Изучение функций мембранных рецепторов прогестерона с использованием их селективных лигандов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Прогестерон – стероидный гормон, необходимый для осуществления репродуктивных функций в женском организме и для регуляции разнообразных процессов в клетках многих органов. Он оказывает свое действие через два типа рецепторов, а также может влиять на активность ряда сенсоров. Классические ядерные рецепторы прогестерона (nPR), являющиеся лиганд-зависимыми транскрипционными факторами, к настоящему времени хорошо изучены. Известны две основные формы этих рецепторов – А и В, являющиеся продуктами одного гена [1]. В 2003 г. был идентифицирован новый тип рецепторов прогестерона [2] – мембранные рецепторы прогестерона (mPRs) семейства адипонектиновых и прогестиновых рецепторов, в настоящее время выявлено 5 подтипов этих рецепторов. Эти рецепторы обнаружены в репродуктивных и нерепродуктивных органах, в опухолевых тканях, в иммунных клетках. Оказалось, что действие прогестерона и его аналогов через разные типы рецепторов не только сильно различается, но может быть и противоположным. Действуя через ядерные рецепторы, прогестерон вызывал релаксацию миометрия матки. Действуя через mPRs, этот гормон стимулировал фосфорилирование легких цепей миозина в первичной культуре миометрия, вызывая сократительную активность этой ткани [3]. Предполагается также, что через разные рецепторы прогестины (прогестерон и его синтетические производные) могут оказывать противоположное действие на пролиферацию и гибель клеток, в том числе опухолевых, на процессы канцерогенеза [4, 5]. Поскольку эти гормоны широко используются в медицинской практике для гормональной терапии и контрацепции [6], огромное значение имеет поиск селективных лигандов определенного типа рецепторов. Селективные агонисты и антагонисты nPR установлены. Лиганды для mPRs, сочетающие высокое сродство к ним и полное отсутствие взаимодействия с nPR, пока не выявлены. Антагонисты mPRs также не обнаружены. В то же время на основании уже выявленных функций mPRs можно предполагать, что такие соединения перспективны в качестве иммуномодуляторов, потенциальных лекарств в лечении онкологических заболеваний, ожирения и диабета, болезней сосудов. В обзоре впервые суммированы результаты изучения эффектов и механизмов действия существующих в настоящее время селективных лигандов mPRs, используемых зарубежными и российскими авторами, а также подведены итоги изучения модификаций молекулы прогестерона, на основе которых ожидается прогресс в области получения соединений, избирательно и эффективно действующих через mPRs.

Рецепторы прогестерона

Классическое действие стероидных гормонов осуществляется через взаимодействие с ядерными рецепторами, в результате которого происходит конформационная перестройка, димеризация и связывание этих рецепторов с гормон-чувствительными элементами ДНК и корегуляторами, что приводит к изменению транскрипции генов-мишеней данной группы гормонов. Ядерные рецепторы прогестерона имеют доменную структурно-функциональную организацию. Существует две транскрипционно активных изоформы PR-А и PR-В, различающиеся фрагментом в 164 аминокислотных остатка с N-конца молекулы. Полноразмерная изоформа В состоит из N-концевого домена с двумя активационными функциями AF1 и AF3, центрального ДНК-связывающего домена с цинковыми пальцами, шарнирной области и лиганд-связывающего домена с AF2 около C-конца. Укороченная изоформа А не имеет AF3 и регулирует транскрипцию спектра генов-мишеней, существенно отличающихся от мишеней изоформы В. При появлении лиганда ядерные рецепторы, находящиеся в цитоплазме, связываются с ним, транслоцируются в ядро и осуществляют прямой контроль экспрессии генов [1].

