Ultrafine particles of Co₃O₄ and Mn₂O₃ as effectors of rumen digestion in vitro

Full Text

Введение.

Современное животноводство, как оплот продовольственной безопасности, нуждается в постоянном повышении эффективности производства при минимальных затратах труда и средств, что может быть достигнуто, в частности, за счёт наиболее полной реализации генетического потенциала поголовья. Последнее же обеспечивается путём совершенствования рационов и создания кормовых добавок, максимально конвергентных физиологическим способностям организма, иными словами, в той степени способствующих усвояемости питательных веществ, насколько это практически возможно (Улитько В.Е., 2014). В представленном отношении особое внимание привлекают ультрадисперсные частицы (УДЧ) металлической природы – многопрофильные композиции с гетероморфным функционалом в отношении животного организма. Они позволяют не только эффективно покрыть недостаток в минеральных элементах, но также способствуют укреплению иммунитета, поддерживают антиоксидантный статус, улучшают пищеварение, в частности стимулируя деструкцию клетчатки, благотворно воздействуют на микроархитектуру кишечника, модулируют микробиом и окислительно-восстановительный гомеостаз, вкупе повышая производительность скота и птицы, а также качество получаемой от них продукции (Marappan G et al., 2017; Michalak I et al., 2022). Иными словами, они выступают одновременно не только как дополнительный источник макро- и микроэлементов, но и как аналог антибиотических стимуляторов роста (Michalak I et al., 2022).

В частности, известно, что кобальт используется микроорганизмами рубца жвачных для синтеза корринового ядра витамина B12. Последний же является коферментом для метилмалонил-КоА-мутазы и метионинсинтетазы, и необходим, соответственно, для метаболизма пропионата в сукцинат и превращения аминокислоты гомоцистеина в метионин с одновременной регенерацией тетрагидрофолата – предшественника пурина и пиримидина. Однако мобилизация кобальта микробиомом из пищевых субстратов и неорганических солей малоэффективна и составляет при благоприятных условиях около 13 % (González-Montaña JR et al., 2020). При этом Co-содержащие УДЧ, связываясь с белками внутренней физиологической среды, обретают своеобразную биоидентичность и эффективно сорбируются эпителиальной выстилкой желудочно-кишечного тракта (Carrillo-Carrion C et al., 2017). Кроме того, они обладают выраженной бактерицидной активностью в отношении модельных штаммов Escherichia coli и Staphylococcus aureus (Moradpoor H et al., 2019), сравнимой с действием гентамицина или окситетрациклина (Gupta V et al., 2020).

Аналогично марганец функционирует как кофактор для аргиназы, глутаминсинтетазы, пируваткарбоксилазы, Mn-супероксиддисмутазы и участвует, соответственно, в гидролизе аргинина до орнитина и мочевины, АТФ-зависимом превращении глутамата в глутамин, синтезе оксалацетата из пирувата и обезвреживании супероксидных анион-радикалов (Avila DS et al., 2013). Однако, как и в случае с кобальтом, сорбция марганца в организме жвачных крайне мала и составляет не более 1 % (Spears JW, 2019). В то же время внесение Mn-депонированных УДЧ с эксплицитными антибиотическими свойствами как против грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, так и в отношении грибов, например, Trichophyton simii, Curvularia lunata, Aspergillus niger и Candida albicans (Hoseinpour V and Ghaemi N, 2018) в рацион птицы позволило значительно повысить всасываемость данного микроэлемента в подвздошной кишке (Matuszewski A et al., 2020).

Соответственно, марганец и кобальт как компоненты металлоферментов критически важны для широкого спектра обменных процессов, включая метаболизм белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот, процессы роста и развития, пищеварения и детоксикации, выработки энергии и регуляции активности нейронов (González-Montaña JR et al., 2020; Avila DS et al., 2013), причём наиболее перспективной формой введения их в рацион животных выступают УДЧ, позволяющие снизить необходимые дозировки в сравнении с объёмистыми минералами и экскрецию элементов с непереваренными остатками корма на фоне повышения биодоступности. Как следствие, сокращаются нагрузка на окружающую среду и экономические расходы (Michalak I et al., 2022).

Однако при тех же условиях, в силу своих малых размеров и вытекающей из этого высокой реакционной способности УДЧ могут быть крайне токсичны (Kumar V et al., 2017), что побуждает к детальной оценке их свойств, включая влияние на микробиом-опосредованные процессы в пищеварении, до начала физиологических опытов, то есть in vitro.

Цель исследования.

Определить потенциал УДЧ Co₃O₄ и Mn₂O₃ как стимуляторов пищеварительных процессов на модели искусственного рубца.

