Identification of LOF-mutations in a population of Ayrshire cattle

Full Text

Введение.

В современном животноводстве, имеющем интенсивный характер, одной из важнейших задач является раскрытие и эффективное использование биологического потенциала животных, а также выявление и устранение причин, препятствующих реализации этого процесса (Романенкова О.С. и Костюнина О.В., 2023). Одной из проблем в скотоводстве является преждевременная выбраковка животных, в частности у молочного скота. Cole JB с коллегами (2016) приводят данные об экономических потерях от LOF-мутаций в США, составляющих около 10,74 млн долларов, которые вызваны известными рецессивными летальными мутациями основных четырёх молочных пород скота: голштинской, джерсейской, бурой швицкой и айрширской.

В нашем исследовании мы изучали айрширскую породу, отличающуюся высоким уровнем продуктивности и сбалансированным составом молока, а также продуктивным долголетием. Это – одна из распространённых пород молочного направления в мире. По состоянию на 1 января 2023 г. в Российской Федерации комплексно оценено 2 млн 629,7 тыс. голов крупного рогатого скота, где доля айрширской породы составляет 2,65 % или 69, 687 тыс. голов, в том числе 1 млн 606 тыс. голов коров, из которых 2,84 % или 45,613 тыс. голов – айрширская (Ежегодник по племенной работе в молочном скотоводстве в хозяйствах Российской Федерации, 2023). В России порода образует вторую после Финляндии по размерам мировую популяцию айрширского скота и насчитывает 77,67 тыс. голов, в том числе 50,82 тыс. голов коров, что составляет 3,05 % от всех коров молочных и молочно-мясных пород страны (Абрамова Н.И. и др., 2018).

Многие авторы отмечают, что выбраковка крупного рогатого скота часто проводится по неустановленным причинам. Горелик О.В. и соавторы (2021) указывают факторы выбраковки чёрно-пёстрого голштинизированного скота в хозяйстве Московской области: травмы и хирургические заболевания – 33,7 %; патология молочной железы – 21,7 %, патология репродуктивной системы и яловость – 16,3 %. По данным Петровой А.В. (2018), основными причинами выбытия коров айрширской породы являются: травмы – 5,52 %, заболевания вымени – 15,24 %, конечностей – 17,80 %, яловость – 21,58 % и другие причины – 39,16 %. А у первотёлок больший процент занимают яловость – 25,93 % и другие причины – 39,5 %. Такая высокая доля яловости и «других причин» у молодых животных даёт возможность предположить большую роль генотипа среди других факторов, обуславливающих эти причины.

Появление геномной информации привело к возможности оценки геномного инбридинга как альтернативы инбридингу, рассчитанному по родословной. С помощью геномных показателей было выявлено влияние геномного инбридинга на продуктивность и плодовитость животных. Многие авторы изучали «прогоны гомозиготности» – ROH (runs of homozygosity), которые обогащены вредными рецессивными аллелями и связаны с инбредной депрессией, определяемой как снижение фенотипических показателей животных.  Авторы стремились выявить ROH, неблагоприятно влияющие на фертильность и молочную продуктивность в финской популяции айрширских коров (Martikainen K et al., 2020) и канадских голштинов (Makanjuola BO et al., 2021). В литературе отмечается, что маркеры, ассоциированные с летальными генетическим дефектами, могут быть связаны со снижением частоты оплодотворения и удлинением интервалов между отёлами у взрослых коров (Jenko J et al., 2019).

В настоящее время изучаются гаплотипы, ассоциированные с постнатальной смертностью и репродуктивными характеристиками у разных пород скота (Upperman LR et al., 2019). Так, для голштинской породы установлены варианты, связанные с фертильностью коров: HH13 в KIR2DS1: нонсенс-вариант p.Gln159, HH21 в NOTCH3: делеция p.Cys44del, делеция в RIOX1: p.Ala133_Glu142del, а также миссенс-вариант в гене PCDH15: p.Leu (Häfliger IM et al., 2022). Отмечается важность изучения мутаций для выявления фертильности как самок, так и самцов (Hiltpold M et al., 2021).

