Том 54, № 6 (2023)

Арил-гидрокарбоновый (диоксиновый) рецептор Aryl hydrocarbon receptor, AHR является лиганд-зависимым транскрипционным фактором, чьи гены-мишени играют основополагающую роль в детоксикации организма, регуляции процессов развития, поддержании гомеостаза, а также в возникновении онкологических и аутоиммунных заболеваний и метаболизме лекарственных соединений. Высокий консерватизм AHR позвоночных позволил нам исследовать его функции in vivo, используя особей Drosophila melanogaster, трансформированных геном AHR человека или мыши, и сравнить эктопический эффект их экспрессии с экспрессией гена spineless, гомолога AHR дрозофилы. В работе впервые показано, что в эмбриогенезе дрозофилы, в ножных имагинальных дисках и в соматических клетках половой системы самок AHR позвоночных проявляет свою функциональную активность в отсутствии экзогенных лигандов.

Ген germes – маркер половой плазмы и первичных половых клеток (ППК), описанный у шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Известно, что оверэкспрессия его мутантной формы негативно влияет на формирование и миграцию ППК. Однако до сих пор не было известно, насколько широко этот ген представлен у животных разных филогенетических групп. В данной работе был проведен биоинформатический анализ геномных и транскриптомных последовательностей животных, имеющих половую плазму. Оказалось, что гомологи germes имеются только у представителей родов Xenopus и Hymenochirus семейства Pipidae (отряд Anura). Полученные результаты подтверждены путем ОТ-ПЦР-анализа экспрессии ортологов germes в яичниках шести представителей разных семейств Anura. Филогенетический анализ клонированных последовательностей гомологов germes говорит о появлении этого гена у предков Pipidae и вторичной его утрате в роде Pseudohymenochirus. Также показано, что аминокислотные последовательности функциональных доменов белка Germes в значительной степени консервативны.

Дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), полученных от пациентов и условно здоровых доноров, позволяет изучать генетические аномалии in vitro. Ранее мы описали клинический случай привычного невынашивания беременности у пациентки с асимметричной инактивацией Х-хромосомы в периферических лимфоцитах, буккальном эпителии и эндометрии. C помощью aCGH мы выявили микроделецию в Xq24 размером 239 т.п.н., затрагивающую восемь генов, включая UBE2A. Мы получили линию ИПСК iTAF15Xsk4 из фибробластов кожи пациентки с помощью не интегрирующихся эписомных векторов. Линия ИПСК имела нормальный кариотип, экспрессировала маркеры плюрипотентности и при дифференцировке в эмбриоидные тельца экспрессировала маркеры всех трех зародышевых листков. Полученную линию можно использовать для изучения синдрома дефицита гена UBE2A.

Редактирование геномов плюрипотентных стволовых клеток человека с применением программируемых нуклеаз позволяет создавать модели наследственных патологий с помощью направленного трансгенеза, нокаута генов и замены отдельных нуклеотидов в последовательностях ДНК. С использованием CRISPR/SpCas9-опосредованной гомологичной рекомбинации в локусе AAVS1 были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека ICGi022-A (Malakhova et al., 2020), которые несут трансгены двух вариантов нуклеазы AsCas12a (также известной как AsCpf1), распознающих разные консенсусы PAM (ICGi022-A-6 (AsCas12a, PAM 5'-TTTV-3') и ICGi022-A-7 (AsCas12a, PAM 5'-TYCV-3')), и трансген обратного доксициклин-зависимого трансактиватора M2rtTA. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что добавление в культуральную среду доксициклина вызывает активацию экспрессии белков AsCas12a(TTTV) и AsCas12a(TYCV). Полученные трансгенные клоны ИПСК были подвергнуты молекулярно-генетическому и цитогенетическому анализу. С помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимического анализа было показано, что в них наблюдается высокий уровень экспрессии мРНК генов-маркеров плюрипотентных клеток – OCT4, NANOG и SOX2, а также специфичная экспрессия белков-маркеров – OCT4, SOX2, SSEA-4 и TRA-1-60. Кроме того, с помощью метода спонтанной дифференцировки ИПСК в эмбриоидных тельцах, было установлено, что трансгенные клоны могут давать производные всех трех примитивных зародышевых листков: эктодермы, мезодермы и энтодермы. Цитогенетический анализ показал, что трансгенные клоны ИПСК имеют нормальный кариотип 46,XX.