Modified quantitative approach for assessing peripheral blood TREC and KREC levels in immunodeficient patients

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. The immune status is a multifaceted parameter quantitatively and qualitatively analyzing functional activity immune system state in immune organs as well as some non-specific mechanisms of antimicrobial protection. Peripheral blood level of T-receptor excision rings (TREC) and B-cell excision rings (KREC), respectively, can serve as surrogate markers of T- and B-cell maturation. Currently, the diagnostic kits available on the market have two significant disadvantages: i) the kits are aimed at diagnosing immunodeficiency conditions only in newborns and children, while keeping adult patients uncovered; ii) essentially, use solely single reference normalization gene for data normalization resulting in increased variability and decreased sensitivity of the assay data. The aim: to develop a highly sensitive method for laboratory assessment of the state of immunity in immunodeficient patients by using real-time PCR for assessing TREC and KREC level in children and adults. Materials and methods. There were used whole blood and dry blood spot samples obtained from newborns and adults, apparently healthy individuals as well as patients with verified PID and HIV-infection. A total of 2577 samples were examined. Commercial kits were used as comparison methods. Results. Multiplex PCR was carried out, analyzing the number of target molecules TREC and KREC, as well as fragments of the HPRT and RPP30 normalization genes analyzed with the developed series of plasmid calibrators. The established analytical range of TREC/KREC DNA measurements comprised 103 to 109 copies/mL. The accuracy of measurements on a tablet-type instrument (CFX) was 95.84%, on a rotary-type instrument (Rotor-Gene 3000) — 95.11%, which corresponds to the standard indicator. The equivalence between the data obtained after assessing whole blood samples and dry blood drops was shown. The data analysis allowed to find out 100%-diagnostic specificity and sensitivity of the method proposed. Conclusion. The method developed by us allows to diagnose decline in T- and/or B-cell immunity in children and adults and can be used to detect TREC and KREC molecules both in peripheral whole blood samples and dry blood spots using Guthrie cards. Moreover, the uniform values of reference norms can be used regardless of the type of analyzed clinical material. The study data evidence about potential for effective use of multiplex PCR diagnostics both for complex primary testing/screening of newborns and assessing state of immunity to identify adult patients with PID and as a part of the diagnostic monitoring of patients with secondary immunodeficiencies, e.g., HIV infection.

About the authors

M. A. Saitgalina

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: Sajgalinam@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St.Petersburg

Yu. V. Ostankova

St. Petersburg Pasteur Institute

Author for correspondence.
Email: shenna1@yandex.ru

PhD (Biology), Head of the Laboratory of HIV Immunology and Virology; Senior Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

N. E. Liubimova

St. Petersburg Pasteur Institute

Email: natelu@mail.ru

PhD (Biology), Researcher, Laboratory of Molecular Immunology

Russian Federation, St. Petersburg

A. V. Semenov

Ekaterinburg Research Institute of Viral Infections of SRC VB Vector of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing

Email: alexvsemenov@yahoo.com

PhD, MD (Biology), Director

Russian Federation, Ekaterinburg

R. N. Kuznetsova

St. Petersburg Pasteur Institute; I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: kuznetzova.rais@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1668-6716

PhD (Medicine), Allergologist-Immunologist, Associate Professor, Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

A. A. Totolian

St. Petersburg Pasteur Institute; I.P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University of the Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: totolian@spbraaci.ru

RAS Full Member, PhD, MD (Medicine), Professor, Director, Head of the Department of Immunology

