Phenolic compounds and spare carbohydrates content dynamics in seeds of the invasive species Acer negundo and the native species Acer tataricum in connection with their competitiveness in biocenoses

全文:

Массовое распространение инвазионных видов растений приводит к ряду проблем в природных биоценозах и существенно влияет на экономику региона (Виноградова и др., 2022). В связи с этим изучение агрессивных инвазионных видов, их взаимодействие с аборигенными видами становится все более актуальным.

На территории России встречается около 20 аборигенных видов клена (Acer L., Sapindaceae). В европейской части страны произрастают: A. tataricum L., A. pseudoplatanus L., A. campestre L., A. platanoides L.

Естественный ареал клена татарского A. tataricum L. (секция Ginnala) в основном расположен в черноземной полосе европейской части России. Он используется в озеленении, изредка дичает.

Одним из активно распространяющихся видов является клен ясенелистный – Acer negundo L. (секция Negundo), естественный ареал которого находится в Северной Америке. Он приспособился к различным почвенно-климатическим условиям и расселился от Калининграда до Владивостока (Виноградова и др., 2022). В европейской части России A. negundo стал опасным инвазионным видом, вытесняющим аборигенную флору. Он успешно произрастает в густонаселенных районах, проникая в природоохранные зоны. A. negundo отличается устойчивостью к биогенным и абиогенным стрессам. Реализация функций агрессивного инвазионного генотипа закрепляется в ходе микроэволюции и сопровождается сложными физиологическими процессами, происходящими в семенах (Виноградова и др., 2022).

Плоды A. negundo и A. tataricum – крылатки, состоящие из двух крылышек с одним семенем в каждом, созревают в августе – октябре, но осыпаются только в начале вегетации, т. е. остаются на дереве до весны. Семена у обоих видов клена без эндосперма.

Семена A. tataricum, хотя и адаптированы к сезонным климатическим изменениям, к моменту опадения плодов, еще не достигают физиологической зрелости. Они обладают выраженным состоянием покоя и нуждаются в длительной стратификация (до 200 дней). Всхожесть семян сохраняется в течение 2–3 лет (Воронина и др., 2021).

Семена A. negundo уже в начале августа содержат максимальное количество запасных питательных веществ и готовы к прорастанию (Бугрова, 2014). По данным исследований М.И. Седаевой и А.И. Лобанова (Седаева, Лобанов, 2018) потенциальная жизнеспособность семян A. negundo достигает до 96%; у A. tataricum – 91%.

В отечественной литературе сведений о биохимических особенностях A. negundo и A. tataricum очень мало. Обсуждаются различные гипотезы, объясняющие способность видов к быстрой адаптации и последующей натурализации в новых местах обитания (Виноградова и др., 2010). Сравнительное изучение физиологических процессов в отдельных органах натурализующихся инвазионных и аборигенных видов одного таксона позволяет глубже понять адаптационные особенности их метаболизма (Kupchan et al., 1971; Inoue et al., 1992; Zhao, Cheng 1998; Veselkin et al., 2019). В многоступенчатом адаптационном механизме у растений значительную роль играют фенолкарбоновые кислоты (ФКК), присутствующие в тканях в виде сложных эфиров, а также моносахариды и полисахариды (Dixon, Paiva, 1995; Zhao, Zou, 2002; Boudet, 2007; Pourcel et al., 2007). Процессы метаболизма в семенах инвазионных и аборигенных видов в связи с их конкурентоспособностью исследованы недостаточно. Анализ специфики накопления фенольных соединений и углеводов в зародышах семян этих видов остается актуальным.