По литературным данным известно, что в 2014 г. для айрширской породы крупного рогатого скота был установлен гаплотип AH1, ассоциированный с нарушением фертильности и эмбриональной смертностью плодов (Cooper TA et al., 2014). Мутация обнаружена на 17 хромосоме в гене UBE3B, в диапазоне 65,9-66,2 М п.о. (сборка генома UMD 3.1 assembly), где в экзоне 23 произошла синонимичная замена последнего нуклеотида G>A (rs475678587) в положении E692E. Это приводит к нарушению сплайсинга, пропускам экзонов, обусловленных потерей 40 аминокислот в белке, и к синтезу изменённого белка. В результате мутации убиквитинлигаза E3B теряет HECT-домен, определяющий каталитическую активность фермента, а следовательно, приводит к нарушению функции синтезируемого белка, регулирующего гомеостаз, клеточный цикл и репарацию ДНК (Гладырь Е.А. и др., 2018). Мутация UBE3B является аутосомным рецессивным признаком, называемым: «PIRM-синдром айрширского скота», который проявляется нарушением развития, генетическими дефектами, эмбриональными потерями или ранней смертностью молодняка. В породе наблюдается тенденция к снижению фертильности коров и выхода телят (Ежегодник по племенной работе в молочном скотоводстве в хозяйствах Российской Федерации, 2023). Известно, что АН1 является самым распространённым рецессивным гаплотипом в мире, а частота встречаемости носителей остаётся стабильно высокой с середины 70-х годов ХХ века и составляет примерно 26,1 % (Васильева Е.Н., 2021).

Ещё одной LOF-мутацией у крупного рогатого скота является множественный артрогрипоз (АМ – Arthrogryposis multiplex), который впервые зарегистрирован в 2016 г. у животных красной датской породы. Мутация проявляется как делеция одной пары нуклеотидов (c.55delG) в первом экзоне гена холинергического рецептора никотиновой субъединицы бета 1 CHRNB1 (OMIA 002022-9913) на ВТА 19. Это приводит к образованию преждевременного стоп-кодона (p.Ala19Profs47) во втором экзоне гена и нарушению синтеза 96,0 % белка. Наблюдается внутриутробное нарушение подвижности плода из-за повреждения функции ацетилхолиновых рецепторов (AChRs) и дегенерации двигательных нейронов, а также сосудистых нарушений, аномального развития скелета или соединительной ткани и других причин. Врождённый множественный артрогрипоз – это синдром, включающий группу врождённых заболеваний, которые характеризуются суставными контрактурами, аномальным изгибом позвоночного столба (сколиозом и кифозом), мышечной гипоплазией. Эти дефекты могут сочетаться с расщелиной нёба и гидроцефалией. Телята рождаются мёртвыми или погибают вскоре после рождения. АМ встречается как сопутствующее нарушение сложных врождённых синдромов: арахномелии крупного рогатого скота (OMIA 000059-9913, OMIA 001541-9913) и рефлекса шистосомы. Аномалия наследуется как аутосомный рецессивный признак у разных пород скота (Коновалова Е.Н. и Костюнина О.В., 2019).

Нонсенс-мутация R238X (g.39523051C>T) в гене флавинсодержащей монооксигеназы 3 – FMO3 (flavin-containing monooxygenase 3) на ВТА 16 также относится к LOF-мутациям (OMIA). Замена R238X вызывает преждевременное прерывание трансляции гена FMO3, что приводит к отсутствию более 50 % аминокислотной последовательности гена FMO3 в гетерозиготном состоянии и полному отсутствию у гомозигот. Генетическая недостаточность фермента FMO3, вызывающая первичную триметиламинурию («синдром запаха рыбы»), была обнаружена в Швеции. Это – моногенное заболевание, проявляющееся в нарушении органолептических качеств молока и других продуктов (яиц): появление рыбного запаха и послевкусия. Данная мутация встречается довольно часто (q=0,155) у скота айрширской породы (Lundén A et al., 2002). Следовательно, изучение наследственных факторов и мутаций, вызывающих нарушения эмбрионального и постэмбрионального развития, а также снижения качества продукции, является актуальной проблемой современного животноводства.