Russian Federation, St. Petersburg; St. Petersburg

References

  1. Гордукова М.А., Корсунский И.А., Чурсинова Ю.В., Бяхова М.М., Оскорбин И.П., Продеус А.П., Филипенко М.Л. Определение референсных интервалов TREC и KREC для скрининга новорожденных с иммунодефицитными состояниями в РФ // Медицинская иммунология. 2019. Т. 21, № 3. C. 527–538. [Gordukova M.A., Korsunsky I.A., Chursinova Yu.V., Byakhova M.M., Oscorbin I.P., Prodeus A.P., Filipenko M.L. Determining reference ranges for TREC and KREC assays in immune deficiency screening of newborns in Russian Federation. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2019, vol. 21, no. 3, рр. 527–538. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2019-3-527-538
  2. Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., Смирнова А.С., Никитина И.А., Корсунский И.А., Филипенко М.Л., Продеус А.П. Разработка набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени // Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 5. С. 467–478. [Gordukova M.A., Oskorbin I.P., Mishukova O.V., Zimin S.B., Zinovieva N.V., Davydova N.V., Smirnova A.S., Nikitina I.A., Korsunsky I.A., Filipenko M.L., Prodeus A.P. Development of real-time multiplex PCR for the quantitative determination of TREC’s and KREC’s in whole blood and in dried blood spots. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2015, vol. 17, no. 5, pp. 467–478. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478
  3. Евгина С.А., Савельев Л.И. Современные теория и практика референтных интервалов // Лабораторная служба. 2019. T. 8, № 2. С. 36–44. [Evgina S.A., Saveliev L.I. Сurrent theory and practice of reference interval. Laboratornaya sluzhba = Laboratory Service, 2019, vol. 8, no. 2, pp. 36–44. (In Russ.)] doi: 10.17116/labs2019802136
  4. Корсунский И.А., Гордукова М.А., Мунблит Д.Б., Козлов И.Г., Продеус А.П., Корсунский А.А. Клинические и эпидемиологические аспекты первичных иммунодефицитных состояний и их раннего обнаружения // Медицинская иммунология. 2017. Т. 19, № 5. С. 505–512. [Korsunskiy I.A., Gordukova M.A., Munblit D.B., Kozlov I.G., Prodeus A.P., Korsunskiy A.A. Clinical and epidemiological aspects of primary immunodeficiency diseases (PID) and early diagnosis options. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2017, vol. 19, no. 5, pp. 505–512. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2017-5-505-512
  5. Латышева Т.В., Латышева Е.А., Мартынова И.А., Аминова Г.Э. Пульмонологические проявления у взрослых пациентов с дефектом гуморального звена иммунитета // Терапевтический архив. 2016. Т. 88, № 8. С. 127–134. [Latysheva T.V., Latysheva E.A., Martynova I.A., Aminova G.E. Pulmonary manifestations in adult patients with a defect in the humoral link of immunity. Terapevticheskii arkhiv = Therapeutic Archive, 2016, vol. 88, no. 8, pp. 127–134. (In Russ.)] doi: 10.17116/terarkh2016888127-134
  6. Патент № 2756979 Российская Федерация, МПК C12Q 1/686 (2018.01), C12Q 1/6876 (2018.01). Способ лабораторной персонифицированной диагностики состояния иммунитета новорожденных и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченных зондов: № 2019142752; заявлено 17.12.2019: опубликовано 07.10.2021 / Семенов А.В., Останкова Ю.В., Любимова Н.Е., Тотолян Арег А. Патентообладатель: ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера. 20 с. [Patent No. 2756979 Russian Federation, Int. Cl. C12Q 1/686 (2018.01), C12Q 1/6876 (2018.01). A method for laboratory personalized diagnosis of the state of immunity in newborns and a set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labeled probes: No. 2019142752; application: 17.12.2019: date of publication 07.10.2021 / Semenov A.V., Ostankova Yu.V., Liubimova N.E., Totolian Areg A. Proprietor: FBUN NII epidemiologii i mikrobiologii imeni Pastera. 20 p. (In Russ.)]
  7. Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых // Медицинская иммунология. 2014. Т. 4, № 16. C. 367–374. [Tuzankina I.A., Karakina M.L., Vlasova E.V. Analysis of the clinical manifestations of the onset of primary immunodeficiencies in adults. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2014, vol. 4, no. 16, pp. 367–374. (In Russ.)] doi: 10.15789/1563-0625-2014-4-367-374
  8. Arismendi M.I., Kallas E.G., Santos B.A., Carneiro-Sampaio M.M., Kayser C. Thymopoiesis and regulatory T cells in healthy children and adolescents. Clinics, 2012, vol. 67, no. 5, pp. 425–429. doi: 10.6061/clinics/2012(05)04
  9. Baker M.W., Grossman W.J., Laessig R.H., Hoffman G.L., Brokopp C.D., Kurtycz D.F., Cogley M.F., Litsheim T.J., Katcher M.L., Routes J.M. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol., 2009, vol. 124, no. 3, pp. 522–527. doi: 10.1016/j.jaci.2009.04.007