Мембранные рецепторы прогестерона относятся к рецепторам прогестинового и адипонектинового семейства adipoQ (PAQR), в которое входит пять подтипов mPRs у позвоночных животных – mPRα (PAQR7), mPRβ (PAQR8), mPRγ (PAQR5), mPRδ (PAQR6) и mPRε (PAQR9), а также три рецептора адипонектина – AdipoR1, AdipoR2, AdipoR3 (PAQRs 1, 2, 3) и два белка, ассоциированных с дифференцировкой моноцитов в макрофаги (MMDs, PAQRs 10, 11) [7, 8]. Белки mPRs состоят из 330–377 аминокислотных остатков, имеют множественные трансмембранные домены, являются посредниками в быстрой активации прогестероном неклассических внутриклеточных сигнальных путей, которые обычно не являются геномными, но могут в конечном итоге приводить к геномным ответам [7]. Эволюционно и структурно mPRs не связаны с рецепторами, сопряженными с G-белками (GPCRs), однако изменение уровня цАМФ, эксперименты с ингибиторами активации G-белков, коиммунопреципитацией и анализом лигирования (in situ proximity ligation assays) доказали, что mPRs через G-белки активируют вторичную сигнализацию и клеточные реакции [8]. Обработка прогестероном увеличивала связывание [³⁵S]GTPγS с плазматическими мембранами клеток, экспрессирующими mPRs, что также указывало на активацию G-белков. Обработка нерадиоактивным GTPγS, коклюшным и холерным токсинами приводила к диссоциации G-белков от рецепторов, в результате чего уменьшалось количество мест связывания рецепторов и лигандов. Перечисленные методы обработки уменьшали связывание [3H]-прогестерона с mPRs, что указывает на их тесную связь с G-белками [7]. Идентичность активированных G-белков была определена иммунопреципитацией радиоактивно меченного GTPγS со специфическими антителами к α-субъединицам G-белков ингибирующего (Gi) и стимулирующего (Gs) типов. Подтипы mPRα, mPRβ, mPRγ активируют, как правило, ингибиторные G-белки, а mPRδ и mPRε – стимуляторные G-белки. Одним из исключений является связь mPRα со стимуляторным G (Golf) белком в сперме двух видов костистых рыб. Адипонектиновые рецепторы AdipoR1, AdipoR2, AdipoR3 имеют семь трансмембранных доменов и обратную топологию N- и C- концов на мембране в сравнении с GPCRs. В отношении мембранных рецепторов прогестерона последние данные показывают, что mPRs имеют ту же внутриклеточную ориентацию N-концов, что и другие члены семейства PAQR (AdipoR1, AdipoR2, AdipoR3). А вот С-концы этих белков внутриклеточные, как у GPCRs, поскольку они имеют дополнительный восьмой трансмембранный домен. Схематические структуры всех пяти подвидов mPRs, как они представляются на данный момент, приведены в обзоре 2023 г. [8]. Однако нужны еще экспериментальные доказательства, полученные с помощью крио-ЭМ или рентгеновского анализа кристаллизованных белков mPR, для подтверждения их мембранной топологии. Для mPRα сайт-направленный мутагенез позволяет предполагать, что внутриклеточная C-концевая область этого рецептора участвует в связывании и активации G-белка [7]. Однако есть примеры, демонстрирующие, что не всегда действие прогестинов через mPRs опосредовано G-белками. При использовании репортерной системы анализа с рекомбинантной экспрессией mPRs в клетках дрожжей, не содержащих G-белков, было показано, что прогестины активируют сигнализацию mPRs. Это предполагает, что G-белки не требуются для передачи сигнала mPRs в дрожжевой модели [9]. Также в ряде клеток, таких как нейрональные клетки PC12 и клетки рака яичников, активация mPRs не приводила к изменению уровня цАМФ. Но в данном случае сигнал может передаваться βγ-субъединицами G-белков, их участие на этом основании исключить нельзя. Взаимодействие mPRs с прогестинами во многих клетках позвоночных активирует сигнальные пути фосфатидилинозитол-3-киназы (Pi3k)/серин-треонинкиназы (Akt) и митоген-активируемых протеинкиназ (MAPkinase) через сигнализацию βγ-субъединиц G-белков. Множественные сигнальные каскады опосредуют эффекты прогестерона через активацию G-белков, зависящую от mPRs, часто в одних и тех же клетках позвоночных, включая пути аденилатциклазы/цАМФ/PKA, Pi3k/Akt, MAPkinase/ERK1/2/фосфодиэстеразы (PDE) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Кроме того, были идентифицированы внутриклеточные медиаторы сигнализации mPRs – белки JNK, mTOR, NFκB, Snail и CREB [7].

Обычно mPRs обнаруживаются на плазматической мембране клетки, их также выявляют в эндоплазматическом ретикулуме, поскольку это – место синтеза, сворачивания и хранения мембранных белков. После действия лиганда представленность mPRs на клеточной мембране снижается, поскольку они подвергаются быстрой клатрин-зависимой интернализации (эндоцитозу), за которой следует постепенное восстановление их уровня на поверхности клетки. [7]. Процесс экспорта рецепторов на мембрану жестко регулируется взаимодействием с несколькими регуляторными белками с функциями шаперонов, акцессорных белков и белков, модифицирующих активность рецептора. Адаптерные белки, один из типов вспомогательных белков, обычно связываются с мембранными рецепторами через фосфотирозинсвязывающий домен и часто регулируют их сигнальные пути. В настоящий момент появились доказательства того, что APPL1, VLDL-рецептор и PGRMC1 действуют как адаптерные и шаперонные белки для mPRs, хотя подробности молекулярных механизмов их действия пока отсутствуют [10–12].

Мембранный компонент рецептора прогестерона 1 (PGRMC1) является членом особого подсемейства белков, содержащих домен цитохрома b5 (Cytb5), и называемого семейством мембранно-ассоциированных прогестероновых рецепторов (MAPR). PGRMC1 имеет много различных функций, включая действие в качестве адаптера и шаперона. Это связывающий гем белок, который участвует в широком спектре функций клеток и тканей, включая активность цитохромов P450, гомеостаз гема, канцерогенез, женскую репродукцию и контроль качества белка [13]. Он взаимодействует с многочисленными белками: Р-450, Scap, Insig, EGFR, PAIRBP1, рецептором инсулина, что приводит к их перемещению или стабилизации; участвует в регуляции синтеза и транспорта гема, в транспорте холестерина и синтезе из него прегненолона и прогестерона, выполняет важную роль в регуляции энергетического метаболизма [14]. Методами коиммунопреципитации и анализа лигирования для выявления белок-белковых взаимодействий получены доказательства, что PGRMC1 также действует как адаптер или шаперонный белок для mPRα. Это показано на клетках рака молочной железы MDA-MB-231, на человеческих гранулезных/лютеиновых клетках, в ооцитах данио-рерио [12, 15–17]. Результаты ряда работ показывают, что PGRMC1 образует рецепторный комплекс с mPRα, который необходим для локализации mPRα на клеточной мембране и mPRα-зависимой сигнализации в различных моделях клеток позвоночных. Однако молекулярные механизмы, регулирующие взаимодействия между mPRα и PGRMC1, остаются неясными.