Цель исследования.

Выявить носителей трёх LOF-мутаций в генах UBE3B, CHRNB1 и FMO3 в популяции коров айрширской породы и установить частоты встречаемости разных гаплотипов по данным генам.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. 135 голов племенных коров айрширской породы Ленинградской области.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: Модельный закон Межпарламентской Ассамблеи государств-участников Содружества Независимых Государств "Об обращении с животными", ст. 20 (постановление МА государств-участников СНГ № 29-17 от 31.10.2007 г.). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов. 

Схема эксперимента. У коров в 2023 году была отобрана кровь из хвостовой вены в вакуумные пробирки с ЭДТА.

Генотипирование проводилось методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. В состав реакционной смеси на 15 мкл входили: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, pH=8.8, 0.1 % (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмоль каждого из праймеров и 5 пмоль каждого из зондов, 2 мМ MgCl2, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: 1 цикл: +95 °С – 5 мин, 40 циклов последовательно: +94 °С – 45 с, +60 °С – 45 с, +72 °С – 15 с.

Оборудование и технические средства. Для проведения ПЦР использовали прибор Quant Studio 5 («Thermo Fisher Scientific», США).

Статистическая обработка. Статистический анализ выполняли с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США).

Результаты исследования.

На рисунках 1 и 2 показаны кривые флуоресценции, идентифицирующие гетерозиготный и гомозиготный генотипы соответственно по гаплотипу AH1.

 

Рисунок 1. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гетерозиготный генотип GA (носитель, AH1C) – мутантный UBE3B

Figure 1. Fluorescence curves identifying heterozygous GA-genotype (carrier, AH1C) – mutant UBE3B gene

 

Рисунок 2. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гомозиготный генотип GG (не носитель, АН1F) – UBE3B (дикий тип)

Figure 2. Fluorescence curves identifying homozygous GG-genotype (non-carrier, АН1F) – UBE3B (wild type) 

 

На рисунках 3 и 4 показаны кривые флуоресценции, идентифицирующие гетерозиготный (мутантный) и гомозиготный (дикий) генотипы соответственно гена CHRNB1.

 

Рисунок 3. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гетерозиготный генотип мутантный гаплотип AHC в CHRNB1

Figure 3. Fluorescence curves identifying heterozygous genotype – mutant haplotype AHC in CHRNB1 gene

Рисунок 4. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гомозиготный (дикий) генотип CHRNB1

Figure 4. Fluorescence curves identifying homozygous (wild) genotype CHRNB1

 

При генотипировании исследуемой группы животных установлен полиморфизм гена FMO3, представленный тремя вариантами генотипов: гомозиготным по мутантной аллели (XX), гетерозиготным по мутации (RX) и гомозиготным (RR) по дикой аллели. Кривые флуоресценции, показывающие разные варианты генотипов представлены на рисунках 5-7.

 

Рисунок 5. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гомозиготный генотип по мутантной аллели гена FMO3 (XX)

Figure 5. Fluorescence curves identifying homozygous genotype for the mutant allele of the FMO3 (XX) gene

 

Рисунок 6. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гетерозиготный генотип по мутантной аллели гена FMO3 (RX)

Figure 6. Fluorescence curves identifying heterozygous ge

 

Рисунок 7. Кривые флюоресценции, идентифицирующие гомозиготный (дикий) генотип гена FMO3 (RR)

Figure 7. Fluorescence curves identifying homozygous (wild) genotype FMO3 (RR) gene

 

Частоты генотипов по разным мутациям представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Количество носителей и частоты распределения генотипов полиморфизма генов PIRM/UBE3B (AH1), CHRNB1(AHC), FMO3 (n=135)

Table 1. The number of carriers and distribution frequencies of genotypes of polymorphism of the PIRM/ UBE3B (AH1), CHRNB1 (AHC), FMO3 genes (n=135)

