Features of the effect of biosynthesized nanopowders on callus cultures in vitro

Full Text

Введение.

Каллус – гетерогенная интегрированная структура, образующаяся в результате пролиферации клеток на поверхности отдельных структур растительного организма из исходно разных генеративных или вегетативных органов. Способность к каллусогенезу как in vivo, так и in vitro обнаружена у представителей всех порядков и классов растений. Среди различных подходов культивирования растительных клеток in vitro получение каллусной культуры является подходящим методом для получения здорового растительного материала и биоактивных фитохимических веществ (George EF et al., 2008). Метод культивирования растительных тканей используется для скрининга проростков и даёт возможность изучить различные аспекты роста и развития растений. Кроме того, этот метод стал жизненно важным для селекции устойчивости растений к ряду абиотических и биотических стрессов (Alharby H et al., 2016).

Самым большим преимуществом микроразмножения лекарственных растений in vitro является получение большего количества растений за очень короткое время в контролируемых условиях окружающей среды. В этом аспекте нанотехнологии являются новой областью, которая имеет применение в сельском хозяйстве и биотехнологии растений. Наночастицы (НЧ) могут быть синтезированы из различных органических и неорганических материалов. Тем не менее, «зелёный» синтез металлических НЧ привлёк большое внимание в связи с их широким применением в различных областях науки и техники, включая электронику и строительство, от сельского хозяйства до медицины (Sharma JK et al., 2015). Опосредованный растительным экстрактом синтез наноматериалов имеет преимущество перед химическим синтезом из-за низкой стоимости, безопасности и простоты крупномасштабного синтеза. Синтезированные «зелёные» наночастицы обладают малым размером (менее 100 нм), большой площадью поверхности и экологичностью (Santo Pereira AE et al., 2019). Зелёные синтезированные наноматериалы ускоряют прорастание и способность растений к регенерации, а также развивают устойчивость культур к различным биотическим и абиотическим стрессам (Pacheco I et al., 2018).

Малочисленны исследования, посвящённые влиянию наночастиц феррита цинка ZnFe₂O₄, синтезированных «зелёным» методом, на культуры тканей базилика душистого Ocimum basilicum как одного из ярких представителей лекарственных видов растений. В данной работе мы представляем технологию «зелёного» синтеза наночастиц феррита цинка ZnFe₂O₄ в щелочной среде с использованием водного экстракта петрушки Petroselinum crispumи, оцениваем последние на предмет стимуляции каллусогенеза и формирование большей биомассы каллуса.

Цель исследования.

Оценить влияние биосинтезированных нанопорошков феррита цинка на каллусогенез, структуру и рост каллусов сортов вида базилик душистый O. basilicum.

Материалы и методы исследования.

Объект исследований. Каллус, полученный из листовых и стеблевых эксплантов растений базилика душистого (O. basilicum).

Схема эксперимента. В исследовании использовали каллус, полученный из листовых и стеблевых эксплантов растений базилика душистого (O. basilicum), представленных ниже сортов («Гавриш», Россия).

Русский гигант зелёный. Ранний (от всходов до технической спелости 50...60 дней) сорт крупнолистного базилика с зелёными, сладкими листьями впечатляющего размера. Приятный гвоздичный вкус и пряный аромат. Растение – прямостоячее, высотой 50...60 см.

Русский гигант фиолетовый. Среднеспелый (65...70 дней от всходов) сорт с очень крупными широкими тёмно-фиолетовыми листьями. Растение высотой 50...60 см. Благодаря высокому содержанию ЭМ растение имеет густой, насыщенный аромат и вкус с лёгкими нотками гвоздики.

Василиск. Скороспелый (60...70 дней от всходов до цветения) сорт. Куст – компактный, высотой 20...25 см, с большим количеством мелких листьев. Листья и стебель – зелёные с перечно-гвоздичным запахом.

Ереванский сапфир. Скороспелый сорт. Крупное растение (высотой до 65 см) с широкими листьями фиолетового цвета. Обладает густым гвоздичным ароматом. Очень неприхотлив, в короткие сроки формирует розетку массой до 300 г.