Есть данные о взаимовлиянии разных типов рецепторов прогестерона. Так, активация mPRs усиливает действие PR-B в поддержании миометрия в состоянии покоя на ранних сроках беременности, а в конце беременности способствует функциональной отмене действия прогестерона, позволяя миометрию сокращаться [18].

Изучение эффектов селективного лиганда mPRα

10-этенил-19-норпрогестерона (Org OD 02-0)

До 2017 г. из мировой научной литературы были известны два соединения, считающиеся селективными лигандами mPRα. Они были выявлены в 2010 г. в единственной работе, посвященной поиску избирательно взаимодействующих с mPRα стероидов [19]. В этой работе использовался эмпирический подход идентификации таких соединений, заключающийся в зондировании лиганд-связывающего кармана mPRα путем конкурентного связывания различных по структуре синтезированных стероидов с дополнительными заместителями в разных положениях углеродного скелета молекулы. Большинство использованных стероидов имело очень низкое сродство к mPRα. 10-этенил-19-норпрогестерон (Org OD 02-0) и 19а-метилпрогестерон (Org OD 13-0) имели высокое или сходное с прогестероном сродство к mPRα, но оба стероида связывались с nPR в цитозольной фракции MCF-7 линии клеток молочной железы человека с относительной конкурентной активностью (ОКА) 12.9% и 2.3% от активности прогестерона соответственно. Org OD 13-0 практически не использовался в дальнейших работах, его эффекты неизвестны. Org OD 02-0, наоборот, очень активно применяется в научных исследованиях для выявления участия mPRs в действии прогестинов (табл. 1). Сродство этого стероида к nPR может быть достаточным для активации ядерных рецепторов, поэтому в работе, где это соединение исследовалось, была сделана проверка, как оно действует на транскрипционную активность ядерного рецептора В, экспрессированного в MCF- 7 наряду с репортерной системой анализа активности nPR. В качестве репортерной системы использовалась векторная конструкция с геном люциферазы под MMTV – промотором, являющимся гормончувствительным элементом (ГЧЭ) для nPR. Было показано, что в данной системе Org OD 02-0 не являлся агонистом PR-В, поскольку не стимулировал его транскрипционную активность [19]. Отсюда был сделан вывод, что это соединение можно считать селективным лигандом mPRα. Однако изучение агонистической активности с одним вариантом ГЧЭ и в одном типе клеток не является гарантией, что такая активность не выявится на других объектах. Известно многообразие действия стероидных гормонов при разных концентрациях в клетках с различным фенотипом. К тому же в этих экспериментах проверялась активность одной изоформы nPR-В, транскрипционная активность nPR-А не изучалась в присутствии Org OD 02-0. Изоформа nPR-B является более мощным активатором транскрипции, однако другая изоформа также обладает собственной транскрипционной активностью. В клетках опухоли молочной железы T47D-YA с изоформой nPR-А и T47D-YB с изоформой nPR-B было показано, что только 25 генов, регулируемых прогестероном, были общими для обеих изоформ рецептора, 229 регулировались только nPR-B, а 83 – только nPR-A [20]. Проверялась и антагонистическая активность Org OD 02-0 в вышеупомянутой системе. Показано, что она хоть и недостоверно, но снижает транскрипционную активность nPR-В, индуцированную прогестероном [19]. Поэтому главным недостатком этого соединения является его довольно высокая относительная конкурентная активность (12.9%) по отношению к прогестерону за связывание с nPR. Org OD 02-0 используется в работах в качестве селективного лиганда mPRα, но есть вероятность, что это соединение влияет на транскрипционную активность ядерных рецепторов. И такие факты уже появились в литературе, о чем будет сказано ниже.

Таблица 1. Строение стероидов

Структура соединения	Название	nPR RBA, %	mPRα RBA, %	Индекс дискриминации mPRα / nPR
	прогестерон	100	100	1.0
	10-этенил-19-норпрогестерон Org OD 02-0	12.9	257.7	20
	19-гидроксипрегн-4-ен-20-он LS-01	0.2	10.3	52
	19-гидрокси-5β-прегн-3-ен-20-он LS-02	0.3	23.9	80

Примечание. RBA – относительное сродство связывания стероидных лигандов к nPR и mPRs; индекс дискриминации – предпочтительность mPRα / nPR по сравнению с прогестероном.

Изучение связывающей активности Org OD 02-0 было проведено сначала только с mPRα и nPR человека. Но в дальнейшем было показано, что этот стероид связывается с mPRδ и mPRε [21], а также с mPR других видов животных, оказывает эффекты в тканях, где уровень mPRα низок, а содержание mPRβ, наоборот, очень высоко [22]. Поэтому делается предположение, что Org OD 02-0 является лигандом mPRs разных подтипов мембранных рецепторов. Однако в литературе чаще всего традиционно это соединение упоминается как селективный лиганд mPRα.

Стероид Org OD 02-0 использовался для доказательства участия mPRα в многообразных процессах в целом ряде работ. В линии BeWo плацентарных клеток, происходящей из хориокарциномы человека, изучался механизм преждевременных родов, связанный с повышенным уровнем воспалительных цитокинов. Использование специфического агониста Org OD 02-0 позволило получить доказательства того, что активация mPRα ингибирует эффекты цитокина IL-1β, предиктора преждевременных родов. Изменялась экспрессия генов mPRs и других рецепторов прогестерона в плацентах человека с недоношенными плодами в сравнении с нормой, указывая на важность соотношения различных типов рецепторов в этих процессах [23].