  10. Dar N., Gothelf D., Korn D., Frisch A., Weizman A., Michaelovsky E., Carmel M., Yeshayahu Y., Dubnov-Raz G., Pessach I.M., Simon A.J., Lev A., Somech R. Thymic and bone marrow output in individuals with 22q11.2 deletion syndrome. Pediatr. Res., 2015, vol. 4, no. 77, pp. 579–585. doi: 10.1038/pr.2015.14
  11. Dyavar S.R., Ye Z., Byrareddy S.N., Scarsi K.K., Winchester L.C., Weinhold J.A., Fletcher C.V., Podany A.T. Normalization of cell associated antiretroviral drug concentrations with a novel RPP30 droplet digital PCR assay. Sci. Rep., 2018, vol. 8, no. 1: 3626. doi: 10.1038/s41598-018-21882-0
  12. Esber R., Theresa S., Hjort M., Wiley V. Newborn screening for primary immunodeficiencies — a method evaluation. Twin Res. Hum. Genet., vol. 21, no. 5: Special Section: Abstracts for the 42nd Human Genetics Society of Australasia Annual Scientific Meeting, Sydney, New South Wales, 2018, pp. 429–476. doi: 10.1017/thg.2018.52
  13. Hazenberg M.D., Borghans J.A., de Boer R.J., Miedema F. Thymic output: a bad TREC record. Nat. Immunol., 2003, vol. 4, no. 2, pp. 97–99. doi: 10.1038/ni0203-97
  14. Kamae C., Nakagawa N., Sato H., Honma K., Mitsuiki N., Ohara O., Kanegane H., Pasic S., Pan-Hammarström Q., van Zelm M.C., Morio T., Imai K., Nonoyama S. Common variable immunodeficiency classification by quantifying T-cell receptor and immunoglobulin -deleting recombination excision circles. J. Allergy Clin. Immunol., 2013, vol. 5, no. 131, pp. 1437–1440. doi: 10.1016/j.jaci.2012.10.059
  15. Klein S.L., Flanagan K.L. Sex differences in immune responses. Nat. Rev. Immunol., 2016, vol. 16, pp. 626–638. 10.1038/nri.2016.90
  16. Kwok J.S.Y., Cheung S.K.F., Ho J.C.Y., Tang I.W.H., Chu P.W.K., Leung E.Y.S., Lee P.P.W., Cheuk D.K.L., Lee V., Ip P., Lau Y.L. Establishing simultaneous T cell receptor excision circles (TREC) and K-deleting recombination excision circles (KREC) quantification assays and laboratory reference intervals in healthy individuals of different age groups in Hong Kong. Front. Immunol., 2020, vol. 11: 1411. doi: 10.3389/fimmu.2020.01411
  17. Laitala V., Ylikoski A., Raussi H.M., Ollikka P., Hemmilä I. Time-resolved detection probe for homogeneous nucleic acid analyses in one-step format. Anal. Biochem., 2007, vol. 361, no. 1, pp. 126–131. doi: 10.1016/j.ab.2006.11.015
  18. Pido-Lopez J., Imami N., Aspinall R. Both age and gender affect thymic output: more recent thymic migrants in females than males as they age. Clin. Exp. Immunol., 2001, vol. 125, pp. 409–413. doi: 10.1046/j.1365-2249.2001.01640.x
  19. Profaizer T., Slev P. A multiplex, droplet digital PCR assay for the detection of T-cell receptor excision circles and kappa-deleting recombination excision circles. Clin. Chem., 2019, vol. 66, pp. 229–238. doi: 10.1373/clinchem.2019.308171
  20. Quiros-Roldan E., Serana F., Chiarini M., Zanotti C., Sottini A., Gotti D., Torti C., Caimi L., Imberti L. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med., 2012, vol. 10, no. 94. doi: 10.1186/1479-5876-10-94
  21. Rechavi E., Lev A., Simon A.J., Stauber T., Daas S., Saraf-Levy T., Broides A., Nahum A., Marcus N., Hanna S., Stepensky P., Toker O., Dalal I., Etzioni A., Almashanu S., Somech R. First year of israeli newborn screening for severe combined immunodeficiency-clinical achievements and insights. Front. Immunol., 2017, vol. 8: 1448. doi: 10.3389/fimmu.2017.01448
  22. Resino S., Seoane E., Pérez A., Ruiz-Mateos E., Leal M., Muñoz-Fernández M.A. Different profiles of immune reconstitution in children and adults with HIV-infection after highly active antiretroviral therapy. BMC Infect. Dis., 2006, vol. 6: 112. doi: 10.1186/1471-2334-6-112
  23. Serana F., Chiarini M., Zanotti C., Sottini A., Bertoli D., Bosio A., Caimi L., Imberti L. Use of V(D)J recombination excision circles to identify T- and B-cell defects and to monitor the treatment in primary and acquired immunodeficiencies. J. Transl. Med., 2013, vol. 11: 119. doi: 10.1186/1479-5876-11-119
  24. Sottini A., Serana F., Bertoli D., Chiarini M., Valotti M., Vaglio Tessitore M., Lmberti L. Simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) by real-time PCR. J. Vis. Exp., 2014, vol. 94: 52184. doi: 10.3791/52184
  25. Tessitore M.V., Sottini A., Roccaro A.M., Ghidini C., Bernardi S., Martellosio G., Serana F., Lmberti L. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J. Transl. Med., 2017, vol. 15, no. 1: 70. doi: 10.1186/s12967-017-1169-9
  26. Ye P., Kirschner D.E., Kourtis A.P. The thymus during HIV disease: role in pathogenesis and in immune recovery. Curr. HIV Res., 2004, vol. 2, no. 2, pp. 177–183. doi: 10.2174/1570162043484898
  27. Van Zelm M., Van der Burg M., Langerakand A., Van Dongen J. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front. Immunol., 2011, vol. 2, no. 12, pp. 1–9. doi: 10.3389/fimmu.2011.00012

