A New Approach to Analyze the State of the Complement System in Patients with COVID-19. Pilot Study

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Новая коронавирусная инфекция (COVID-19) появилась в 2019 г. в КНР в г. Ухане и в кратчайшие сроки распространилась по всему миру. В первые два года пандемии общее количество заболевших превысило 700 млн человек, и смертность составила 2–3% (https://covid19.who.int/). Борьба с этим заболеванием прежде всего была направлена на разработку вакцин. С их помощью удалось устранить вал заболеваемости и смертности. Заболеваемость была стабилизирована на низком уровне, однако полностью справиться с этим инфекционным заболеванием не удается. Смертность в настоящее время от коронавирусной инфекции остается достаточно высокой и доходит до 0.5–1%. Созданные вакцины оказываются неэффективными по отношению к новым штаммам вируса SARS-CoV-2.

Параллельно с разработкой методов прямой защиты от вируса проводятся исследования патогенетических механизмов данного заболевания. Одним из критических моментов прогрессирования COVID-19 является цитокиновый шторм, сопровождающийся гиперактивацией комплемента [1]. Комплемент – это врожденная система иммунной защиты организма, включающая более 30 белковых факторов [2]. При нормальной работе основная функция системы комплемента заключается в инактивации и удалении чужеродных биологических объектов и собственных отмирающих клеток. В случае же гиперактивации объектом атаки становятся нормальные клетки организма. К числу первых мишеней относится эндотелий сосудов. Его повреждение приводит к активации системы свертывания крови, секреции фактора Виллебранда, тромбозу микрососудов и в тяжелых случаях к полиорганной недостаточности и смерти больного. Этот патологический процесс описан при гемолитико-уремическом синдроме – заболевании, вызванном врожденными и приобретенными дефектами системы комплемента [3].

Многочисленные исследования пациентов с COVID-19 подтвердили, что нарушение регуляции комплемента является одним из основных, если не главным, патогенетическим фактором этого заболевания [4, 5]. По этой причине определение функциональной активности системы комплемента у больных может иметь важное значение как для более детальной оценки их состояния и подбора терапии, так и для прогнозирования течения болезни. Для оценки активности комплемента проводится определение ряда параметров: литической активности С5, концентраций фактора С3, анафилактических пептидов С3а и С5а, содержания в плазме мембраноатакующего комплекса (МАК). В состав МАК входят факторы комплемента C5b, C6, C7, C8 и С9, поэтому его также обозначают аббревиатурой C5b-9. Встраиваясь в мембрану микроорганизмов и поврежденных клеток организма, МАК формирует пору, проницаемую для ионов, воды и небольших молекул. Уровень растворенного в плазме МАК косвенно отражает его количество на поверхности инородных объектов (в данном случае на липидной оболочке вируса SARS-CoV-2) и на мембране собственных клеток организма.

В настоящей работе для оценки активности системы комплемента в плазме крови больных COVID-19 был применен уже использованный нами ранее подход [6], позволяющий непосредственно исследовать процесс формирования МАК на поверхности эндотелиальных клеток. Для этого в экспериментах ex vivo эндотелиальные клетки (ЭК) из пупочной вены человека (HUVEC – human umbilical vein endothelial cells) инкубировали с плазмой пациентов, больных COVID-19, либо с плазмой здоровых людей. Известно, что при всех путях активации комплемента к поверхности атакуемого объекта присоединяется ключевой компонент каскада протеолитических реакций – фактор С3b [2]. Ковалентное связывание его с мембраной запускает финальную фазу активации системы комплемента – протеолиз фактора С5 и формирование МАК. Для визуализации связанного с мембраной HUVEC фактора С3b были использованы конъюгированные с флуоресцеином антитела, специфичные к фактору С3 и к его активированной форме С3b. Мы показали, что при инкубации HUVEC с плазмой больных сорбция C3/C3b на мембране многократно выше, чем при инкубации с плазмой здоровых людей. Таким образом, наши результаты показывают, что, во-первых, при коронавирусной инфекции резко усиливается активация комплемента на ЭК кровеносных сосудов. Во-вторых, используя данный метод оценки состояния системы комплемента ex vivo, можно непосредственно определять, каково повреждающее действие комплемента на сосуды у каждого конкретного больного и какова эффективность проводимого лечения и применяемых лекарственных препаратов. Также данная модель может быть использована для исследований патогенетических механизмов повреждения эндотелия сосудов при COVID-19.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования были выбраны пациенты, проходящие лечение в стационаре и отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ). Критериями отбора были наличие подтвержденной методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) инфекции SARS-CoV-2 и вирусной пневмонии, подтвержденной компьютерной томографией (КТ). Плазму получали из крови, взятой из локтевой вены с антикоагулянтом, содержащим цитрат натрия.