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Рубцовая жидкость бычков казахской белоголовой породы средней массой 266±1,53 кг и возрастом 11-12 месяцев.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: Модельный закон Межпарламентской Ассамблеи государств-участников Содружества Независимых Государств "Об обращении с животными", ст. 20 (постановление МА государств-участников СНГ № 29-17 от 31.10.2007 г.), Руководство по работе с лабораторными животными (http://fncbst.ru/?page_id=3553). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов. 

Схема эксперимента. Исследования выполнены в ЦКП БСТ РАН http://цкп-бст.рф согласно таблице 1.

 

Таблица 1. Схема экспериментальных работ

Table 1. Experimental scheme

Опыты / Experiments	Дозировки исследуемых УДЧ (мг/кг СВ) и содержание в них элементов-металлов / Dosages of the studied UFPs (mg/kg DM) and the content of elements-metals in them
	Mn2O3	чистый Mn / Pure Mn	Co3O4	чистый Co / Pure Co
Контроль/Control	-	-	-	-
I	19,3	13,4	0,3	0,2
II	38,6	26,8	0,6	0,4
III	77,2	53,7	1,2	0,9

 

Переваримость сухого вещества базового субстрата (пшеничные отруби) при внесении исследуемых УДЧ определяли с помощью установки инкубатора и буферного раствора по специализированной методике. Для чего у животных (n=3), рацион которых включал сено злаковое (1 кг), сено бобовое (2 кг), силос кукурузный (9,5 кг), дроблёную зерносмесь (2 кг), жмых подсолнечный (0,1 кг), патоку кормовую (0,6 кг), соль поваренную (37 г), монокальцийфосфат (47,7 г) и премикс (20 г) через хроническую фистулу (d=80 мм, ANKOM Technology Corporation, США) отбирали пробы рубцового содержимого. Транспортировку осуществляли в течение 30 минут, поддерживая температурный режим +38,5…+39,5 °С. Перед использованием рубцовую жидкость тщательно встряхивали и процеживали через 4 слоя марли. Заранее мешочки из полиамидной ткани (n=10) взвешивали и нумеровали, в них помещали по 500 мг пшеничных отрубей и запаивали. Рубцовую жидкость, разведённую буфером в соотношении 1:4, насыщали углекислым газом и по 2 л размещали в ёмкостях искусственного рубца (ANKOM Daisy II, США), задавая программу: 48 ч при +39,5 °С. По окончании инкубации образцы промывались и высушивались при температуре +60 °С до константного веса. Коэффициент переваримости определяли по формуле:

$К=\frac{(m1-m2)}{500}\times 100\%$,

где m1 – масса высушенного мешочка с кормом, после переваривания;

m2 – масса мешочка без корма.

Численность простейших в рубцовой жидкости устанавливали с помощью камеры Горяева. Для этого в пробирку отбирали 5 мл профильтрованного содержимого рубца и добавляли 0,1 мл 4 % раствора формалина для фиксации инфузорий и 20 мкл метиленового синего. Встряхивали 1-2 мин. В камеру с сеткой Горяева под покровное стекло вносили 1 каплю жидкости и подсчитывали количество инфузорий в 225 больших квадратах, после чего определяли число простейших в 1 мл рубцового содержимого по формуле:

$N=\frac{1000\times n\times b}{s\times h}=\frac{1000\times n\times 5}{225\times \mathrm{0,04}\times \mathrm{0,1}}=\frac{1}{9}n\times 50000$,

где n – количество клеток, подсчитанных в определенном секторе;

b – кратность разведения пробы;

S – площадь исследуемого сектора;

h – глубина счётной камеры.

Общую микробиальную массу определяли путём центрифугирования и трёх- пятикратной отмывки при 10000 g в течение 15 мин (центрифуга «Mini», GYROZEN Co., Ltd., Южная Корея).

Уровень летучих жирных кислот (ЛЖК) в содержимом рубца устанавливали методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационном детектированием на хроматографе газовом «Кристаллюкс-4000М (СКБ Хроматек, Россия), формы азота – по ГОСТ 26180-84, ГОСТ 13496.4-2019.

Оборудование и технические средства. Исследования выполнены в ЦКП БСТ РАН (http://цкп-бст.рф). Установка-инкубатор «ANKOM Daisy II» (Ankom Technology, США), стерилизатор воздушный ГП-80 СПУ (ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия), хроматограф газовый «Кристаллюкс-4000М (СКБ Хроматек, Россия), центрифуга «Mini» (GYROZEN Co., Ltd., Южная Корея), камера Горяева (ООО «МиниМед», Россия).