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Figure 1. Fluorescence curves reflecting dynamic reaction products formation during amplification

Download (78KB)
Indexing metadata
3. Figure 2. Fluorescence curves and calibration graphs reflecting dynamic formation of amplification reaction products in the analysis of calibrator dilutions series

Download (635KB)
Indexing metadata
4. Figure 3. In silico analysis of the fragments of human gene nucleotide sequences

Download (368KB)
Indexing metadata
5. Figure 4. ROC-curves constructed by comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy newborns and children diagnosed with primary immunodeficiency, according to the TREC (A) and KREC (B) parameters

Download (72KB)
Indexing metadata
6. Figure 5. ROC-curves constructed by comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy adults and patients with diagnosed primary immunodeficiency, according to the TREC (A) and KREC (B) parameters

Download (72KB)
Indexing metadata
7. Figure 6. ROC-curves constructed while comparing the analysis data by using the proposed modified method for samples of apparently healthy adults and HIV-infected patients: with virological ART ineffectiveness according to the TREC (A) and KREC (B) parameters; with newly diagnosed HIV infection according to the TREC (C) and KREC (D) parameters

Download (127KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2022 Saitgalina M.A., Ostankova Y.V., Liubimova N.E., Semenov A.V., Kuznetsova R.N., Totolian A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».