The Mechanism of Calcium-Activated Chloride ANO6 Channel Inhibition by CaCCinh-A01

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Proteins of the anoctamine family (ANO) form calcium-activated chloride channels (CaCC) and phospholilpid scramblases. The ANO6 (TMEM16F) protein, which combines the functions of a calcium-dependent scramblase and those of an ion channel, is considered as a molecular target for the treatment of blood clotting disorders, COVID-19-associated pneumonia, neurodegenerative diseases, and other pathologies. CaCCinh-A01, which is a channel blocker of the ANO family, is studied as a potential pharmacological drug. Previously, the effect of this inhibitor was studied using methods representing the integral ion current through the membrane, which does not allow the properties of single channels to be distinguished. Therefore, it remains unknown which characteristics of single channels are sensitive to the blocker: channel open probability, the current amplitude, or the dwelling time of the channel open state. By registration of single ANO6 channels in HEK293 cells, we showed that the action of the inhibitor is due to a decrease in both the current amplitude and the open state dwelling time of single ANO6 channels, which, in turn, leads to a decrease in their open state probability. Thus, we have characterized the mechanism of current reduction through ANO6 channels by the inhibitor CaCCinh A01.

Full Text

Restricted Access

About the authors

D. O. Kolesnikov

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: shalygin.alexey@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

E. R. Grigorieva

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: shalygin.alexey@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

M. A. Nomerovskaya

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: shalygin.alexey@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

D. S. Reshetin

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: shalygin.alexey@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

A. V. Shalygin

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: shalygin.alexey@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

E. V. Kaznacheyeva

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: evkazn@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