HUVEC выделяли согласно методу, описанному ранее [7]. Клетки выращивали в покрытых желатином пластиковых флаконах в среде М199 с солями Эрла и 20 мМ HEPES, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки (Invitrogen, США). К среде добавляли фактор роста эндотелия (300 мкг/мл), выделенный из мозга кролика, 100 мкг/мл гепарина и смесь антибиотиков (пенициллин со стрептомицином). Использовали клетки ранних пассажей. Для пассирования HUVEC применяли аккутазу® (Sigma-Aldrich, США).

Для определения связывания фактора С3b с клетками их пересаживали в 48-луночный планшет. HUVEC трижды отмывали от среды роста физиологическим солевым раствором (ФСР, pH 7.4), содержащим NaCl (145 мМ), KCl (5 мМ), HEPES (5 мМ), MgCl₂ (1 мМ), СaCl₂ (1.2 мМ), глюкозу (10 мМ). Далее HUVEC инкубировали 10 мин при комнатной температуре в присутствии 100 мкМ ADP, трижды отмывали ФСР и инкубировали 4 ч с плазмой крови, смешанной с ФСР в соотношении 1:2 при 35℃. После инкубации клетки отмывали холодным фосфатным солевым буфером (PBS – phosphate buffered saline) и фиксировали холодным 3% параформальдегидом в течение 25 мин. Клетки отмывали 3 раза раствором PBS, инкубировали 45 мин с 2% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS и далее в течение ночи инкубировали при 4^оС с разведенными в 100 раз поликлональными FITC-конъюгированными антителами, специфичными к С3с-фрагменту фактора С3 и C3b и не связывающимися с С3а (DAKO, F0201) [8]. Затем клетки отмывали 3 раза PBS и инкубировали в растворе ядерного красителя Hoechst 33342 в PBS (2 мкг/мл) 15 мин при 35^оC. Несвязавшийся краситель отмывали 3 раза PBS. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMI 6000 (Leica, Германия) с использованием объектива ×10, диодного осветителя с длиной волны 488нм и флуоресцентного фильтра L5 ET (Leica, Германия), оснащенного камерой. С центрального участка каждой лунки получали 16 снимков не перекрывающих друг друга микроскопических полей площадью 1.4 мм². Анализ снимков проводили с использованием компьютерной программы Cell Profiler. В рамках анализа производилось определение интегральной интенсивности флуоресценции, числа ядер и С3/ С3b-иммунопозитивных частиц площадью 2.2–70 мкм², минимального и максимального диаметра Ферета регистрируемых С3/С3b-иммунопозитивных частиц. Форму иммунопозитивных частиц оценивали по отношению максимального диаметра Ферета к минимальному.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Excel 10 и MedCalc 14.8.1. Каждое значение представляет собой среднее 6 независимых измерений ± стандартное отклонение.

Для проверки выборок на нормальность распределения использовали W-тест Шапиро–Уилка (уровень значимости >0.05).

Достоверность различий уровня опсонизации С3, а также количества ядер в поле зрения после инкубации клеток с плазмой крови здоровых доноров и больных COVID-19 (рис. 1) оценивали согласно t-критерию Стьюдента для независимых выборок, а также однофакторного параметрического дисперсионного анализа ANOVA.

 

Рис. 1. Связывание С3/С3b клетками HUVEC под воздействием плазмы крови здоровых доноров и больных COVID-19. а – Окрашивание клеток антителами к С3/С3b и ядерным красителем Hoechst 33258 после инкубации с плазмой крови здоровых доноров; б – окрашивание клеток антителами к С3/С3b и ядерным красителем Hoechst 33258 после инкубации с плазмой крови больных COVID-1; в – количество ядер в поле зрения после инкубации клеток с плазмой крови здоровых доноров и больных COVID-19 (p ≥ 0.8); г – среднее количество С3/ С3b-иммунопозитивных частиц на ядро в культуре клеток HUVEC после инкубации с плазмой крови здоровых доноров и больных COVID-19 (***p < 0.001).

 

Рис. 2. Распределение C3/C3b-иммунопозитивных структур по количеству и площади в культуре клеток HUVEC после инкубации с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19. N – среднее число иммунопозитивных структур заданного диапазона размеров в сканируемом поле зрения, полученное с 12 независимых случайных кадров (p ≤ 0.001).