Изучалась стимуляция подвижности сперматозоидов прогестинами у костистых рыб – атлантических горбылей (Micropogonias undulatus) и южной камбалы (Paralichthys lethostigma). Гиперподвижность инициировалась посредством mPRα и включала активацию пути Pi3k/Akt и повышение уровня активности фосфодиэстеразы. Специфический агонист mPRα 10-этенил-19-норпрогестерон (Org OD 02-0) имитировал стимулирующее действие эндогенного прогестина этих видов, 17,20-β, 21-тригидрокси-4-прегнен-3-она (20β-S) влиял на подвижность сперматозоидов [24]. Также в опосредованной mPRα стимуляции прогестинами 20β- S и Org OD 02-0 гиперподвижности сперматозоидов активировался через путь рецептора эпидермального фактора роста (EGFR и ErbB2) и МАРК (MEK1/2, Erk1/2) [25]. Обработка сперматозоидов 20β-S или Org OD 02-0 приводила к повышению уровня цАМФ через mPRα, сопряженных в этих клетках со стимулирующими G-белками (Golf), активирующими мембранную аденилатциклазу [26]. Таким образом, повышение фертильности у костистых рыб, связанное с быстрой индукцией прогестином 20β-S гиперподвижности сперматозоидов, опосредуют три сигнальных каскада – мембранной аденилатциклазы/цАМФ, рецептора эпидермального фактора роста EGFR/ Erk и Pi3k/Akt/фосфодиэстеразы, приводящие к повышению содержания кальция в течение 10 с. С использованием специфического агониста mPRα, Org OD 02-0, были получены доказательства того, что действие прогестина опосредуется mPRα в сочетании со стимулирующим G-белком (Golf) [27].

В данном случае nPR как транскрипционные факторы не могут принимать участие в процессе активации сперматозоидов из-за отсутствия в них рибосом, плотной упаковки ДНК и быстрого развития процесса. Поэтому Org OD 02-0 в этих клетках может действовать только через взаимодействие с mPRs.

Прогестерон оказывает благотворное влияние на сердечно-сосудистую систему человека, вызывая быстрое увеличение продукции оксида азота (NO) в эндотелиальных клетках сосудов. Прогестерон и Org OD 02-0 связывались с мембранной фракцией эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) с характеристиками, присущими mPRs, тогда как агонисты nPR промегестон (R5020) и медроксипрогестерон ацетат продемонстрировали низкую аффинность связывания. Иммуноцитохимический и вестерн-блот-анализ подтвердили, что mPRs экспрессируются на плазматических мембранах в HUVEC. Под действием прогестерона и Org OD 02-0 повышались уровень NO, активность эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) и фосфорилирование eNOS. Агонист nPR R5020 не оказывал такого эффекта. Нокдаун экспрессии mPR, но не nPR, блокировал эти процессы. Использование ингибиторов показало участие киназных путей PI3K/Akt и ERK в действии прогестерона на продукцию NO и фосфорилирование eNOS [28]. Показано расслабляющее действие прогестерона непосредственно на гладкомышечные клетки сосудов посредством активации mPRα. Прогестерон и селективный агонист mPR Org OD-02-0, но не агонист nPR R5020, вызывали быстрое снижение концентраций Ca²⁺ в цитозоле и индукцию мышечной релаксации. Это действие прогестерона включало поглощение Ca²⁺ сарко/эндоплазматическим ретикулумом (SR) и увеличение активности Ca²⁺-АТФазы сарко/эндоплазматического ретикулума (SERCA). Обработка культивируемых гладкомышечных клеток пупочной артерии человека прогестероном и Org OD 02-0, но не с R5020, увеличивала фосфорилирование фосфоламбана, что приводило к растормаживанию SERCA. Быстрый эффект прогестерона и Org OD-02-0 на внутриклеточный уровень Ca²⁺ и релаксацию гладкомышечных клеток сосудов посредством активации mPRα осуществлялся через регуляцию функций SERCA2 и фосфоламбана сигнальными путями, включающими Gi, MAP-киназы и Akt/Pi3k и подавление активности RhoA, фосфорилирование ROCK, то есть ингибирование передачи сигналов RhoA/ROCK [29, 30].

В этих работах очень убедительно доказано с применением селективных агонистов и нокдауна гена с помощью siRNA, что прогестерон стимулирует выработку NO в эндотелии HUVECs и оказывает расслабляющее действие на гладкомышечные клетки сосудов посредством взаимодействия именно с mPRα, сопряженного здесь с ингибиторными G-белками, активируя передачу сигналов через каскады Pi3k/Akt и MAPК.