Статистическая обработка. Экспериментальные данные обрабатывали с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением «Excel 2016» («Microsoft», США) с обработкой данных в «Statistica 12» («Stat Soft Inc.», США). Рассчитывали среднее (М), среднеквадратичное отклонение (±σ), стандартную ошибку (±SE). Для сравнения вариантов использовали непараметрический метод анализа. Различия считали статистически значимыми при * – Р ≤ 0,05, ** – Р ≤ 0,01.

Результаты исследований.

УДЧ Co₃O₄ и Mn₂O₃ в зависимости от концентраций оказали различное влияние на переваримость базового субстрата (табл. 2). Так, минимальные дозировки способствовали незначительному повышению коэффициента переваримости сухого вещества корма in vitro, в то время как промежуточные достоверно увеличивали его на 4,49 и 5,05 % (P≤0,01) соответственно. Одновременно заметно возрастало количество инфузорий, однако общая микробиальная масса менялась в малом диапазоне, хотя и имела тенденцию к росту. Напротив, повышенные дозы УДЧ угнетали пищеварительные процессы и микробиом.

 

Таблица 2. Коэффициент переваримости, количество инфузорий и микробиальная масса

Table 2. Digestibility coefficient, number of infusoria and microbial mass

Группа / Group	Концентрация, мг/кг СВ / Concentration, mg/kg DM	Коэффициент переваримости / Digestibility coefficient	Количество инфузорий в 1 мл рубцовой жидкости (тыс. шт.) / The number of infusoria in 1 ml of ruminal fluid (thousand pcs.)	Микробиальная масса, (мг/мл) / Microbial mass, (mg/ml)
Контроль / Control		63,77±0,92	666,7±44,4	70,8±3,5
УДЧ Mn2O3 / Mn2O3 UFP	19,3	64,12±0,92	788,9±33,3	72,1±5,8
	38,6	68,26±0,84**	1022,2±44,4*	74,4±5,1
	77,2	59,83±0,96*	402,8±11,1*	67,1±4
УДЧ Co3O4 / Co3O4 UFP	0,3	65,21±0,97	708,3±19,4	68,2±5,5
	0,6	68,82±0,95**	894,4±38,9*	66,4±4,6
	1,2	61,3±1,11	405,6±22,2*	69,3±4,2

Примечание: * – Р≤0,05; ** – Р≤0,01 при сравнении с контролем

Note: * – Р≤0.05; ** – Р≤0.01 when compared with the control

 

В свою очередь концентрация уксусной кислоты достоверно увеличивалась (Р≤0,05) на 5,6 % во II опыте с УДЧ Mn₂O₃ (рис. 1), но фактически не менялась в аналогичном случае с УДЧ Co₃O₄ (рис. 2).

 

Рисунок 1. Концентрация летучих жирных кислот рубцовой жидкости после инкубирования с УДЧ Mn₂O₃, мг/%

Figure 1. Concentration of volatile fatty acids in rumen fluid after incubation with UFP Mn₂O₃,
mg/% 

Примечание: * – Р≤0,05; ** – Р≤0,01 при сравнении с контролем

Note: * – Р≤0.05; ** – Р≤0.01 when compared with the control

 

Рисунок 2. Концентрация летучих жирных кислот рубцовой жидкости после инкубирования с УДЧ Co₃O₄, мг/%

Figure 2. Concentration of volatile fatty acids in rumen fluid after incubation with UFP Co₃O₄, mg/%

Примечание: * – Р≤0,05; ** – Р≤0,01 при сравнении с контролем

Note: * – Р≤0.05; ** – Р≤0.01 when compared with the control

 

Тем не менее, количество пропионовой и масляной кислот существенно увеличивалось в обоих экспериментах. Аналогично с коэффициентом переваримости уровень ацетата и пропионата снижался при высоких дозах УДЧ. В противоположность этому количество бутирата несколько повышалось. В то же время в опытных группах по сравнению с контролем снижалось соотношение ацетат-пропионат в диапазоне 14,5-24,6 %. При этом УДЧ не оказали существенного влияния на величину водородного показателя, уровень рН в контроле и опытных образцах был в пределах нормы и составлял 6,4-6,8.

Аналогично, как в случае с УДЧ Mn₂O₃, так и с УДЧ Co₃O₄ в опыте II в рубцовой жидкости повышалось содержание общего азота на 18,3 и 13,6 % (Р≤0,05) соответственно параллельно с увеличением концентрации белкового – на 20,7 и 14,3 % (рис. 3, 4).