 

Среднее число (N) иммунопозитивных структур заданного диапазона размеров и среднее значение интегральной интенсивности флуоресценции, полученные с 16 независимых случайных снимков, сравнивалось между опытной и контрольной группами при помощи t-критерия Стьюдента для независимых выборок.

Достоверность различий формы С3/С3b-иммунопозитивных структур (dF_max/dF_min) среди частиц одного размера (мкм²) между контролем и опытом (рис. 3) оценивали согласно t-критерию Стьюдента для независимых выборок.

 

Рис. 3. Различия в форме С3/С3b–иммунопозитивных структур, регистрируемых после инкубации клеток HUVEC c плазмой здоровых доноров и больных COVID-19. dF_max – максимальный диаметр Ферета объекта, dF_min – минимальный диаметр Ферета объекта. Форму оценивали по отношению dF_max/dF_min. Чем выше это соотношение, тем более вытянутую форму имеют частицы. Иммунопозитивные частицы площадью 2.2–10.9 мкм² после инкубации с плазмой больных COVID-19 имели более вытянутую форму в сравнении с контролем (*p < 0.05, **p < 0.01).

 

Наличие корреляции между интегральной интенсивностью флуоресценции и числом выявляемых C3/C3b-иммунопозитивных структур проверялась путем расчета коэффициента корреляции Пирсона.

Значения p менее 0.05 считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследований была выбрана группа больных возрастом от 32 до 81 года с установленным диагнозом COVID-19, отягощенным вирусной пневмонией и нефрологической патологией разной степени тяжести. Данные о больных представлены в табл. 1. В качестве контроля была использована плазма от 6 здоровых добровольцев в возрасте от 22 до 68 лет.

 

Таблица 1. Связывание С3/С3b клетками HUVEC: влияние плазмы крови больных COVID-19

Пациенты	Возраст	Стационар – 1, ОРИТ – 2	Пневмония, КТ	Среднее число ядер в поле зрения	Среднее число структур С3/C3b на клетку	Средняя интегральная интенсивность флуоресценции, ОЕФ	Связывание С3, % от контроля
							Количество С3/С3b структур, %	Интегральная интенсивность флуоресценции, %
1	81	2	3	243±9	2.2±0.3	16611±3962	453±71	321±78
2	50	1	1	244±7	4.2±0.3	49244±11623	861±108	953±227
3	60	1	2	252±5	1.1±0.1	14433±3477	229±30	279±68
4	68	2	3	251±6	5±0.3	53588±1660	1016±125	1037±34
5	60	1	2	258±4	2.6±0.1	33336±4126	528±57	645±81
6	61	1	2	253±2	3±0.2	35648±5122	620±74	690±100
7	37	1	3	259±7	4.7±0.3	57797±4216	955±119	1118±84
8	32	1	2	264±1	3.4±0.4	43897±5796	699±108	850±113
9	37	1	3	262±7	2.1±0.1	26279±2472	437±48	509±48
10	75	1	1	251±3	1.2±0.1	12439±1654	251±37	241±32
11	58	1	3	267±7	0.5±0.1	6681±2636	104±13	129±51
12	40	1	2	262±9	3.3±0.2	39562±993	665±83	766±20
13	52	1	1	247±10	3.3±0.2	33493±3001	667±81	648±59
Пациенты, cреднее	54	-	-	254±4	2.8±0.4***	32539±16439***	576±279***	631±318***
Контроль
1	23	-	-	249±4	0.5±0.01	5110±1384	98±10	99±27
2	24	-	-	264±3	0.5±0.02	5373±1871	104±12	104±36
3	19	-	-	262±1	0.36±0.02	4372±248	74±9	85±4
4	69	-	-	259±9	0.65±0.07	6650±1680	132±19	129±32
5	39	-	-	251±3	0.34±0.01	3679±337	69±8	71±7
6	34	-	-	237±6	0.62±0.04	5759±1350	126±15	111±27
Контроль, cреднее	34	-	-	255±2	0.49±0.13	5158±1045	100	100

Примечание. ОРИТ – отделение реанимации и интенсивной терапии. КТ – степень поражения легких, определяемая на основании компьютерной томограммы. ***р < 0.001.