Каллус был получен на средах с различными концентрациями и соотношением ауксинов – 2,4-дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и β-индолилуксусной кислот (ИУК), и цитокининов (БАП): 1 мг/л 2,4-Д; 2 мг/л 2,4-Д; 3 мг/л 2,4-Д; 3 мг/л БАП+0,3 мг/л ИУК (Гвоздикова А.М. и др., 2023).

Образцом для дальнейших исследований был выбран каллус, полученный из растений сорта Русский гигант фиолетовый на среде MS+2 мг/л 2,4-Д (первичный эксплант – стебли). Данный вариант был выбран в связи с самой высокой жизнеспособностью и типичностью каллуса для данного сорта.

Каллус, полученный из растительных эксплантов, выращивался на среде с добавлением различных концентраций НЧ феррата цинка ZnFe₂O₄, которые использовали в концентрациях 12,5, 25 и 50 мкг/л. Нанопорошки из наночастиц феррита цинка ZnFe₂O₄ получали биологическим способом (методом «зелёного» синтеза) в щелочной среде из водного экстракта петрушки P. crispum (Korotkova АМ et al., 2019; Korotkova АМ et al., 2021). Наночастицы имели мелкодисперсную структуру пластинчатой формы диаметром менее ~50 нм.

При введении в питательную среду НЧ ZnFe₂O₄ предварительно проводилась их обработка ультразвуком в течение 4 ч. После автоклавирования и перед использованием среды также проводилась обработка ультразвуком в течение 2 ч. Контролем служила среда без добавления НЧ ZnFe₂O₄. Эксперимент проводился в 3-кратной повторности.

Фиксация наблюдений проводилась в течение 1 пассажа (30 дней). Проводилось микроскопирование клеток каллуса. Определяли сухую и сырую биомассу, жизнеспособность (окрашивание клеток синькой Эванса в камере Горяева и подсчёт мёртвых и жизнеспособных клеток), индекс роста рассчитывали по следующей формуле:

$I=\frac{W_t-W_0}{W_0}$

где W₀ – начальная масса каллуса, г;

W_t – масса каллуса в конце цикла выращивания, г.

Оборудование и технические средства. Все исследования на этапе культивирования растений и каллусов базилика проводились на базе лаборатории биотехнологии РГАУ МСХА им. К.А. Тимирязева. Биологическая активность нанопорошков определялась в лаборатории биологических испытаний и экспертиз ЦКП БСТ РАН (http://цкп-бст.рф).  

Статистическая обработка. Математическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью статистических функций приложения «Microsoft Office Excel 2013» («Microsoft», США). Результаты представлены в виде среднего (M) и стандартной ошибки среднего (m). Достоверность различий сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования.

Исходя из данных таблицы 1, можно сказать, что концентрация 25 мкг/л НЧ ZnFe₂O₄ существенно увеличивает накопление сырой биомассы каллусной культуры по сравнению со всеми опытными вариантами и контролем. Явных различий между контролем и средой с добавлением 12,5 мкг/л НЧ ZnFe₂O₄ не наблюдалось. Существенных различий в накоплении сухой биомассы между всеми вариантами и контролем не установлено. Наибольший индекс роста наблюдается в 3 варианте среды (MS+2 мг/л 2,4-Д+25 мкг/л НЧ), наименьший – в 4 (MS+2 мг/л 2,4-Д+50 мкг/л НЧ). Самая высокая жизнеспособность наблюдалась в контрольном варианте. В свою очередь при добавлении НЧ ZnFe₂O₄ во всех вариантах жизнеспособность клеток каллуса снижалась.