 

Рисунок 3. Концентрация азота рубцовой жидкости после инкубирования с УДЧ Mn₂O₃, мг/%

Figure 3. Nitrogen concentration in rumen fluid after incubation with UFP Mn₂O₃, mg/% 

Примечание: * – Р≤0,05; ** – Р≤0,01 при сравнении с контролем

Note: * – Р≤0.05; ** – Р≤0.01 when compared with the control

 

Рисунок 4. Концентрация азота рубцовой жидкости после инкубирования с УДЧ Co₃O₄, мг/%

Figure 4. Nitrogen concentration in ruminal fluid after incubation with UFP Co₃O₄, mg/% 

 

При этом количество небелкового азота, включая аммиачный и мочевинный, в I и II опытах достоверно не менялось, но снижалось при высоких дозах (III опыт).

Таким образом, установлено позитивное влияние УДЧ Mn₂O₃ и Co₃O₄ в дозах 38,6 и 0,6 мг/кг СВ корма на коэффициент переваримости, микробиальную биомассу и ферментативные процессы в рубце, выражающиеся в увеличении уровня ЛЖК, а также концентрации общего и белкового азота.

Обсуждение полученных результатов.

Изменение динамики пищеварительных процессов в рубце in vitro при добавлении макро- и микроэлементов в различных формах, включая УДЧ, может быть обусловлено двумя взаимодополняющими механизмами, уже упоминаемыми ранее, а именно инкорпорацией в физиологические процессы ионов металлов и их антибиотическим действием в отношении ряда условно патогенных и некоторых иных комменсальных форм (Moradpoor H et al., 2019; Gupta V et al., 2020; Hoseinpour V and Ghaemi N, 2018).

Последнее же, учитывая сложность и многообразие внутрисистемных взаимодействий микробиоты, среди которых интеграция между:

1) фибролитическими и протеолитическими бактериями (отвечает за устранение продуктов распада белка – жирных кислот с разветвлённой цепью и аммиака);

2) сукцинатпродуцирующими и утилизирующими прокариотами (определяет превращение уксусной кислоты в пропионовую);

3) лактатвырабатывающими и расщепляющими его микроорганизмами (Megasphaera elsdenii и Selenomonas ruminantium превращают молочную кислоту в ацетат, пропионат и бутират);

4) межвидовой перенос водорода (повышение концентрации ацетата и АТФ при одновременном снижении количества восстановленных продуктов ферментации, таких как лактат, этанол, сукцинат и пропионат).

Вкупе всё вышеперечисленное непосредственно сказывается на общетаксономическом профиле и суммарном метаболическом эффекте (Nagaraja TG, 2016).

Так, в частности, при скармливании бычкам казахской белоголовой породы CoCl₂ в количестве 39 мг/гол. в рубцовом содержимом наблюдалось смещение в сторону грамотрицательных бактерий при уменьшении доли грамположительных, соответственно, увеличилось число представителей типов Verrucomicrobia и Bacteroidetes (Ryazanov V et al., 2023). В то же время общее число видов уменьшилось относительно контрольной группы на 2,4 %, индекс Симпсона был ниже на 50 %, что свидетельствует о более равномерном распределении прокариот в сообществе. Всё это, в сущности, позволяет говорить о возможностях модуляции целлюлозолитической, амилолитичекой, сахаролитической, липолитической, протеолитической и фибролитической активности рубцового содержимого (Nagaraja TG, 2016; Мирошникова М.С., 2020; Колоскова Е.М. и др., 2020).

В то же время установлено, что повышение концентрации кобальта в среде пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii стимулирует синтез и накопление корриноидов (Каменская Ю.В., 2019). Они же интенсифицируют размножение инфузорий (Bonhomme A et al., 1982), в частности растительноядных представителей родов Entodinium и Diplodinium (Entodinium nanellum, Entodinium ovinum, Diplodinium bubalidis ssp. bubalidis), обладающих целлюлозолитической активностью, а также отдельных видов, расщепляющих крахмал с образованием уксусной, пропионовой и масляной кислот – Entodinium ecaudatum, Isotricha intestinalis, Dasytricha ruminantium, Entodinium simulans – dubardi, Ophryoscolex caudatus, что соответствует описанной ранее динамике концентрации ЛЖК, общего и белкового азота. Более того, большая часть эндобионтных реснитчатых, и в особенности некоторые хищные особи (Entodinium bursa), активно поедают бактерии, сдерживая тем самым их массовое размножение (Черная Л.В., 2016).