 

За основу теста для определения активности комплемента нами был взят подход, разработанный Noris с соавторами [9] для анализа активности системы комплемента в плазме больных атипичным гемолитико-уремическим синдромом (аГУС) с некоторыми изменениями [6]. В экспериметах исследователей активность системы комплемента в плазме крови оценивали по уровню связывания C3/C3b с ЭК микрососудов человека (HMEC). Вместо культуры иммортализованных клеток HMEC-1, которые по ряду свойств (скорости роста, чувствительности к плазме) отличаются от нативных эндотелиальных клеток, нами была выбрана первичная культура эндотелиальных клеток пупочной вены человека HUVEC. Опсонизацию клеток фактором С3/C3b оценивали двумя способами: по интегральной интенсивности флуоресценции и по количеству С3/C3b-иммунопозитивных частиц в мозаичном кадре.

Предварительно нами был проведен анализ динамики накопления С3/С3b на поверхности клеток HUVEC во время их инкубации с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19 в течение 4 ч. Клетки отмывали от плазмы и фиксировали через 15 мин, 30 мин, 1, 2, 3 и 4 ч после начала инкубации с раствором плазмы. Выраженные различия в опсонизации клеток HUVEC С3/С3b наблюдались уже на 3 ч инкубации и сохранялись без значительных изменений вплоть до 4 ч (данные не представлены). В дальнейшем инкубация клеток с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19 проводилась 4 ч при 37^оC.

После инкубации с раствором плазмы в ФСР клетки фиксировали, окрашивали и определяли интегральную интенсивность флуоресценции, как это ранее предлагалось Noris с соавторами [9], и число окрашенных антителами к С3/С3b структур на клетку. Сравнение опсонизации клеток HUVEC фактором комплемента C3/C3b показало, что после инкубации клеток с плазмой больных COVID-19 (n = 13) количество C3/C3b-иммунопозитивных структур возрастало в 5.76±2.79 раз (mean ± SD, p < 0.001) по сравнению с контрольной плазмой (n = 6) (табл. 1, рис. 1). Среднее число частиц на клетку составляло в контроле 0.49+0.06 (mean±SD, n = 6), при инкубации с плазмой больных 2.4±0.4 (mean±SD, n = 13 р < 0.001). Регистрируемая интегральная интенсивность флуоресцентного сигнала с антител к С3/С3b после инкубации с плазмой больных возрастала в 6.31±3.18 раз (mean ± SD, p < 0.001) в сравнении с контрольной плазмой (табл. 1). Сопоставление полученных данных показало практически полную положительную линейную корреляцию между числом С3/ С3b-иммунопозитивных структур и интегральной интенсивностью флуоресценции (r = 0.985). Из этих данных следует, что рост интегральной интенсивности флуоресценции обусловлен увеличением количества C3/ C3b-иммунопозитивных структур. Подсчет ядер относительно площади сканирования не выявил различий в количестве клеток, инкубировавшихся с плазмой здоровых доноров (254±4.1; mean±SD) и плазмой больных COVID-19 (255±2.2; mean±SD). Таким образом, можно говорить о том, что наблюдаемая разница в связывании С3/С3b не была обусловлена гибелью клеток (табл. 1, рис. 1).

