Том 41, № 2 (2024)

Первой стадией выхода зрелых нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга в кровь и последующей миграции в очаг воспаления является прикрепление к эндотелию сосудов. Эндо- и экзогенные факторы модифицируют способность клеток к адгезии через рецепторы разного типа, включая никотиновые рецепторы ацетилхолина (нАХР). Однако участие нАХР в регуляции адгезии гранулоцитов костного мозга (КМ-гранулоцитов) и роль сигнальных компонентов в действии никотина исследованы мало. Целью данной работы явилось изучение роли нАХР разных типов в регуляции адгезии КМ-гранулоцитов мыши при остром воспалении. Работа проведена на КМ-гранулоцитах мышей линии BALB/c с применением статической адгезионной пробы, конфокальной микроскопии, ингибиторного анализа, ПЦР с обратной транскрипцией. Роль типов нАХР оценена с помощью селективных антагонистов: 10 нМ α-CTX (α7), 10 нМ GIC и 5 нМ MII (α3β2), 200 нМ MII (α3β2 и α7), RgIA и Vc1.1 (α9α10). Показано, что количество прикрепившихся КМ-гранулоцитов, оцениваемое по оптической плотности, не различалось у животных с острым воспалением и без него. Никотин (0.01–100 мкМ, 30 мин) значительно усиливал адгезию клеток животных контрольной и “воспалительной” групп. Токсины α-CTX, RgIA и Vc1.1 усиливали адгезивность клеток мышей обеих групп, как и 200 нМ MII – в контрольной группе. В пробах с флуоресцентным мечением показана экспрессия субъединиц α7 и α10 нАХР на мембране нативных КМ-гранулоцитов. С помощью ингибиторов обнаружено, что действие никотина на адгезию КМ-гранулоцитов опосредовано гетеротримерными G-белками, PKC, PI3K и ROCK как в норме, так и при наличии воспаления. В регуляции адгезии КМ-гранулоцитов мыши участвуют преимущественно α7 и α9α10 типы нАХР, вклад α3(α6*)β2 незначителен, возможно вследствие низкой экспрессии α3/α6*-субъединиц. Роль α7 нАХР, присутствующих на мембране КМ-гранулоцитов конвенционально, в регуляции адгезивности клеток никотином усиливается при развитии воспаления в организме.

Липидные капли – это органеллы, отвечающие за накопление и расщепление нейтральных жиров в организме человека. Липидные капли имеют монослойную оболочку из фосфолипидов, препятствующую их спонтанному слиянию. Слияние липидных капель осуществляется специализированными белками слияния и регулируется липидным составом монослойной оболочки. Эффективность слияния определяется энергией, затрачивающейся на локальное сближение липидных капель и топологическую перестройку их оболочек. В данной работе слияние монослойных оболочек моделируется в рамках теории упругости мембран. Энергетический барьер на слияние рассчитывается при различных условиях, моделирующих возможные составы монослойных оболочек, а также воздействие белков. Результаты расчетов показывают, что высота барьера в наибольшей степени зависит от расстояния между липидными каплями, которое определяется белками слияния. Липидный состав также влияет на характерное время ожидания слияния и может изменять его в несколько десятков раз, что соответствует полученным ранее данным по бислойному слиянию.