Прогестерон подавляет активацию Т-клеток человека во время беременности. Приток Ca²⁺ является важным сигналом для пролиферации Т-клеток после активации их фитогемагглютинином (ФГА). Было показано, что прогестерон воздействовал на клеточную мембрану Т-клеток, вызывая быстрые реакции, включая повышение внутриклеточной концентрации свободного кальция Ca²⁺. При этом он подавлял пролиферацию Т-клеток, активируемую ФГA. Интересно, что и ФГA, и прогестерон индуцируют повышение Ca²⁺, но прогестерон и агонист nPR R5020 дозозависимо подавляли индуцированный ФГА приток Ca²⁺, это приводило к иммуносупрессии Т-клеток, ингибированию их пролиферации, активируемому ФГА. Аналогичный дозозависимый эффект подавления клеточного притока Ca²⁺ и пролиферации происходили при использовании ингибитора канала TRPC и селективного канала TRPC3. Аналог прогестерона Org OD 02-0 также вызывал дозозависимое подавление притока Ca²⁺, но не влиял на пролиферацию. Делается предположение, что прогестерон и R5020 способны быстро снижать стимулированный ФГА устойчивый приток Ca²⁺, вероятно, за счет блокады каналов TRPC3, что подавляет пролиферацию Т-клеток [31]. Посредником в действии прогестерона и его аналогов (R5020/Org OD 02-0) на подавление притока Ca²⁺ в покоящиеся Т-клетки является cPKCβII, которая активируется негеномным мембранным путем и вызывает иммуносупрессию [32]. Данные, полученные в этом исследовании, трудно интерпретировать, особенно если учитывать, что в Т-клетках человека никто не выявил nPR, но только mPRs [33, 34]. Авторы работы предполагают, что какую-то роль в действии прогестерона и R5020 играет мембранный компонент рецептора прогестерона PGRMC1. Но функции этого белка столь обширны, а связывать он может самые разные соединения, в том числе стероидные, поэтому механизмы выявленных эффектов в Т-клетках требуют дальнейшего изучения.

Прогестины участвуют в модуляции физиологических процессов в шванновских клетках, основных нейроглиальных клетках периферической нервной системы. Исследовалось возможное участие mPRs в нейропротекторных эффектах прогестинов в иммортализованных шванновских клетках S42. Все пять подтипов mPRs и PGRMC1 были обнаружены в этих клетках на клеточной мембране. Прогестерон и mPR-специфичный агонист Org-OD-02-0 связывались с этими мембранами, что указывает на функциональность обнаруженных mPRs. Org-OD-02-0 быстро увеличивал миграцию клеток в экспериментах in vitro, указывая на возможную роль mPRs в процессе регенерации нервов. Действие Org-OD-02-0 было опосредовано активацией ингибирующего G-белка и снижением внутриклеточного уровня цАМФ. Долгосрочная активация mPRs приводила к увеличению уровня экспрессии миелин-ассоциированного гликопротеина (MAG). В совокупности эти результаты показали, что mPRs присутствуют и активны в шванновских клетках, модулируя их физиологические процессы [35]. В первичной культуре шванновских клеток крысы был обнаружен другой паттерн экспрессии mPRs. Подтипы mPRα (PAQR7) и β (PAQR8) были основными идентифицированными вариантами mPRs, причем различной субклеточной локализации. Активация ядерного рецептора прогестерона его специфическим агонистом R5020 стимулировала экспрессию mPRs, а активация mPRs специфическим агонистом Org OD 02-0 изменяла их субклеточную локализацию, приводила к активации Аkt, но не ERK1/2, а также к снижению экспрессии миелин-ассоциированного гликопротеина (MAG), морфологическим изменениям, изменениям экспрессии нескольких маркеров дифференцировки шванновских клеток и увеличению миграции и пролиферации этих клеток [36]. Таким образом, в первичной культуре шванновских клеток крысы и в иммортализованных шванновских клетках S42 наблюдалось противоположное действие Org OD 02-0 на экспрессию миелин-ассоциированного гликопротеина – MAG, авторы объясняют это разным уровнем экспрессии mPRδ и разными сроками действия в клетках. Высказано предположение, что долгосрочный эффект вызывает падение экспрессии MAG, в то время как краткосрочный эффект приводит к ее увеличению, вызванному главным образом снижением уровня цАМФ [36]. Теми же авторами исследовалась роль mPRs в стволовых клетках (ASC) жировой ткани человека, дифференцированных в клетки, подобные шванновским клеткам (SCL-ASC). В исследовании показано, что mPRs присутствовали как в недифференцированных, так и в дифференцированных ASC. Активация mPRα способствовала миграции и дифференцировке клеток SCL-ASC, увеличению экспрессии и секреции BDNF, нейротрофина с прорегенеративной активностью. Анализ показал участие сигнальных путей Src и Pi3k-Akt при активации mPRα в SCL-ASC клетках. Эти результаты позволили предположить, что mPRα может играть положительную роль в регенерации периферических нервов [37, 38]. Действительно, активация mPRα с помощью Org OD 02-0 в клетках SCL-ASC повлияла на регенеративные параметры в двух линиях нейрональных клеток – IMR-32 и SH-SY-5Y, усиливая рост нейритов, защищая от гибели и увеличивая экспрессию маркеров регенерации периферических нервов (CREB3, ATF3, GAP43). Инкубационная клеточная среда от необработанных Org OD 02-0 клеток SCL-ASC действовала значительно слабее. Добавление Org OD 02-0 к такой инкубационной среде влияло на гибель нейрональных клеток, но не на рост нейритов. Следовательно, влияние Org OD 02-0 на рост нейритов зависит от клеток SCL-ASC, из которых высвобождается BDNF и IGF-2. А его влияние на выживаемость нейрональных клеток обусловлено прямой активацией mPR на самих нейрональных клетках. Трансфекция SCL-ASC с помощью siRNA mPRα показала, что именно этот рецептор отвечает за благотворное влияние на рост нейритов. Этот же факт подтвердился в экспериментах с совместным культивированием SCL-ASC и SH-SY-5Y клеток [39]. В исследовании 2023 г. тех же авторов изучалась предполагаемая нейропротекторная роль mPRα на нейрональных клетках SH-SY-5Y с использованием двух известных фармакологических клеточных моделей болезни Паркинсона. Применение химических веществ, обычно используемых на клеточных культурах для имитации повреждения при этом заболевании, 6-гидроксидофамина (6-OHDA) и активного MPTP метаболита 1-метил-4-фенилпиридиния (MPP+), вызывало гибель клеток. Прогестерон и специфический агонист mPR Org OD 02-0 были эффективны в снижении гибели клеток SH-SY5Y, вызванной 6-OHDA и MPP+, тогда как агонист nPR промегестон (R5020) и агонист рецептора GABA_A мусцимол оказались неэффективными. Эксперименты, проведенные с нокдауном генов и селективными фармакологическими агонистами, показали, что mPRα является рецептором, ответственным за наблюдаемые нейропротекторные эффекты, запуская сигнальные пути Pi3k-Akt и ERK в клетках SH-SY5Y. Авторы предполагают, что mPRα может играть нейропротекторную роль при патологии болезни Паркинсона [40]. Во всяком случае in vitro его участие убедительно доказано.