Разница в опсонизации клеток HUVEC С3/С3b при их инкубации с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19 может отражать более высокий уровень активности системы комплемента у больных. При этом в основе связывания клетками С3/С3b из плазмы больных может лежать сразу несколько механизмов. Следуя рекомендациям, данным Noris с соавторами [9] в описании предлагаемого ими подхода для оценки активности системы комплемента в плазме крови, мы также проводили предварительную активацию эндотелиальных клеток ADP. Эти авторы показали, что предварительная инкубация клеток с ADP вызывает экспонирование на их поверхности P-селектина. Р-селектин синтезируется в эндотелиальных клетках, накапливается в специальных гранулах – тельцах Вейбеля–Паладе – и в случае повреждения тканей, развития воспаления и активации эндотелия экспонируется на клеточной поверхности, обеспечивая адгезию лейкоцитов [10]. P-селектин способен связывать С3b, обеспечивая сборку С3-конвертазы альтернативного пути системы комплемента [10, 11]. Можно предположить, что преинкубация клеток HUVEC с ADP также вызывает экспонирование P-селектина на их поверхности, делая их восприимчивыми к С3b. В этом случае разница в связывании C3/C3b обусловлена различиями в концентрации активной формы С3b в плазме здоровых доноров и больных COVID-19. Но также необходимо отметить, что в плазме больных коронавирусной инфекцией содержится целый комплекс факторов, которые могут стимулировать экспонирование P-селектина на поверхности эндотелиальных клеток. Их стимулирующая экспонирование P-cелектина активность может быть выше, чем у ADP. В этой роли могут выступать тромбин, гистамин, анафилотоксины и провоспалительные цитокины. Ранее было показано, что тромбин, гистамин, анафилотоксин С5a, провоспалительные цитокины IL-3, IL-4, TNFα могут активировать эндотелиальные клетки, вызывая экспонирование на их поверхности молекул P-селектина [12–17]. В свою очередь, клинические исследования показали рост уровня данных факторов в плазме больных на фоне заболевания COVID-19. Был отмечен рост уровня гистамина, как и других медиаторов воспаления, в плазме больных COVID-19 [18]. Есть данные о том, что прием блокатора H2-рецепторов гистамина фоматидина больными COVID-19 сопровождался достоверным снижением риска развития тромботических осложнений и более легким течением данного заболевания [18]. Нами, в свою очередь, показано, что гистамин увеличивает связывание C3/C3b с HUVEC при инкубации их с плазмой здоровых людей [6]. Эти данные свидетельствуют об активной роли гистамина в патогенезе инфекции, вызванной SARS-CoV-2. Также течение COVID-19 сопровождается активацией системы свертывания крови, продуктом функциональной активности которой является тромбин [19]. У больных COVID-19 отмечается существенный рост эндогенного тромбинового потенциала [20]. Наконец, в процессе исследования роли провоспалительных цитокинов в патогенезе COVID-19 был отмечен рост уровня IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и TNFα у больных COVID-19 и установлена корелляция между уровнем IL-1β, IL-3, IL-6, IL-8, TNFα и тяжестью заболевания [21–24]. Можно предположить, что перечисленные выше факторы могут усиливать экспонирование P-селектина на поверхности клеток HUVEC, создавая тем самым дополнительные сайты связывания C3b при действии плазмы больных COVID-19 на клетки.

Помимо P-селектина связывание C3/C3b клетками HUVEC может быть опосредовано другими белками. В качестве такого белка может выступать фактор Виллебранда [25]. Этот сложный гликопротеин синтезируется эндотелиальными клетками и, так же как P-селектин, накапливается в тельцах Вейбеля–Паладе. В процессе секреции фактор Виллебранда подобно Р-селектину экспонируется на поверхности ЭК. Перед поступлением в кровеносное русло он подвергается расщеплению специальным ферментом – металлопротеиназой ADAMTS13 на мультимеры различной молекулярной массы. Фактор Виллебранда выполняет две важные функции в системе гемостаза. Он обеспечивает связывание тромбоцитов в месте повреждения сосуда и формирование тромбоцитарного тромба, а также является носителем фактора VIII, защищая его от инактивации. Фактор Виллебранда взаимодействует с C3b через три своих домена типа A (A1, A2, A3) и инициирует активацию альтернативного пути системы комплемента, однако сборка активной C5-конвертазы и образование МАК происходят только на домене A2 [25]. Приводимые в литературе данные говорят о повышенной секреции клетками эндотелия фактора Виллебранда при COVID-19 [26]. Поскольку фактор Виллебранда имеет с P-селектином общие гранулы депонирования – тельца Вейбеля–Паладе, его секреция может запускаться теми же факторами. Показано, что тромбин, гистамин, анафилотоксин C5a и IL-6 стимулируют секрецию фактора Виллебранда [27–30]. При этом важно отметить, что активаторы ЭК стимулируют экспонирование P-селектина и секрецию фактора Виллебранда с разной эффективностью. В частности, это связано со способностью дифференциально запускать экзоцитоз разных популяций телец Вейбеля–Паладе. Так, гистамин, в отличие от тромбина, активирует экзоцитоз телец Вейбеля–Паладе, содержащих P-cелектин и фактор Виллебранда, одновременно запуская перемещение субпопуляции телец Вейбеля–Паладе, не содержащих P-селектин, в центр организации микротрубочек [31]. В свою очередь, стабилизация связавшегося с P-селектином и фактором Виллебранда С3b, источником которого, по всей видимости, является плазма, и локальная активация альтернативного пути системы комплемента приводят к образованию и накоплению нового С3b, амплификации сигнала и увеличению регистрируемых различий.

Наконец, C3b способен образовывать стабильные комплексы с другими компонентами плазматических мембран, в том числе с зимозаном [32]. Данные комплексы, по-видимому, являются результатом гидрофобного взаимодействия и ковалентного связывания [32].