References

  1. Kalienkova V., Clerico Mosina V., Paulino C. 2021.The groovy TMEM16 family: Molecular mechanisms of lipid scrambling and ion conduction. J. Mol. Biol. 433, 166941.
  2. Yang H., Kim A., David T., Palmer D., Jin T., Tien J., Huang F., Cheng T., Coughlin S.R., Jan Y.N., Jan L.Y. 2012. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation. Cell. 151, 111–122.
  3. Kostritskii A.Y., Machtens J.P. 2021. Molecular mechanisms of ion conduction and ion selectivity in TMEM16 lipid scramblases. Nat. Commun. 12, 2826.
  4. Zhang Y., Le T., Grabau R., Mohseni Z., Kim H., Natale D.R., Feng L., Pan H., Yang H. 2020. TMEM16F phospholipid scramblase mediates trophoblast fusion and placental development. Sci. Adv. 6, 19.
  5. Ousingsawat J., Wanitchakool P., Kmit A., Romao A.M., Jantarajit W., Schreiber R., Kunzelmann K. 2015. Anoctamin 6 mediates effects essential for innate immunity downstream of P2X7 receptors in macrophages. Nat. Commun. 6, 6245.
  6. Ousingsawat J., Wanitchakool P., Schreiber R., Wuelling M., Vortkamp A., Kunzelmann K. 2015. Anoctamin-6 controls bone mineralization by activating the calcium transporter NCX1. J. Biol. Chem. 290, 6270–6280.
  7. Cabrita I., Benedetto R., Schreiber R., Kunzelmann K. 2019. Niclosamide repurposed for the treatment of inflammatory airway disease. JCI Insight. 4, e128414.
  8. Braga L., Ali H., Secco I., Chiavacci E., Neves G., Goldhill D., Penn R., Jimenez-Guardeño J.M., Ortega-Prieto A.M., Bussani R., Cannatà A., Rizzari G., Collesi C., Schneider E., Arosio D., Shah A.M., Barclay W.S., Malim M.H., Burrone J., Giacca M. 2021. Drugs that inhibit TMEM16 proteins block SARS-CoV-2 spike-induced syncytia. Nature. 594, 88–93.
  9. Zhang Y., Li H., Li X., Wu J., Xue T., Wu J., Shen H., Li X., Shen M., Chen G. 2020. TMEM16F aggravates neuronal loss by mediating microglial phagocytosis of neurons in a rat experimental cerebral ischemia and reperfusion model. Front. Immunol. 11, 1144.
  10. De La Fuente R., Namkung W., Mills A., Verkman A.S. 2008. Small-molecule screen identifies inhibitors of a human intestinal calcium-activated chloride channel. Mol. Pharmacol. 73, 758–768.
  11. Shi S., Guo S., Chen Y., Sun F., Pang C., Ma B., Qu C., An H. 2020. Molecular mechanism of CaCCinh-A01 inhibiting TMEM16A channel. Arch. Biochem. Biophys. 695, 108650.
  12. Taylor K.A., Mahaut-Smith M.P. 2019. A major interspecies difference in the ionic selectivity of megakaryocyte Ca2+-activated channels sensitive to the TMEM16F inhibitor CaCCinh-A01. Platelets. 30, 962–966.
  13. Martins J.R., Faria D., Kongsuphol P., Reisch B., Schreiber R., Kunzelmann K. 2011. Anoctamin 6 is an essential component of the outwardly rectifying chloride channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 18168–18172.
  14. Kolesnikov D., Perevoznikova A., Gusev K., Glushankova L., Kaznacheyeva E., Shalygin A. 2021. Electrophysiological properties of endogenous single Ca2+ activated Cl-channels induced by local Ca2+ entry in HEK293. Int. J. Mol. Sci. 22, 4767.
  15. Kolesnikov D.O., Nomerovskaya M.A., Grigorieva E.R., Reshetin D.S., Skobeleva K.V., Gusev K.O., Shalygin A.V., Kaznacheyeva E.V. 2024. Calcium chelation independent effects of BAPTA on endogenous ANO6 channels in HEK293T cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 693, 149378. doi: 10.1016/j.bbrc.2023.149378.
  16. Tian X.Q., Ma K.T., Wang X.W., Wang Y., Guo Z.K., Si J.Q. 2018. Effects of the calcium-activated chloride channel inhibitors T16Ainh-A01 and CaCCinh-A01 on cardiac fibroblast function. Cell Physiol. Biochem. 49, 706–716.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Effect of CaCCinh-A01 on the probability of the open state of single ANO6 channels of HEK293 cells. Experiments performed in an inside-out configuration at a potential of +40 mV were used for analysis. a - Fragment of current recording through CaCC ANO6 channels after addition of 10 μM [Ca2+]i and subsequent application of 20 μM CaCCinh-A01. Extended current recording fragments and amplitude histograms are indicated below the current recording fragment. b - Volt-ampere characterization of CaCC ANO6 channels after addition of 20 μM CaCCinh-A01 to the intracellular side of the membrane. c - Open-state probability of CaCC ANO6 channels activated by addition of 10 μM [Ca2+]i at 30 s intervals immediately before (1, black squares) and after application of CaCCinh-A01 (2, gray squares) (p < 0.05).

Download (185KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Effect of CaCCinh-A01 on the open state lifetime of single ANO6 channels of HEK293 cells. Experiments performed in an inside-out configuration at a potential of +40 mV were used for analysis. a - Fragment of current recording through single CaCC ANO6 activated with 10 μM [Ca2+]i. b - Fragment of current recording through single CaCC ANO6 in the presence of 20 μM CaCCinh-A01. Corresponding histograms of channel lifetime are shown below the current recording fragments. c - Cumulative plot showing the change in lifetime of single CaCC ANO6 channels upon addition of 10 μM [Ca2+]i (1, black squares) and after subsequent application of 20 μM CaCCinh-A01 (2, gray squares) (n = 4, p < 0.05).

Download (168KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Effect of CaCCinh-A01 on the current amplitude through CaCC ANO6 channels of HEK293 cells. Experiments performed in an inside-out configuration at a potential of +40 mV were used for analysis. a - Extended fragments of current recordings of CaCC ANO6 channels activated by 10 μM [Ca2+]i before and after addition of 20 μM CaCCinh-A01. Amplitude histograms are indicated next to the current recording fragments. b - Graph of the change in current amplitude through CaCC ANO6 channels before (1, black squares) and after (2, gray squares) application of CaCCinh-A01 inhibitor (p < 0.05).

Download (147KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 The Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».