Функции прогестерона в миометрии хорошо известны, но негеномные эффекты при сокращениях миометрия беременных изучены слабо. Поэтому было проведено исследование негеномных эффектов прогестерона во время беременности с использованием полосок миометрия, полученных от небеременных, беременных крыс и крыс после родов. Прогестерон не вызывал ритмических сокращений в миометрии небеременных, но индуцировал ритмичные сокращения миометрия беременных с пиком эффекта на 21-й день беременности. Однако сокращения миометрия уменьшались после родов и снижались до уровня небеременных через 7 дней после родов. Кроме того, прогестерон стабильно ингибировал сильные сокращения миометрия, вызванные KCl, во время беременности. Актиномицин D и циклогексимид не влияли на сократительные эффекты прогестерона, а Org OD 02-0 эффективно их имитировал. Было выявлено значительное увеличение экспрессии гена mPRβ во время беременности, а уровни экспрессии mPRα, mPRγ, mPRδ и mPRε оставались неизменными. Авторы работы сделали вывод, что стимулирующий негеномный эффект прогестерона во время беременности на сократительную активность миометрия был индуцибельным, зависел от mPRβ и мог участвовать в процессе родов. Ингибиторный эффект прогестерона был конститутивным, зависел от других mPRs и мог участвовать в поддержании беременности [41]. Прямых доказательств действия Org OD 02-0 на сократительную активность миометрия беременных через mPRβ в данной работе не приводится.

Изучение роли mPR с использованием Org OD 02-0 проводилось в опухолевых тканях. В двух клеточных линиях рака молочной железы SKBR3 и MDA-MB-468, в клетках которых не выявляются nPR, но обнаружены подтипы mPRα, mPRβ и mPRγ, исследовали эффекты прогестерона и Org OD 02-0 в сравнении с действием тестостерона, 17β-эстрадиола, дексаметазона и агониста и антагониста nPR (R5020 и RU486). Только прогестерон и Org OD 02-0 в этих клеточных линиях значительно уменьшали гибель клеток и апоптоз в ответ на исключение из среды инкубации сыворотки. При этом происходила быстрая активация ингибирующего G-белка, а также активация киназы p42/44 MAP (ERK 1/2). Повышалась активность Akt под действием прогестерона в этих клетках, а снижения активности каспазы 3 не наблюдалось. Таким образом, показано, что прогестерон может действовать через mPR, ингибируя апоптоз в клетках рака молочной железы [42]. Поскольку в изучаемых клетках нет nPR, действие Org OD 02-0 через мембранные рецепторы в данном случае не вызывает сомнения.

Прогестерон способствует прогрессированию глиобластомы, наиболее частой и агрессивной опухоли головного мозга из-за ее высокой способности к миграции и проникновению в нормальную ткань мозга. Прогестерон стимулирует пролиферацию, миграцию и клеточную инвазию за счет активации nPR. Однако использование антагониста nPR RU486 только частично блокировало эффекты прогестерона. Поэтому были проведены исследования влияния активации mPRα на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток глиобластомы человека. Клеточные линии глиобластомы человека U87 и U251 были обработаны специфическим агонистом mPRα.

Org OD 02-0 увеличивал количество клеток U87 и U251 за счет усиления их пролиферации, также увеличивал миграцию и инвазию клеток U87 и U251. Распространение и инвазия клеток U87 уменьшались, когда экспрессия mPRα подавлялась. Org OD 02-0 увеличивал фосфорилирование киназ Src и Akt в обеих клеточных линиях. Эти данные показывают, что прогестерон оказывает свое влияние на прогрессирование глиобластомы человека не только за счет взаимодействия с nPR, но также через клеточные сигнальные пути, активируемые mPRα [43]. Однако учитывая возможность действия Org OD 02-0 как агониста nPR, участие mPRα в исследуемых процессах в клетках U251 глиобластомы не может считаться доказанным.