Таким образом, наблюдаемые нами отличия в связывании C3b клетками HUVEC при их инкубации с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19 могут быть обусловлены как различиями в его концентрации, так и воздействием на клетки HUVEC целого комплекса активных биологических веществ, присутствующих в высоких концентрациях в плазме крови больных.

Также нами были проанализированы размеры и форма С3/С3b-иммунопозитивных частиц, выявляемых после инкубации клеток с плазмой здоровых доноров и больных COVID-19. Выявляемые при анализе иммунопозитивные частицы имели разный размер. Площадь частиц варьировала от 2.2 до 72.5 мкм². Все частицы были распределены на группы согласно их площади. Видно, что количество частиц малого размера значительно превышало число крупных частиц. После инкубации HUVEC с плазмой больных количество иммунопозитивных частиц выше для всех представленных размеров (рис. 2), однако различия в группах, включающих небольшие частицы площадью 2.2–11 мкм², были менее выражены в сравнении с группами больших размеров. Для объяснения этого можно предположить, что гиперактивация системы комплемента в плазме больных COVID-19 приводит к локальной генерации С3b на мембране, следствием чего является образование на поверхности клеток более крупных иммунопозитивных частиц.

Для оценки формы нами было использовано отношение максимального диаметра Ферета к минимальному, или, иными словами, отношение условной длины к условной ширине объекта, имеющего неправильную форму. Было установлено, что иммунопозитивные частицы разного размера, регистрируемые в культуре клеток после инкубации с плазмой больных и здоровых, различались по форме (рис. 3). Иммунопозитивные частицы площадью 2.2–11 мкм², образующиеся на поверхности HUVEC после инкубации с плазмой больных COVID-19, имели более вытянутую форму в сравнении с контролем.

Причины выявленной нами гетерогенности С3/C3b-иммунопозитивных структур остаются невыясненными. Можно предположить, что выявленные различия в форме малых частиц обусловлены влиянием плазмы больных на экспонирование дополнительных участков связывания C3/C3b и разной локальной активностью системы комплемента. Так, как уже отмечалось выше, в плазме больных COVID-19 повышена концентрация веществ, стимулирующих секрецию фактора Виллебранда. Фактор Виллебранда представляет собой набор мультимеров разной длины, которая определяет их емкость связывания C3b. При этом мультимеры фактора Виллебранда в сравнении с P-селектином способны связать больше молекул C3b и создать больше сайтов активации альтернативного пути комплемента. При связывании C3b с гипермультимерами фактора Виллебранда возможно формирование иммунопозитивных частиц вытянутой формы. Помимо присоединения к нормальным клеткам, С3b может связываться с апоптотическими и некротическими клетками и их фрагментами, что необходимо для ускорения их фагоцитоза [33]. Как уже было отмечено, мы не выявили различий в плотности ядер в культурах клеток, подвергшихся воздействию плазмы здоровых доноров и больных COVID-19. Косвенно это говорит о том, что плазма больных не привела к значимому снижению жизнеспособности клеток и их гибели. С другой стороны, нельзя исключить, что данный процесс мог быть запущен, но не успел вступить в активную фазу в отведенный нами на инкубацию период времени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы установили, что клетки HUVEC способны связывать C3/C3b при взаимодействии с плазмой крови человека. Количество связавшегося C3/C3b с мембраной клеток при их контакте с плазмой крови больных COVID-19 была в несколько раз выше, чем при контакте с плазмой здоровых доноров. Полученные нами данные говорят о том, что связывание С3/С3b на поверхности клеток HUVEC может отражать уровень активности системы комплемента в плазме. Мы предполагаем, что этот подход может найти свое применение как способ комплексной оценки активности комплемента и его повреждающего воздействия на эндотелий при COVID-19 и других вирусных заболеваниях, сопровождаемых гиперактивацией комплемента и развитием тромботических микроангиопатий.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 21–15–00441).

Соответствие принципам этики. Выполненные исследования соответствуют этическим принципам Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям и этическим правилам клинических исследований, принятых в Российской Федерации. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное письменное согласие.

About the authors

P. P. Avdonin

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119334

L. А. Komleva

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119334

M. S. Blinova

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119334

Е. S. Ivanova

Moscow City Clinical Hospital 52

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 123182

O. N. Kotenko

Moscow City Clinical Hospital 52

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 123182

N. F. Frolova

Moscow City Clinical Hospital 52

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 123182

E. S. Stolyarevich

Moscow City Clinical Hospital 52

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 123182

E. Y. Rybakova

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119334

P. V. Avdonin

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Email: ppavdonin@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119334

References

Supplementary files