Исследование полиморфизма генов LTF и GDF-9 у млекопитающих (Bos Taurus L) методом ПЦР-ПДРФ анализа для решения задач фармакогенетики

Полный текст

Актуальность темы Исследованиями установлена тесная взаимосвязь между полиморфизмом гена лактоферрина (LTF) с заболеваемостью маститом, содержанием соматических клеток в молоке. Продукты гена лактоферрина связаны с устойчивостью к заболеваниям, прежде всего, к маститам. Лактоферрин крупного рогатого скота (LTF) - многофункциональный малый гликопротеин молока, основная функция которого - защита молочной железы [2]. Ген LTF локализован на хромосоме 22q24, состоит из 17 экзонов и полная последовательность гена 34,5 тыс п. н. Исследованиями ученых установлена частота генетических вариантов АА, ВВ и АВ лактоферрина у коров голштинской породы, 32,5, 10 и 57,5 % соответственно. Авторы рекомендуют использовать генетические варианты лактоферрина в качестве ДНК маркера для прогнозирования содержания соматических клеток в молоке и заболеваемости маститом, аллель А гена LTF связана с заболеваемостью маститом у коров [3]. Также, установлено влияние полиморфизма генов ВМР 15 и GDF9 у овец на количество овулируемых фолликулов и уровень овуляции. Так, аллели гена, Bone morphogenetic protein - ВМР 15 у овец, оказывают влияние на процесс фолликулогенеза и гетерозиготные овцы по данному локусу овулируют с двумя-тремя ооцитами. Авторы данного исследования рекомендуют использовать полиморфизм гена ВМР 15 у овец в качестве ДНК маркера для повышения плодовитости животных в овцеводстве [1]. В 2013 году появилось первое сообщение о полиморфизме гена GDF9 (Growth differentiation factor 9) у Bos Taurus L и о связи аллелей данного гена с выходом пригодных для трансплантации эмбрионов у животынх-доноров, с общим количеством эмбрионов. Ген GDF9 у Bos Taurus L имеет длину 3824 пар нуклеотидов, экзонная часть гена оказалась консервативной и не имеет мутации, а в интронной части обнаружены две точечные мутации. Известно, что продукты гена GDF9 контролируют процесс роста и развития фолликулов у коров. Полиморфизм данного гена хорошо исследован в медицине, у женщин, имеющих мутацию в кодирующей части гена GDF9 встречаются признаки преждевременного угасания функции яичников [4, 5]. Китайскими учеными установлено, что высокий выход качественных эмбрионов для трансплантации был у коров-доноров с генотипом A485TТ, также была выявлена положительная корреляция с общим количеством эмбрионов и генотипом коров-доноров А625AA. Изучение полиморфизма гена лактоферрина имеет теоретическое и прикладное значение, так как существует положительная корреляция содержанием в молоке соматических клеток и с генетическими вариантами лактоферрина. Таким образом, авторы работы предлагают использовать полиморфизм гена GDF9 у коров в качестве ДНК маркера для прогнозирования репродуктивной функции у Bos Taurus L. Цель работы: изучение полиморфизма ДНК генов LTF, GDF9 и выявление животных с желательным генотипом по изучаемым локусам, как перспективной модели для поиска новых фармакологических средств. Материалы и методы исследования Исследования проводили на 88 коровах голштинской породы племенного хозяйства ТОО «Байсерке-Агро» Талгарского района Алматинской области. Кровь для анализа брали из яремной вены в ваккумную пробирку с антикогулянтом - ЭДТА. Работу проводили в учебно-научно-диагностической лаборатории Казахстанско-Японского инновационного центра КазНАУ. ДНК из крови выделяли с помощью набора «ДНК сорб В». Для детекции полиморфизма гена LTF использовали следующую пару праймеров: F - 5′-GCCTCATGACAACTCCCACAC-3′, R 5′-CAGGTTGACACATCGGTTGAC-3′. Условия проведения ПЦР: денатурация при 94 °C - 45 сек, отжиг праймеров - 62 °C 45 сек и элонгация при температуре 72 °C 45 сек и количество циклов 35-40. Объем реакционной смеси: 50 мкл, имеющий следующий состав: 5 мкл 10 × ПЦР буфера, 1,5 мМ MgCl2, 2,5 мкл 25 мкМ прямого и обратного праймеров, 5 мкл 0,2 мМ концентрации каждого dNTP, 0,5 мкл фермента Taq Polymerase с активностью 5u/μl, 5 мкл ДНК и 26,5 мкл дистиллированной воды. Для генотипирования по локусу лактоферрина используется эндонуклеаза EcoRI, которая имеет сайт рестрикции GAATT/C и продукт амплификации длиной 301 п. н. после рестрикции амплификата рестриктазой EcoRI образуются два фрагмента длиной 201 п. н. и 100 п. н. Как видно электрофореграмме, лунка 1 - ДНК маркер, лунки 1, 6, 8, 13 животные с генотипом АА, лунки 2, 3, 5, 7, 10, 12 с генотипом АВ и лунки 4, 9, 14 с генотипом ВВ (рис. 1). Для амплификации нужного фрагмента гена GDF9 A485T были использованы праймеры, разработанные авторами TangK. Q. и др. (2013), которые имеют следующие последовательности: прямые F 5′-AGGGAAGAAGAAAGATCTTTTGC-3′ обратные R: 5′- TCTACCCAGGCTTTAGTCCC-3′. Использование данной пары праймеров позволяет амплифицировать участок гена GDF 9 длиной 208 пар нуклеотидов. В данном случае для генотипирования животных применяется рестриктаза NsiI, которая имеет сайт рестрикции ATGCA/T. Для детекции второй точечной мутации в интронной части изучаемого гена A625T нами были использованы праймеры: прямые F: 5′-ATGCCCTCATGGGTTGATGTAGGCTA-3′ обратные R: 5′- CTCCCATCTCTCTCATACACACAAG-3′. Комплементарность последовательностей вышеуказанных праймеров нами были проверены с помощью компьютерной программы, обе пары праймеров оказались комплементарными исследуемому участку гена GDF9. Рестрикцию продукта ПЦР во втором опыте проводили с помощью рестриктазы DraI, которая имеет сайт рестрикции TTT/AAA. Результаты исследования Всего генотипировано 88 животных (голштинская порода) ТОО «Байсерке-Агро», частота генетических вариантов по локусу лактоферрина составила: с генотипом АА - 28 животных (31,8 %), АВ - 54 животных (61,3 %) и ВВ - 6 животных (6,8 %). Диагностику на субклинический мастит проводили методом подсчета соматических клеток в молоке коров с помощью прибора Fossomatic 5000 и димастиновой пробы, по результатам исследования у 12 животных был выявлен субклинический мастит. Они имели гетерозиготный генотип АВ по локусу лактоферрина и полученные результаты соответствуют литературным данным. Так, по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9) у исследуемой популяции животных выявлены все три генетических варианта генотипа, однако из-за небольшой не выявлена корреляция между генетическими вариантами гена GDF9 и репродуктивной функцией у Bos Taurus L. Выводы Таким образом, результаты нашего исследова-ния по изучению полморфизма гена лактоферрина у млекопитающих (Bos Taurus L), показывают, что существует положительная корреляционная связь между генетическим вариантом АВ лактоферрина и заболеваемостью субклиническим маститом. Использование метода полимеразной цепной реакции совместно с ПДРФ позволяет в течение 5-6 часов провести генотипирование животных по локусам A485T и A625T гена фактора роста и дифференцировки (GDF9). Таким образом, представляется перспективным поиск фармакологических средств на основе новых данных о полиморфизме генов лактоферрина и фактора роста и дифференцировки (GDF9).