Гаплотип/ Haplotype	Частота распределения генотипов / frequency of genotype distribution			Частота распределения аллелей / frequency of allele distribution
	АA	AN	NN	А	N
AH1 (гол.) / AH1 (heads)	0	23	112	0,085	0,915
%	0	17,0	83,0	8,5	91,5
AHC (гол.) / AHC (heads)	0	3	132	0,011	0,989
%	0	2,2	97,8	1,1	98,9
FMO3 (гол.) / FMO3 (heads)	2	4	129	0,03	0,97
%	1,5	3,0	95,5	3,0	97,0

Примечание: АА – мутантный гомозиготный генотип, AN сгетерозиготный генотип,

NN – гомозиготный дикий генотип; А – мутантный аллель, N – дикий аллель

Note: АА – mutant homozygous genotype, AN – heterozygous genotype,

NN – homozygous wild genotype; А – mutant allele, N – wild allele

 

По итогам генотипирования частота мутантного аллеля по гаплотипу AH1 составила 0,085; по гаплотипу AHC – 0,011; по FMO3 – 0,03 (табл. 1). Таким образом, в исследуемой популяции присутствуют аллели сразу трёх вредных мутаций, вызывающих снижение фертильности скота, врождённый множественный артрогриппоз и нежелательный признак – рыбный запах в молоке. Наиболее высокая частота мутантных аллелей установлена для гаплотипа фертильности айрширского скота AH1 и составила 17,0 % скрытых носителей. Количество животных, имеющих мутации, было 32 головы, что составило 23,7 % от исследуемого поголовья. Коров, имеющих по 2 и более мутантных аллели одновременно, не выявлено.

Обсуждение полученных результатов.

Сходные с нашими исследованиями данные получены при изучении скота айрширской породы в четырёх областях Центрального и Северо-Западного регионов России, у которых была установлена средняя частота данного гаплотипа по породе – 16,4 % (Гладырь Е.А., 2019). Частота встречаемости гаплотипа AHC изучена у абердин-ангусской породы скота отечественных популяций и составляла 0-0,99 % среди коров и 0-1,06 % – среди быков (Коновалова Е.Н. и Костюнина О.В., 2019), что меньше, чем в нашем исследовании – 2,2 %. По литературным данным известно, что мутация FMO3 встречалась довольно часто (q=0,155) у животных айрширской породы крупного рогатого скота уже с начала 2000-х годов (Lundén A et al., 2002). В популяции шведского красного скота частота встречаемости мутантного аллеля гена FMO3 достигает 14,0 % (Гладырь Е.А., 2019), что значительно больше, чем в нашем исследовании – 3,0 %.

Заключение.

По результатам исследования можно сделать вывод о накоплении генетического груза в изучаемой популяции айрширского скота по трём мутантным генам с частотой 23,7 %. Гаплотип АН1 в UBE3B установлен с частотой встречаемости 17,0 % (23 животных из 135); гаплотип AHC в CHRNB1 – с частотой 2,2 % (3 гол. из 135). Частота гомозиготных генотипов по мутации в FMO3 составила 1,5 % (2 гол. из 135), а гетерозиготных 3,0 % (4 гол. из 135). Данные результаты показывают, что для элиминации вредных мутаций требуется селекционная работа, направленная на дальнейшее выявление носителей мутации, в первую очередь быков-производителей, а также коров, их выбраковка и коррекция подбора родительских пар.

About the authors

Julia V Мukiy

St. Petersburg State University of Veterinary Medicine

Author for correspondence.
Email: jul.ma2015@yandex.ru

Cand. Sci. (Biology), Associate Professor of the Department of Animal Feeding and Breeding

Russian Federation, 5 Chernigovskaya St., St. Petersburg, 196084

Olga V Kostyunina

Federal Research Center for Animal Husbandry named after Academy Member LK Ernst

Email: kostolan@yandex.ru

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Molecular Genetics of Farm Animals, Laboratory of Molecular Genetics of Farm Animals

Russian Federation, 60 Dubrovitsy, Podolsk district, Moscow region, 142132

References

Supplementary files