрации 500 мг/л в течение трех суток, что может быть использовано для очистки загрязненных нафталином водных экосистем. Инактивация генов биодеградации narAa (кодирует большую субъединицу нафталиндиоксигеназы) и narB (кодирует цис-нафталиндигидродиолдегидрогеназу) приводит к потере бактериями R. pyridinivorans 5Ар способности утилизировать нафталин в качестве единственного источника углерода. Это указывает на отсутствие в геноме исследуемых бактерий детерминант, обеспечивающих окисление нафталина по альтернативным путям. Помимо этого, инактивация гена narB приводит к накоплению в культуральной среде полярного окрашенного соединения (вероятно, продукта первичного окисления нафталина).