Экспрессия mPRα была выявлена у пациентов с аденокарциномой легких и влияла на эффективность лечения EGFR-тирозинкиназным ингибитором EGFR-TKI. Прогестерон или его производное Org OD 02-0, действуя через mPRα, усиливали функцию EGFR-TKI по подавлению пролиферации, миграции и инвазии клеток аденокарциномы легких in vitro и in vivo. Кроме того, активация mPRα запускала каскад, ингибирующий EGFR-Src-ERK1/2 путь, тем самым способствуя противоопухолевому эффекту [44]. Те же авторы показали, что mPRα опосредует способность прогестерона ингибировать рост клеток аденокарциномы легких, приводя следующие доказательства: mPRα экспрессировался в клетках аденокарциномы легких A549 и PC-9 и локализовался на клеточной мембране; прогестерон и Org OD 02-0 ингибировали пролиферацию клеток аденокарциномы легких; с помощью нокдауна экспрессии mPRα показано участие этого рецептора в действии прогестерона и Org OD 02-0 на ингибирование пролиферации клеток аденокарциномы легких; mPRα опосредовал способность прогестерона и Org OD 02-0 ингибировать PKA/CREB и PKA/β-катенин сигнальные пути; прогестерон и Org OD 02-0 ингибировали рост опухоли аденокарциномы легкого в модели ксенотрансплантатной опухоли у мышей in vivo [45]. Вводимые мышам клетки А549 не содержали nPR, но в них искусственно экспрессировали mPRα. Поэтому Org OD 02-0, как, впрочем, и сам прогестерон, мог действовать только через этот рецептор и осуществлял при этом противоопухолевый эффект.

Работ с использованием Org OD 02-0 in vivo немного. Одна из них касается изучения действия прогестерона и агониста mPRα в моделях пролактиномы. Предварительно были изучены функции mPRs в гипофизе. Экспрессия mPRα была самой высокой среди mPRs в передней доле гипофиза крыс. Иммуноокрашивание mPRα было обнаружено в соматотрофах, гонадотрофах и лактотрофах. 63% mPRα-положительных клеток в гипофизе были лактотрофами, это позволило предположить, что mPRα участвует в контроле секреции пролактина (ПРЛ). Для проверки гипотезы гипофизы крыс инкубировали либо с прогестероном, либо со специфическим агонистом mPRα Org OD 02-0, измеряя затем секрецию ПРЛ. Как прогестерон, так и Org OD 02-0 снижали секрецию ПРЛ. На клеточной линии GH3, полученной из опухоли гипофиза крысы, было показано, что прогестерон и Org OD 02-0 ингибировали высвобождение ПРЛ, а агонист nPR R5020 был неэффективен. Исследование клеточных механизмов активности mPRα показало, что прогестерон и Org OD 02-0 уменьшали накопление цАМФ, тогда как R5020 не оказывал такого эффекта. Высвобождение ПРЛ блокировалось предварительной обработкой коклюшным токсином, ингибитором белков Go/Gi. TGFβ1 является мощным ингибитором секреции пролактина в лактотрофах. Прогестерон и Org OD 02-0, но не R5020, повышали уровень активированного TGFβ1. Этот эффект не наблюдался при трансфекции клеток mPRα-siRNA. Получены доказательства того, что mPRα опосредует ингибирующее действие прогестерона на секрецию ПРЛ посредством снижения уровня цАМФ и активации TGFβ1 в популяции лактотрофов [46]. Затем изучалась роль mPRs в развитии пролактиномы in vivo. С этой целью экспрессию mPRs в гипофизе изучали в трех животных моделях пролактиномы: а) трансгенные мыши с дефицитом дофаминового рецептора D2; б) трансгенные мыши со сверхэкспрессией β-субъединицы хорионического гонадотропина человека (hCGβ); в) крысы, получавшие эстрогены. Экспрессия mPRs и nPR была значительно снижена в опухолях гипофиза по сравнению с нормой. Однако относительная доля mPRα и mPRβ была значительно выше в пролактиномах. Селективный агонист mPR Org OD 02-0 значительно ингибировал высвобождение ПРЛ как в нормальных, так и в опухолевых эксплантатах гипофиза, проявляя более выраженный эффект в опухолевых тканях. Поскольку прогестерон также регулирует секрецию ПРЛ, косвенно воздействуя на дофаминергические нейроны, было изучено участие mPRs в этом эффекте. Обнаружено, что гипоталамус имеет высокую экспрессию mPRs. Как прогестерон, так и Org OD 02-0 увеличивали высвобождение дофамина в эксплантатах гипоталамуса. В условиях in vivo, которое обеспечивает действие как на гипофиз, так и на гипоталамус, агонист mPR Org OD 02-0 значительно подавлял гиперпролактинемию у трансгенных самок мышей с пролактиномой. Однократное введение этого соединения значительно снижало уровень пролактина в сыворотке. Были обнаружены гендерные различия в содержании рецепторов: у самцов экспрессировались более высокие уровни гипофизарного mPRα/β, и у них в этих моделях мышей не развивается пролактинома. Результаты позволили предположить, что активация mPRs может представлять собой новый инструмент для лечения пациентов с гиперпролактинемией, особенно для тех, которые обладают устойчивостью к дофаминергическим препаратам [47]. Однако в экспериментах in vivo нельзя исключить, что Org OD 02-0 действует в том числе и через nPR.

