Investigation of LTF and GDF-9 gene polymorphism and in mammals (Bos Taurus L) by PCR-RFLP analysis for pharmacogenetics


Cite item

Full Text

Abstract

It has been established the close relationship between gene polymorphism of lactoferrin (LTF) with an incidence of mastitis and somatic cell counts in milk of mammals. Lactoferrin gene products are associated with resistance to several diseases, and particularly for mastitis. Lactoferrin (LTF) is a multifunctional small glycoprotein of milk. Its main function is to protect the breast. It is considered that genetic variants of DNA lactoferrin could be used as a marker for the prediction of somatic cells in milk and mastitis incidence. Allele A of LTF gene is associated with the incidence of mastitis in mammals such as cows. It has also been established that the polymorphism of BMP15 and GDF9 genes of sheep influence the number and rate of ovulation. Thus the alleles of Bone morpho-genetic protein (BMR15) gene influence the process of folliculogenesis in sheep. Sheep heterozygous on this locus ovulate two or three oocytes. The authors of this study recommend the use of polymorphism BMP15 gene as DNA markers to increase fertility in sheep. It is well known that products of GDF9 gene control the process of growth and development of follicles in cows. Polymorphisms of the gene is well studied in medicine. Women who have a mutation in the coding region of the gene GDF9 found signs of premature ovarian failure. The study of lactoferrin gene polymorphism has theoretical and practical importance since there is a positive correlation between the content in milk of somatic cells and genetic variants of lactoferrin. Thus, the authors suggest the use of GDF9 gene polymorphism in cows as a DNA marker for the prediction of reproductive function in mammals. The aim: to study DNA polymorphism of genes LTF, GDF9 and identified animals (Bos Taurus L) with the desired genotype for the studied loci to build model for searching new pharmacological agents.