 

Таблица 1. Показатели каллусной культуры при культивировании на среде MS+2 мг/л 2,4-Д с различными концентрациями НЧ ZnFe₂O₄

Table 1. Indicators of callus culture when cultivated on MS+2 mg/l 2,4-D medium with various concentrations of NPs ZnFe₂O₄

Гормональный состав питательной среды и содержание НЧ ZnFe2O4 / Hormonal composition of the nutrient medium and content of NP ZnFe2O4	Сырая биомасса, г / Raw biomass, g	Сухая биомасса, г / Dry biomass, g	Индекс роста / Growth index	Жизнеспособность клеток, % / Cell viability, %
Контроль / Control	1,27±0,02	0,08±0,02	2,85	83,16…96,85
MS+2 мг/л 2,4-Д+12,5 мкг/л НЧ /MS+2 mg/l 2,4-D+12,5 μg/l NP	1,30±0,03	0,07±0,04	2,94	54,00±9,00
MS+2 мг/л 2,4-Д+ 25 мкг/л НЧ / MS+2 mg/l 2,4-D+ 25 μg/l NP	1,50±0,06	0,08±0,02	3,55	62,00±5,00
MS+2 мг/л 2,4-Д+ 50 мкг/л НЧ / MS+2 mg/l 2,4-D+ 50 μg/l NP	1,02±0,09	0,05±0,03	2,09	75,00±7,00

 

На рисунке 1 видно, что каллус на среде MS+2 мг/л 2,4-Д+25 мкг/л НЧ ZnFe₂O₄ является более однородным по сравнению с другими вариантами сред, более антоциан-окрашенным, самым крупным и по своему виду очень схож с контролем. Каллус, полученный на среде с добавлением 50 мкг/л НЧ ZnFe₂O₄, получился рыхлым, а на среде с добавлением 12,5 мкг/л НЧ ZnFe₂O₄, наоборот – плотным.

 

Рисунок 1. Каллус O. basilicum, полученный при культивировании на среде MS+2 мг/л с добавлением различных концентраций НЧ ZnFe₂O₄: 1 – контроль; 2 – MS+2 мг/л 2,4-Д+12,5 мкг/л НЧ; 3 – MS+2 мг/л 2,4-Д+25 мкг/л НЧ; 4 – MS+2 мг/л 2,4-Д+50 мкг/л НЧ

Figure 1. Callus of O. basilicum obtained by cultivation on MS+2 mg/l medium with the addition of various concentrations of NPs ZnFe₂O₄: 1 – control; 2 – MS+2 mg/l 2,4-D+12.5 μg/l NPs; 3 – MS+2 mg/l 2,4-D+25 μg/l NPs; 4 – MS+2 mg/l 2,4-D+50 μg/l NPs 

 

Обсуждение полученных результатов.

Внесение средней концентрации 2,4-Д (2 мг/л) в среду приводило к увеличению биомассы первичных каллусов, что благоприятнее сказывается на интенсивности каллусогенеза по сравнению с другими ауксинами (ИУК) и цитокинином БАП. Известно, что используемые нами ауксины (2,4-Д и ИУК) не являются взаимозаменяемыми. Так, в зависимости от концентрации 2,4-Д либо увеличивает рост клеток растяжением, либо стимулирует клеточные деления. При этом ИУК влияет не только на деление и растяжение клеток, но и на скорости синтеза вторичных метаболитов (Palni LM, 1988).

Известно, что цитокинины (в нашем случае – БАП) увеличивают чувствительность клеток к ауксинам и изменяют эндогенный метаболизм ауксина, уменьшая активность оксидаз (Palni LM, 1988). Однако внесение в среду БАП при постоянном количестве ауксина (ИУК) в питательной среде не приводит к заметному увеличению показателей биомассы.

В некоторых случаях для того, чтобы получить морфогенный отклик, достаточно использовать только ауксин или цитокинин. Кроме того, их эффекты могут быть прямо противоположными. Так, нами показано, что культивирование каллусной культуры на среде с ауксином способствовало увеличению биомассы каллуса, в то время как добавление цитокинина данный показатель ингибировало.

Следует отметить, что в стимуляции морфогенеза, инициирования и поддержания каллусных культур участвуют и другие метаболиты, в частности, минеральные компоненты. Выбор солевой среды может влиять как на ход морфогенеза in vitro, так и на сохранение морфогенетического потенциала каллусных культур. Нами было установлено, что «сильные» растворы MS способствуют лучшему росту эмбриоидов.