Об авторах

Сергей Николаевич Прошин

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: psnjsn@rambler.ru
д-р мед. наук, профессор, заведующий, кафедра фармакологии

Есенгали Серикович Усенбеков

Казахский национальный аграрный университет

Email: usen03@mail.ru
канд. биол. наук, доцент, заведующий, кафедра клинической ветеринарной медицины

Ерден Бахитбекович Шакибаев

Казахский национальный аграрный университет

Email: shakibaev.erden@mail.ru
аспирант, кафедра клинической ветеринарной медицины

Жанат Жолшыбайкызы Бименова

Казахский национальный аграрный университет

Email: 070702007@mail.ru
аспирант, кафедра клинической ветеринарной медицины

Раиса Мухамедияровна Жумаханова

Казахский национальный аграрный университет

Email: usen03@mail.ru
старший преподаватель, кафедра акушерства, хирургии и биотехнологии воспроизводства

Руслан Иванович Глушаков

ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: glushakovruslan@gmail.com
канд. мед. наук, доцент, кафедра фармакологии

Наталья Викторовна Дементьева

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных» Минздрава России

Email: dementevan@mail.ru
канд. биол. наук, старший научный сотрудник, отдел биотехнологии, лаборатория молекулярной цитогенетики

Список литературы

Дополнительные файлы