Full Text

Актуальность темы Исследованиями установлена тесная взаимосвязь между полиморфизмом гена лактоферрина (LTF) с заболеваемостью маститом, содержанием соматических клеток в молоке. Продукты гена лактоферрина связаны с устойчивостью к заболеваниям, прежде всего, к маститам. Лактоферрин крупного рогатого скота (LTF) - многофункциональный малый гликопротеин молока, основная функция которого - защита молочной железы [2]. Ген LTF локализован на хромосоме 22q24, состоит из 17 экзонов и полная последовательность гена 34,5 тыс п. н. Исследованиями ученых установлена частота генетических вариантов АА, ВВ и АВ лактоферрина у коров голштинской породы, 32,5, 10 и 57,5 % соответственно. Авторы рекомендуют использовать генетические варианты лактоферрина в качестве ДНК маркера для прогнозирования содержания соматических клеток в молоке и заболеваемости маститом, аллель А гена LTF связана с заболеваемостью маститом у коров [3]. Также, установлено влияние полиморфизма генов ВМР 15 и GDF9 у овец на количество овулируемых фолликулов и уровень овуляции. Так, аллели гена, Bone morphogenetic protein - ВМР 15 у овец, оказывают влияние на процесс фолликулогенеза и гетерозиготные овцы по данному локусу овулируют с двумя-тремя ооцитами. Авторы данного исследования рекомендуют использовать полиморфизм гена ВМР 15 у овец в качестве ДНК маркера для повышения плодовитости животных в овцеводстве [1]. В 2013 году появилось первое сообщение о полиморфизме гена GDF9 (Growth differentiation factor 9) у Bos Taurus L и о связи аллелей данного гена с выходом пригодных для трансплантации эмбрионов у животынх-доноров, с общим количеством эмбрионов. Ген GDF9 у Bos Taurus L имеет длину 3824 пар нуклеотидов, экзонная часть гена оказалась консервативной и не имеет мутации, а в интронной части обнаружены две точечные мутации. Известно, что продукты гена GDF9 контролируют процесс роста и развития фолликулов у коров. Полиморфизм данного гена хорошо исследован в медицине, у женщин, имеющих мутацию в кодирующей части гена GDF9 встречаются признаки преждевременного угасания функции яичников [4, 5]. Китайскими учеными установлено, что высокий выход качественных эмбрионов для трансплантации был у коров-доноров с генотипом A485TТ, также была выявлена положительная корреляция с общим количеством эмбрионов и генотипом коров-доноров А625AA. Изучение полиморфизма гена лактоферрина имеет теоретическое и прикладное значение, так как существует положительная корреляция содержанием в молоке соматических клеток и с генетическими вариантами лактоферрина. Таким образом, авторы работы предлагают использовать полиморфизм гена GDF9 у коров в качестве ДНК маркера для прогнозирования репродуктивной функции у Bos Taurus L. Цель работы: изучение полиморфизма ДНК генов LTF, GDF9 и выявление животных с желательным генотипом по изучаемым локусам, как перспективной модели для поиска новых фармакологических средств. Материалы и методы исследования Исследования проводили на 88 коровах голштинской породы племенного хозяйства ТОО «Байсерке-Агро» Талгарского района Алматинской области. Кровь для анализа брали из яремной вены в ваккумную пробирку с антикогулянтом - ЭДТА. Работу проводили в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра КазНАУ. ДНК из крови выделяли с помощью набора «ДНК сорб В». Для детекции полиморфизма гена LTF использовали следующую пару праймеров: F - 5′-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3′, R 5′-CAGGTTGACACATCGGTTGAC-3′. Условия проведения ПЦР: денатурация при 94 °C - 45 сек, отжиг праймеров - 62 °C 45 сек и элонгация при температуре 72 °C 45 сек и количество циклов 35-40. Объем реакционной смеси: 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 × ПЦР буфера, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента Taq Polymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды. Для генотипирования по локусу лактоферрина используется эндонуклеаза EcoRI, которая имеет сайт рестрикции GAATT/C и продукт амплификации длиной 301 п. н. после рестрикции амплификата рестриктазой EcoRI образуются два фрагмента длиной 201 п. н. и 100 п. н. Как видно электрофореграмме, лунка 1 - ДНК маркер, лунки 1, 6, 8, 13 животные с генотипом АА, лунки 2, 3, 5, 7, 10, 12 с генотипом АВ и лунки 4, 9, 14 с генотипом ВВ (рис. 1). Для амплификации нужного фрагмента гена GDF9 A485T были использованы праймеры, разработанные авторами TangK. Q. и др. (2013), которые имеют следующие последовательности: прямые F 5′-AGGGAAGAAGAAAGATCTTTTGC-3′ обратные R: 5′- TCTACCCAGGCTTTAGTCCC-3′. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать участок гена GDF 9 длиной 208 пар нуклеотидов. В данном случае для генотипирования животных применяется рестриктаза NsiI, которая имеет сайт рестрикции ATGCA/T. Для детекции второй точечной мутации в интронной части изучаемого гена A625T нами были использованы праймеры: прямые F: 5′-ATGCCCTCATGGGTTGATGTAGGCTA-3′ обратные R: 5′- CTCCCATCTCTCTCATACACACAAG-3′. Комплементарность последовательностей вышеуказанных праймеров нами были проверены с помощью компьютерной программы, обе пары праймеров оказались комплементарными исследуемому участку гена GDF9. Рестрикцию продукта ПЦР во втором опыте проводили с помощью рестриктазы DraI, которая имеет сайт рестрикции TTT/AAA. Результаты исследования Всего генотипировано 88 животных (голштинская порода) ТОО «Байсерке-Агро», частота генетических вариантов по локусу лактоферрина составила: с генотипом АА - 28 животных (31,8 %), АВ - 54 животных (61,3 %) и ВВ - 6 животных (6,8 %). Диагностику на субклинический мастит проводили методом подсчета соматических клеток в молоке коров с помощью прибора Fossomatic 5000 и димастиновой пробы, по результатам исследования у 12 животных был выявлен субклинический мастит. Они имели гетерозиготный генотип АВ по локусу лактоферрина и полученные результаты соответствуют литературным данным. Так, по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9) у исследуемой популяции животных выявлены все три генетических варианта генотипа, однако из-за небольшой не выявлена корреляция между генетическими вариантами гена GDF9 и репродуктивной функцией у Bos Taurus L. Выводы Таким образом, результаты нашего исследова-ния по изучению полморфизма гена лактоферрина у млекопитающих (Bos Taurus L), показывают, что существует положительная корреляционная связь между генетическим вариантом АВ лактоферрина и заболеваемостью субклиническим маститом. Использование метода полимеразной цепной реакции совместно с ПДРФ позволяет в течение 5-6 часов провести генотипирование животных по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9). Таким образом, представляется перспективным поиск фармакологических средств на основе новых данных о полиморфизме генов лактоферрина и фактора роста и дифференцировки (GDF9).
×