Цель данного исследования – сравнить динамику содержания вторичных метаболитов и запасных углеводов в семенах аборигенного вида A. tataricum и инвазионного A. negundo в период холодного хранения и оценить их конкурентоспособность в биоценозах. Задача изучения – проанализировать изменения содержания фенолкарбоновых кислот, суммы флавоноидов и различных форм углеводов (моносахаридов, полисахаридов и крахмала) в тканях зародышей семян двух видов кленов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Семена аборигенного A. tataricum и инвазионного вида A. negundo собраны на территории памятника природы “Участок русла реки Суры” (53.725283° с.ш.; 45.495777° в.д.) в окрестностях пос. Луговой Лунинского района Пензенской области в сентябре 2022 г. Для сбора образцов выбирали по 5 деревьев, растущих рядом в одном биотопе прирусловой поймы. Из среднего яруса каждого дерева собирали зрелые семена и помещали в холодильную камеру при температуре +5°С и влажности 80%. Ежемесячно с октября по март для биохимического исследования выделяли зародыши из 30–40 семян обоих видов. Анализы выполняли на свежем материале. Перед каждым анализом визуально оценивали качество семян (%) обоих видов, отбраковывая семена с повреждениями и пораженные болезнями.

Анализ фенолкарбоновых кислот (ФКК). Анализ проводили методом ВЭЖХ, модифицированным в лаборатории физиологии и биохимии растений ГБС РАН. Навеску зародышей семян массой 0.1 г заливали 80% этанолом и помещали на магнитную мешалку на 1 ч в холодильник (при температуре 3–5°С). Процедуру повторяли три раза. Объединенный экстракт фильтровали и упаривали досуха на роторном испарителе при температуре 40°С. Сухой остаток растворяли в 1 мл 96% этанола. Экстракт очищали методом тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках в восходящем токе растворителя БУВ: н-бутанол, уксусная кислота и вода (в соотношении 6:1:2). Внешним стандартом были синтезированные аналоги хлорогеновой (ХК), кофейной (КК), феруловой (ФК) кислот (фирма Serva, Германия). Пятно с ФКК счищали с пластинок, элюировали в 2 мл 96% этанола при температуре +5°C, элюат сливали и упаривали досуха. Идентификацию и количественное определение ФКК проводили на изократической системе “Стайер” (Россия) методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой RP-18, жидкая фаза: ацетонитрил, вода и уксусная кислота (в соотношении 50:50:1). Идентификацию ФКК проводили при длине волны 254 нм. Все образцы брали в 5-кратной аналитической повторности.

Анализа суммы флавоноидов. Для анализа использовали реактив Фолина-Чокальтеу (Денисенко и др., 2015). Навеску зародышей семян массой 1 г гомогенизировали с добавлением 70% этанола, центрифугировали при 2000 г и надосадочную жидкость доводили водой до объема 25 мл. Из полученного раствора отбирали аликвоты для определения фенольных соединений. В колбе на 25 мл смешивали исследуемый раствор, 0.3 мл реактива, 3 мл 20% Na₂CO₃ и доводили объем до метки. Светопоглощение растворов измеряли через 20 мин при длине волны 720 нм. Сумму флавоноидов определяли по градировочному графику, построенному ранее, используя спектрофотометр Spekol 300. Для приготовления раствора сравнения в колбе на 25 мл смешивали 3 мл 20% раствора Na₂CO₃ и 0.3 мл реактива Фолина, затем доводили до метки 70% этанолом. Результаты приведены в пересчете на кверцетин.

Анализ состава запасных углеводов. Анализ проводили колориметрическим методом (Минеев, 2001). Навеску семян массой 1 г гомогенизировали с добавлением дистиллированной воды, затем центрифугировали при 2000 г и надосадочную жидкость доводили водой до объема 25 мл, отбирали аликвоты в 3-х повторностях для определения моносахаридов. Для определения полисахаридов и крахмала применяли кислотный гидролиз. Далее в пробирке смешивали аликвоту исследуемого раствора с 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и 3 мл 20% раствора Na₂CO₃, помещали в кипящую водяную баню на 30 мин, затем переносили в колбу на 25 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Моносахариды, полисахариды и крахмал количественно определяли по градуировочному графику, построенному ранее, на спектрофотометре Spekol 300 (Минеев, 2001). Для приготовления раствора сравнения в колбе на 25 мл смешивали 3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты, 3 мл 20% раствора Na₂CO₃ и доводили до метки дистиллированной водой. Результаты приведены в пересчете на глюкозу.