Что же касательно марганца, то он особенно необходим представителям родов Lactiplantibacillus и Lacticaseibacillus, а также, в меньшей степени, Bacillus subtilis и другим Bacillota (Firmicutes) для нейтрализации АФК, регуляции процессов роста и развития (Bosma EF et al., 2021). В свою очередь молочнокислые бактерии и сенная палочка, вырабатывающие антимикробные пептиды – бактериоцины, обладают выраженными пробиотическими характеристиками: модулируют микробиом, способствуют переваримости клетчатки, снижают выбросы метана, риск ацидоза и аллергических реакций, выделение Escherichia coli с калом, повышают концентрацию ЛЖК и продуктивность жвачных животных (Bidarkar VK et al., 2014; Chang M et al., 2021; Doyle N et al., 2019). Путём конкурентного исключения в процессе симбиоза они формируют пищевой иммунитет хозяина, так как марганец также связан с вирулентностью некоторых прокариот (Bosma EF et al., 2021). При этом добавки сульфата и хелата марганца с базальным содержанием микроэлемента 150 мг/кг сухого вещества корма в рационе ягнят способствовали переваримости питательных веществ и увеличивали биомассу протозойной и бактериальной фракции рубцового содержимого (Gresakova L et al., 2018). Аналогично Mn-метионин, MnSO₄ и MnCl₂ повышали концентрацию ЛЖК, в частности ацетата и пропионата, аммиачного азота, усвояемость сухого вещества, активность амилазы, трипсина, целлюлазы и липазы, а также содержание микробного белка у яков (Lu H et al., 2023).

При этом, однако, полученные ранее результаты по применению неорганических солей марганца и кобальта требуют, как правило, больших дозировок либо же демонстрируют меньшую эффективность. Так, например, CoCl₂ в дозе 1,5 мг/кг сухого вещества способствовал повышению коэффициента переваримости на 1,5 % (против полученных в представленной работе 4,49 %), а MnSO₄ уступал по данному показателю in situ химически чистому марганцу в наноформе (разница составила 4,2 %) (Шейда Е.В. и др., 2022; Дускаев Г.К. и др., 2016).

Эффективность модели «искусственного рубца» доказана в исследованиях, посвящённых изучению биологических свойств УДЧ железа, оксидов хрома и кремния (Лебедев С.В. и др., 2023; Шейда Е.В. и Лебедев С.В., 2023; Камирова А.М. и Сизoвa Е.А., 2023).

Иными словами, УДЧ эссенциальных элементов обладают большим потенциалом в животноводстве как эффекторы рубцового пищеварения, нежели неорганические соли. Однако следует отметить, что суммарный эффект от их внедрения определяется не только дозировками и физико-химическими характеристиками, но и комплексными взаимодействиями с другими компонентами премиксов и кормовым субстратом (Ильичев Е. и др., 2011; Нуржанов Б.С., 2020), что обуславливает актуальность дальнейших исследований механизмов метаболических инклюзий УДЧ.

Заключение.

УДЧ Mn₂O₃, и Co₃O₄ в дозировках 38,6 и 0,6 мг/кг сухого вещества корма способствуют переваримости пшеничных отрубей in vitro, одновременно увеличивая концентрацию летучих жирных кислот (уксусной, пропионовой и масляной), общего и белкового азота в рубцовом содержимом, на фоне увеличения численности простейших и общей микробиальной массы.

About the authors

Daniil E Shoshin

Federal Research Centre of Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences; Orenburg State University

Author for correspondence.
Email: daniilshoshin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3086-681X

Postgraduate student, Laboratory Researcher of the Centre for Nanotechnologies in Agriculture, Assistant at the Scientific and Educational Center «Biological Systems and Nanotechnologies»

Russian Federation, 9 Yanvarya St., Orenburg, 460000; 13 Pobedy Ave., Orenburg, 460018

Elena A Sizova

Federal Research Centre of Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences; Orenburg State University

Email: sizova.l78@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5125-5981

Dr. Sci. (Biology), Head of the Centre for Nanotechnologies in Agriculture, Professor of the Scientific and Educational Center «Biological Systems and Nanotechnologies»

Russian Federation, 29, 9 Yanvarya St., Orenburg, 460000; 13 Pobedy Ave., Orenburg, 460018

Ayna M Kamirova

Federal Research Centre of Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences

Email: ayna.makaeva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1474-8223

Cand. Sci. (Biology), Researcher of the Centre for Nanotechnologies in Agriculture

Russian Federation, 9 Yanvarya St., Orenburg, 460000

Anastasia P Ivanishcheva

Federal Research Centre of Biological Systems and Agrotechnologies of the Russian Academy of Sciences

Email: nessi255@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8264-4616

Junior Researcher at the Testing Center of the Common Use Center

Russian Federation, 9 Yanvarya St., Orenburg, 460000

References

Supplementary files