Представленные результаты показывают, что в то время как каллусы продолжают интенсивный рост на среде с гормонами (контрольный вариант), каллусы на фоне наноматериалов последовательно снижают прирост сырой биомассы и останавливаются в росте. Увеличение концентрации ZnFe₂O₄ приводило к отрицательному ответу ионов, что может быть связано с повреждением клеточной стенки (Kokina I et al., 2017). Хорошо известно, что более высокие концентрации НЧ проявляют токсичность как в тканях животных, так и в тканях растений (Nguyen NHA et al., 2018). Вероятно, НЧ посредством прикрепления к каллусу могут вызывать морфологические и физиологические изменения механическим путём (Tombuloglu H et al., 2019). Возможный механизм действия НЧ на растительную клетку заключается в том, что НЧ чрезвычайно реакционноспособны, поэтому могут легко прикрепляться к поверхности растительной клетки и высвобождаемые ионы Fe+3 на поверхности клеток легко впитываются в клетки благодаря меньшему размеру частиц, что приводит к изменению роста и развития растений (Al-Amri N et al., 2020). Причём ионы в высоких концентрациях могут ограничивать цепь переноса электронов хлоропластов и митохондрий, что может привести к окислительному взрыву с высокой концентрацией АФК, вызывая гибель клеток (Khan MN et al., 2017), что, в свою очередь, снижает частоту индукции каллуса.

Известно, что наночастицы сильно влияют на физиологию каллуса и вторичный метаболизм, вызывая ситуацию окислительного стресса в каллусной ткани. В конечном итоге это активирует метаболические реакции растений – смягчение последствий окислительной вспышки за счёт производства различных фитохимических веществ (Choi O, Hu Z, 2008).

Можно предположить, что наноматериалы, имеющие чрезвычайно малые размеры, входят в экспланты и впоследствии могут влиять на генетическое перепрограммирование (Martınez-Fernandez D et al., 2016). Аналогичным образом, влияние НЧ на растения также зависит от концентрации частиц, вида растений и времени экспозиции (Zuverza-Mena N et al., 2017).

Аналогичные результаты получены Shankramma K с коллегами (2016) на растениях томата, которые показали снижение частоты регенерации при высокой концентрации наночастиц оксида железа. Напротив, другие авторы показали существенное влияние железосодержащих наноматериалов на индукцию каллусогенеза (Li J et al., 2016; Abbasi BA et al., 2019).

Заключение.

O.basilicum является важным лекарственным растением и нуждается в устойчивых средствах для увеличения производства биомассы и лекарственных метаболитов. В настоящем исследовании был стандартизирован возможный протокол формирования каллуса. В результате проведённых исследований установлено, что для каллусогенеза лучшими первичными эксплантами являются стебли растений сорта Русский гигант фиолетовый, полученные на среде MS+2 мг/л 2,4-Д. Добавление ZnFe₂O₄ in vitro в сочетании с MS и 2 мг/л 2,4-Д приводило к пролиферации каллуса. Было обнаружено, что применение ZnFe₂O₄ в дозе 25 мкг/л индуцирует максимальный прирост сырой биомассы и наибольший индекс роста каллусов. При этом, для получения жизнеспособных каллусных линий необходимо присутствие в MS-среде ауксина (2,4-Д) (контроль).

About the authors

Anastasia M Gvozdikova

Federal Research Centre of Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences; Orenburg State University

Author for correspondence.
Email: anastasiaporv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7981-7245

Senior Researcher of Laboratory of Biological Testing and Expertise, Senior Researcher at the Research Center Biological Systems and Nanotechnologies

Russian Federation, 29, 9 Yanvarya St., Orenburg, 460000; 13 Pobedy Ave., Orenburg, 460018

Oksana B Polivanova

Russian State Agrarian University - Moscow Agricultural Academy named after K.A. Timiryazev

Email: polivanovaoks@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3992-5452

Cand. Sci. (Biology), Associate Professor of the Department of Biotechnology

Russian Federation, 127434, Timiryazevskaya st., 49, Moscow, 127434

Daria G Fedorova

Orenburg State University

Email: daryaorlova24@rambler.ru

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, Associate Professor of the Department of Biology and Soil Science, Head of the Scientific Group of the Botanical Garden

Russian Federation, 13 Pobedy Ave., Orenburg, 460018

References

Supplementary files