Статистический анализ. Определение среднего значения показателей (М) и стандартного отклонения (±SEM) выполняли в Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Во время созревания семян происходит превращение различных органических веществ, при этом основными формами запасных веществ являются крахмал, жиры и белки. По преобладающей форме запасных веществ семена разделяют на крахмалистые и маслянистые. Семена A. negundo можно отнести к маслянистым т. к. по литературным данным уже в начале осени более половины массы семян A. negundo составляют запасные питательные вещества, в том числе углеводы 6.8%, жиры – 29.5%, белки – 7.5% (Бугрова, 2014). В нашем исследовании сумма запасных сахаров в семенах A. negundo составляла в среднем 15% от массы зародыша и практически не менялась с октября по март. При этом преобладали моно- и полисахариды. Значимое количество крахмала отмечено только в октябре и ноябре.

Данных о составе запасных веществ в семенах A. tataricum в литературе не обнаружено. В нашем исследовании в семенах A. tataricum сумма углеводов составила до 40% от массы зародыша, представленных, в основном, моносахаридами. Содержание крахмала было менее 25% от суммы запасных сахаров. Оно оставалось относительно стабильным в течение всего периода наблюдений и снизилось к марту (рис. 1). Очевидно, A. tataricum по составу запасных веществ семян близок к клену серебристому (Acer saccharinum L., секция Rubra), происходящему из Северной Америки. Семена A. saccharinum содержат до 62% углеводов (Бугрова, 2014), так же, как и у A. tataricum опадают весной, а для их проращивания требуется длительная холодная стратификация.

 

Рис. 1. Динамика содержания запасных сахаров в семенах Acer tataricum и Acer negundo в период холодного хранения: 1 – моносахара, 2 – полисахариды, 3 – крахмал, мг/г воздушно-сухой массы.

 

Фенолкарбоновые кислоты, активно участвующие в ростовых и протекторных механизмах, часто находятся в растениях в виде сложных эфиров. Так, наиболее распространенная ХК является сложным эфиром КК и хинной кислоты. Она формирует устойчивость растений к поражению фитопатогенными грибами, является регулятором ростовых процессов (Дейнека и др., 2008). Однако собственно ХК обладает слабой активностью, наиболее активна КК, являющаяся ее производным. В связи с этим более корректно оценивать воздействие ФКК на устойчивость растений к биогенным и абиогенным стрессам по соотношению КК/ХК (Meng et al., 2013). В наших исследованиях выявлена отрицательная корреляция между соотношением КК/ХК и степенью поражения патогеном (Каштанова и др., 2021). Защитные функции оксикоричных кислот отмечены в экспериментах с листьями Urtica dioica L., клеточные стенки которых утолщаются и препятствуют проникновению токсичных веществ (Бобина и др., 2021). В растениях часто присутствует феруловая кислота, которая входит в состав лигнина, участвует в метаболизме свободных радикалов, блокирующих активные формы кислорода, в тканях растений. ФК, как правило, представлена в виде гликозида (Blum, Rebbeek, 1989; Dixon, Paiva, 1995).

В тканях зародыша обоих видов клена в течение всего периода наблюдений идентифицировали ХК и ФК, а у A. negundo – еще и КК (табл. 1).

 

Таблица 1. Содержание ФКК в тканях зародышей семян Acer tataricum и A. negundo, мкг/г

Дата	Acer tataricum
	ХК	КК	ФК	КК/ХК
Октябрь	1.58 ± 0.18	0.82 ± 0.05	нет	0.52
Ноябрь	40.24 ± 2.27	нет	3.83 ± 0.33	нет
Декабрь	252.84 ± 5.89	нет	6.62 ± 0.55	нет
Январь	182.75 ± 5.89	нет	4.25 ± 0.32	нет
Февраль	44.40 ± 1.05	нет	2.27 ± 0.64	нет
Март	0.49 ± 0.05	нет	0.07 ± 0.02	нет
	Acer negundo
	ХК	КК	ФК	КК/ХК
Октябрь	1.61 ± 0.16	0.94 ± 0.08	нет	0.58
Ноябрь	1.41 ± 0.11	0.96 ± 0.05	нет	0.68
Декабрь	2.69 ± 0.25	0.77 ± 0.07	0.11 ± 0.02	0.3
Январь	2.54 ± 0.24	0.99 ± 0.01	0.21 ± 0.03	0.4
Февраль	1.23 ± 0.17	0.57 ± 0.02	0.03 ± 0.01	0.48
Март	1.71 ± 0.24	0.44 ± 0.03	0.12 ± 0.02	0.26