Одним из факторов риска при инфекции, вызванной SARS-CoV-2, является гиперактивация системы комплемента, которая может приводить к активации и повреждению эндотелия, тромбозу и, в ряде тяжелых случаев, развитию полиорганной недостаточности. Методом количественной иммуноцитохимии мы исследовали опсонизацию факторами комплемента С3/С3b эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) при воздействии на них плазмы крови пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19, чтобы оценить возможность использования данного подхода к изучению состояния системы комплемента при COVID-19 ex vivo. Для этих целей были использованы FITC-меченые антитела, специфичные к С3с домену факторов С3/С3b. В качестве параметров для оценки связывания С3/С3b с клетками были выбраны интегральная интенсивность регистрируемой флуоресценции и число С3/С3b- иммунопозитивных структур. Мы показали, что при инкубации HUVEC с плазмой больных общее число C3/C3b-иммунопозитивных структур, регистрируемых на мембране этих клеток, в 5.8±2.8 раз (mean ± SD, p < 0.001) выше, чем при воздействии плазмы здоровых людей. При этом интегральная интенсивность флуоресценции возрастала в 6.3±3.2 раз (mean ± SD, p ≤ 0.0001) по сравнению с контролем. Площадь иммунопозитивных структур, регистрируемых после воздействия на клетки плазмы здоровых доноров и больных COVID-19 и выбранных для анализа, составляла от 2.2 до 70 мкм². Иммунопозитивные частицы площадью 2.2–10.9 мкм² после инкубации с плазмой больных COVID-19 имели более вытянутую форму в сравнении с контролем. Среднее число частиц на клетку составляло в контроле 0.49 ± 0.06 (mean±SD, n = 6), при инкубации с плазмой больных 2.4 ± 0.4 (mean ± SD, n = 13 р < 0.001). Анализ распределения частиц по площади показал, что наиболее выраженные отличия в количестве C3/C3b-иммунопозитивных структур в сравнении с контролем наблюдались среди крупных частиц. Таким образом, мы показали рост уровня опсонизации эндотелиальных клеток факторами комплемента С3/С3b в присутствии плазмы больных COVID-19 в сравнении с контрольной плазмой. Прирост обусловлен увеличением числа C3/C3b-иммунопозитивных структур, в большей степени крупных. Мы предполагаем, что разработанный нами подход позволит исследовать роль системы комплемента в повреждении клеток эндотелия сосудов у больных COVID-19 на модели ex vivo, а также оценивать уровень активации комплемента в плазме больных и эффективность их лечения.

Установлено, что циклический аденозин монофосфат (cAMP) и ионы кальция (Са²⁺) способны дозозависимо модулировать активность различных форм супероксиддисмутазы (СОД) в клетках корня проростков гороха сорта Рондо. Влияние cAMP на активность СОД исследовали на интактных проростках, инкубируя их корни в растворе жирорастворимого аналога cAMP н-дибутирил-cAMP, что приводило к повышению внутриклеточной концентрации cAMP, а общая активность СОД, измеряемая в супернатанте, полученном из гомогената корней, возрастала до 230%. Инкубация аналогичных корней в растворе ингибитора трансмембранной аденилатциклазы сурамина существенно снижала эндогенный уровень cAMP, а активность СОД уменьшалась до 40%. В работе проводили ингибиторный анализ СОД: в присутствии 3мМ KCN или 3мМ Н₂О₂ активность этого фермента уменьшалась на 40 или 50%. Инкубация проростков в растворе LaCl₃ приводила к снижению общей активности СОД до 73%, ингибиторы незначительно уменьшали активность фермента. Предварительная обработка проростов 1мМ EGTA снижала общую активность СОД до 68%, а ингибиторы фермента не оказывали никакого дополнительного эффекта. Влияние недостатка или избытка Са²⁺ на активность СОД изучали в гомогенате корней проростков гороха. 100 мМ EGTA снижал активность этого фермента до 81%, а ингибиторы СОД (Н₂О₂ и KCN) уменьшали ее активность до 65 и 51% соответственно. Добавление к гомогенату 500 нМ CaCl₂ незначительно повышало общую активность СОД, при этом KCN немного уменьшал активность фермента. Добавление 500 мкМ CaCl₂ не изменяло активность СОД, применение на этом фоне KCN снижало ее на 30%, а добавление Н₂О₂ не влияло на активность фермента. Сделан вывод о том, что cAMP оказывает косвенное влияние на активность СОД, тогда как ионы кальция, вероятно, воздействуют непосредственно на активный центр молекулы фермента; при этом каждая форма СОД отличается по чувствительности к кальцию.

Белок эндофилин А, который в геноме млекопитающих кодируется тремя генами – эндофилин А1, А2 и А3, участвует в регуляции синаптического цикла на стадиях экзо- и эндоцитоза и присутствует в резервном пуле синаптических везикул (СВ), где его функция не ясна. Эксперименты, проведенные in vitro, позволяют предполагать, что посредством SH3-домен-опосредованных взаимодействий эндофилин А обеспечивает вхождение ряда белков в состав жидкой белковой фазы, организующей СВ в резервном пуле. Мы исследовали эффект удаления генов эндофилина и одного из его партнеров, участвующих в этих взаимодействиях, ‒ динамина, на организацию СВ в синапсах, образованных кортикальными нейронами в культуре. Исследования показали, что удаление генов эндофилина не приводит к изменениям плотности СВ в резервном пуле. В то же время удаление генов динамина 1 и динамина 3 вызывает значительное увеличение плотности везикул. Мы предполагаем, что функции эндофилина в синапсах дополняются другими SH3-домен-содержащими белками, которые являются компонентами белковой жидкой фазы резервного пула СВ.