About the authors

Sergei Nikolaevich Proshin

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: psnjsn@rambler.ru
MD, PhD, Dr Med Sci Professor, Head. Department of pharmacology

Essengali Serikovich Usenbekov

Kazakh Agrarian National University

Email: usen03@mail.ru
PhD, Associate Professor, Head. Department of Clinical Veterinary Medicine

Erden Bakhitbekovich Shakibaev

Kazakh Agrarian National University

Email: shakibaev.erden@mail.ru
Postgraduate Student. Department of Clinical Veterinary Medicine

Zhanat Zholshybaikyzy Bimenova

Kazakh Agrarian National University

Email: 070702007@mail.ru
Postgraduate Student. Department of Clinical Veterinary Medicine

Raisa Mukhamediyarovna Zhumakhanova

Kazakh Agrarian National University

Email: usen03@mail.ru
Senior teacher. Department of Obstetrics, Surgery and Reproduction Biotechnology

Ruslan Ivanovich Glushakov

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: glushakovruslan@gmail.com
MD, PhD, Associate Professor. Department of pharmacology

Natal’ya Viktorovna Dement’eva

Federal research institute for farm animal genetics and breeding

Email: dementevan@mail.ru
PhD, Senior researcher. Department of pharmacology. Department of biotechnology of the Laboratory of molecular cytogenetics

References

  1. Barzegari A., Atashpaz S., Ghabili K., Nemati Z., et al. Polymorphismsin GDF9 and BMP15 associated with fertility and ovulation rate in Moghani and Ghezel sheep in Iran. Reprod. Domest. Anim. 2010; 45: 666-9.
  2. Sharifzaden А., Doosti A. Study of Lactoferrin Gene Polymorphism in Iranian Holstein Cattle Using PCR-RFLP Technique. Global Veterinaria. 2011; 6 (6): 530-6.
  3. Schwerin M., Toldo S. S., Eggen A., Brunner R. M., Seyfert H. M., Fries R. The bovine lactoferrin gene (LTF) maps to chromosome 22 and syntenic groupU12. Mammalin Genome. 1994; 5, 486-9.
  4. Tang K. Q., Yang W. C., Li S. J. and Yang L. G. Polymorphisms of the bovine growth differentiation factor 9 gene associated with superovulation performance in Chinese Holstein cows. Genetics and Molecular Research. 2013; 12 (1): 390-9
  5. Wang T. T., Wu Y. T., Dong M. Y., Sheng J. Z. et al. G546A polymorphism of growth differentiation factor-9 contributes to the poor outcome of ovarian stimulation in women with diminished ovarian reserve. Fertil. Steril. 2010; 94: 2490-2.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2015 Proshin S.N., Usenbekov E.S., Shakibaev E.B., Bimenova Z.Z., Zhumakhanova R.M., Glushakov R.I., Dement’eva N.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
 


Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».