 

Динамика этих фенольных соединений с октября по март существенно не отличалась у аборигенного и инвазионного видов. В октябре уровень ХК почти одинаков у обоих видов. В этот период и у A. negundo и у A. tataricum идентифицирована КК, а ФК не найдена в тканях зародышей обоих видов клена.

В декабре-январе у аборигенного вида с длительным периодом покоя уровень ХК возрастает в сотни раз по сравнению с исходным, достигая максимума, а затем снижается в марте, при этом КК не обнаружена.

У A. negundo, не имеющего периода покоя, содержание ХК также растет в декабре-январе, а в остальные месяцы существенно не меняется, при этом отмечается высокий уровень КК, снижающийся к марту. Максимальное соотношение КК/ХК отмечено в ноябре и феврале, т. е. при вхождении в период отрицательных температур и при подготовке к весенней вегетации в естественных условиях. Уровень ФК на порядок выше у A. tataricum, максимум содержания ее в тканях клеток зародыша, как и ХК, в декабре-январе. Вероятно, в семенах A. negundo, не имеющих периода покоя идут активные метаболические процессы по подготовке к быстрому прорастанию при возникновении подходящих условий и ФКК использовались для включения ростовых процессов и запуска протекторных антистрессовых механизмов.

В наших лабораторных опытах семена A. negundo прорастали и в январе, и в феврале, и в марте, образуя жизнеспособные проростки, тогда как у A. tataricum семена не прорастали в марте, после 5 месяцев стратификации (Кондратьева и др., 2023). Выявлено, что количество полноценных семян с неповрежденным зародышем у A. negundo выше, чем у семян A. tataricum в период хранения при температуре +5°C (табл. 2).

 

Таблица 2. Визуальная оценка качества зародыша в семенах A. negundo и A. tataricum при холодном хранении, %

Месяц	A. negundo	A. tataricum
Октябрь	100	100
Ноябрь	100	95
Декабрь	96	75.5
Январь	90	78.2
Февраль	92	60.5
Март	94	70.4

 

Несмотря на то, что общее содержание ХК за изученный период в зародышах семян A. tataricum превосходило более чем в 100 раз уровень ХК у A. negundo, активный метаболит, КК, отсутствовал. Вероятно, без специфических внешних условий (стратификация) запуск ростовых и протекторных механизмов у A. tataricum происходит медленней, чем у A. negundo, семена долго не прорастают и проростки теряют преимущество при конкурентной борьбе за выживание и распространение в биоценозе.

С формированием протекторных антистрессовых механизмов связаны наиболее часто встречающиеся в растениях фенольные соединения ‒ флавоноиды (Pourcel et al., 2007). Среди этих многофункциональных соединений выделяют семь групп, различающихся по химическому строению и свойствам, участвующих в окислительно-восстановительном метаболизме (Волынец, 2013; Загоскина, 2018). Флавоноиды, по-видимому, играют значительную роль в процессе дозревания семян. Высокая антиоксидантная активность обнаружена как в водных, так и в спиртовых экстрактах из молодых листьев, женских и мужских цветков A. negundo (Виноградова и др., 2022). В цветках A. negundo содержатся флавоноиды, обладающие антиоксидантной активностью, а в зрелых плодах их уровень в 3 раза ниже, чем в зеленых (Куклина, Цыбулько, 2020). Значительные отличия выявлены нами между семенами A. negundo и A. tataricum по содержанию флавоноидов. В семенах A. negundo уровень флавоноидов стабильный и невысокий по сравнению с A. tataricum с октября по март (табл. 3). В семенах A. tataricum наибольшее количество флавоноидов отмечено в октябре. В ноябре их содержание резко снизилось в это же время значительно возросло количество моносахаридов. В тот же период, в ноябре зафиксировано поражение семян A. tataricum кленовым долгоносиком-семяедом ~ до 30%. Поскольку флавоноиды часто находятся в растительных тканях в форме гликозидов, возможно, при расходовании активной части молекулы на метаболические процессы высвобождаются моносахара, пополняющие фонд запасных углеводов. В дальнейшем с ноября по март сумма флавоноидов в семенах A. tataricum оставалась стабильной (табл. 3).

 

Таблица 3. Динамика содержания суммы флавоноидов в семенах A. tataricum и A. negundo в период холодного хранения, мг/г воздушно-сухой массы

Дата	A. tataricum	A. negundo
Октябрь	163.5 ± 11.2	2.11± 0.08
Ноябрь	22.2 ± 1.3	2.33 ± 0.09
Декабрь	22.4 ± 0.5	2.72 ± 0.09
Январь	23.7 ± 0.7	2.61 ± 0.09
Февраль	23.5 ± 0.6	2.62 ± 0.12
Март	22.3 ± 1.2	3.92 ± 0.19

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашего исследования показали, что семена аборигенного вида A. tataricum, имеющего продолжительный период покоя и нуждающиеся в длительной стратификации, отличаются высоким уровнем ФКК, флавоноидов и запасных углеводов (преимущественно моносахаридов). Но в них не идентифицирована КК – наиболее активный метаболит, в сравнении с ХК.

Установлено, что инвазионный A. negundo по сравнению с аборигенным A. tataricum отличается рядом преимуществ, способствующих лучшим конкурентным возможностям. Его семена, не требуют стратификации, до весеннего периода они сохраняют хорошую доброкачественность и высокую жизнеспособность. В осенне-зимний период в семенах A. negundo отмечен низкий уровень ХК и ФК, флавоноидов и запасных углеводов, но высокий уровень КК.

Возможно, в семенах A. negundo, не имеющих периода покоя, ростовые и протекторные механизмы активны в течение всего осенне-зимнего периода благодаря комплексу вторичных метаболитов и запасных веществ. При появлении благоприятных условий температуры и влажности семена A. negundo быстро прорастают, образуют дружные входы и занимают свободные участки в биоценозе, препятствуя росту и развитию аборигенных растений.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена по теме Государственного задания ГБС РАН № 075-00745-22-01 “Инвазионные растения России: инвентаризация, биоморфологические особенности и эффективные методы контроля расселения”, № госрегистрации 122042600141-3. Благодарим Министерство Науки и Высшего образования РФ за поддержку ЦКП “Гербарий ГБС РАН”, грант 075-15-2021-678.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны инженеру О.Л. Ениной за помощь в подготовке образцов к анализу и первичную обработку результатов исследования.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

作者简介

M. Semenova

Federal State Budgetary Institution of Science N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: lab-physiol@mail.ru
俄罗斯联邦, 4 Botanic Str., Moscow, 127276

V. Kondrat’eva

Federal State Budgetary Institution of Science N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the RAS

Email: lab-physiol@mail.ru
俄罗斯联邦, 4 Botanic Str., Moscow, 127276

A. Kuklina

Federal State Budgetary Institution of Science N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the RAS

Email: lab-physiol@mail.ru
俄罗斯联邦, 4 Botanic Str., Moscow, 127276

L. Olekhnovich

Federal State Budgetary Institution of Science N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the RAS

Email: lab-physiol@mail.ru
俄罗斯联邦, 4 Botanic Str., Moscow, 127276

T. Voronkova

Federal State Budgetary Institution of Science N.V. Tsitsin Main Botanical Garden of the RAS

Email: lab-physiol@mail.ru
俄罗斯联邦, 4 Botanic Str., Moscow, 127276

参考

补充文件