Еще одна работа была посвящена изучению эффектов Org OD 02-0 in vivo. Однократное введение прогестерона увеличивало частоту апноэ у новорожденных крыс, тогда как финастерид (который блокирует превращение прогестерона в аллопрегнанолон, являясь антагонистом 5α-редуктазы) снижал частоту апноэ. Нейроактивный метаболит прогестерона аллопрегнанолон является модулятором рецепторов GABA_A. Агонист nPR R5020 снижал частоту апноэ у самцов, а агонист mPR Org OD 02-0 уменьшал частоту апноэ и у самцов, и у самок и уменьшал частоту дыхания у самок. При хроническом введении прогестерон снижал частоту апноэ более эффективно у самцов, чем у самок. Сделан вывод, что частота апноэ у новорожденных крыс частично определяется половыми особенностями, балансом между прогестероном и аллопрегнанолоном, GABA_A-рецепторами и рецепторами прогестерона [48]. В данном случае прогестерон действует на частоту апноэ через оба типа рецепторов. Половые различия могут быть результатом разного уровня nPR и mPRs у самок и самцов в дорсальной части ствола мозга. Возможная активация ядерных рецепторов Org OD 02-0 в этом процессе не играет роли.

Наконец, in vivo изучалось действие Org OD 02-0 у рыб. Прогестины вызывают процесс созревания и овуляции ооцитов рыб посредством координации негеномных и геномных действий. Был изучен эффект Org OD 02-0, селективного агониста mPRα, на созревание ооцитов рыб и овуляцию in vitro и in vivo. Org OD 02-0 запускал созревание ооцитов in vitro и in vivo. Удивительно, но Org OD 02 вызывал также овуляцию как in vivo, так и in vitro. Яйцеклетки после овуляции, вызванной Org OD 02, можно было оплодотворить искусственным осеменением. Молодняк развивался нормально. Эти результаты показали, что Org OD 02-0 действовал как агонист не только mPRα, но и ядерного рецептора прогестерона (nPR) [49]. Таким образом, эти результаты свидетельствуют, что Org OD 02 может активировать nPR в физиологических условиях.

Рассмотренные работы показали, что Org OD 02 через mPRα и mPRs других подтипов [22, 41] активировал как ингибиторные Gi, так и стимулирующие Golf белки, запуская сигнальные каскады Pi3k/Akt, EGFR/ ERK, RhoA/ROCK, cPKCβII, Src, TGFβ1 или вызывая ингибирование EGFR- Src-ERK1/2, PKA/CREB и PKA/β-катенин сигнальных путей. При этом происходили разнонаправленные изменения в клетках в зависимости от их фенотипа: повышение содержания Ca²⁺ в сперматозоидах и повышение их активности, снижение концентрации Ca²⁺ в цитозоле гладкомышечных клеток сосудов и их релаксация, индукция ритмичных сокращений миометрия беременных крыс, подавление притока Ca²⁺ в Т-клетки. В клетках рака молочной железы и глиобластомы Org OD 02 вызывал ингибирование апоптоза, активацию пролиферации, миграции и инвазии опухолевых клеток, но ингибировал рост опухоли аденокарциномы легкого (табл. 2).

Таблица 2. Механизмы действия и эффекты селективных лигандов mPRs

Изучение эффектов селективных лигандов mPRs 

19-гидроксипрегн-4-ен-20-она (LS-01) и 19-гидрокси-5β-прегн-3-ен-20-она (LS-02)

Поскольку отсутствуют данные о трехмерной структуре mPR, необходимые для моделирования их специфических лигандов, в нашей работе было проведено зондирование лиганд-связывающего кармана mPRα человека, гетерологично экспрессируемого в дрожжевых клетках, с использованием прегнановых стероидов, несущих дополнительное шестичленное кольцо D’ [50, 51], ряда производных прогестерона и некоторых природных стероидов с последовательно меняющимися фрагментами структуры стероидного скелета [52]. Для этого был проведен радиолигандный анализ по измерению связывания [³Н]-прогестерона в отсутствие и в присутствии возрастающих концентраций немеченых конкурентов с мембранной фракцией дрожжей. Большинство использованных стероидов имело очень низкое сродство к mPRα, хотя среди них были соединения с высокой константой взаимодействия с nPR. На основании анализа нашей работы и работы зарубежных исследователей, о которой говорилось ранее [19], был выявлен ряд структурных детерминант, определяющих избирательность связывания полученных соединений с mPRs по сравнению с ядерными рецепторами. Были синтезированы новые аналоги прогестерона, взаимодействие которых с mPRs было изучено радиолигандным методом в клетках человека с высоким уровнем их экспрессии и отсутствием nPR. В этой работе впервые была исследована роль 3-кетона во взаимодействии с мембранными рецепторами прогестерона. Обнаружилось, что для mPRs в отличие от nPR эта группировка не имеет определяющего значения для связывания. В работе 2017 г. среди вновь синтезированных производных прогестерона были выявлены два соединения, являющиеся 3-дезоксистероидами. Это 19-гидроксипрегн-4-ен-20-он (LS-01) и 19-гидрокси-5β-прегн-3-ен-20-он (LS-02), которые связывались с mPRs, но не взаимодействовали с nPR (табл. 1) [53]. Относительная конкурентная активность (ОКА) этих стероидов составляла 10% и 24% от ОКА прогестерона для mPRs соответственно, и 0,2–0,3% для nPR. Индекс дискриминации mPR / nPR этих соединений был 50 и 80, что значительно выше индекса Org OD 02-0, равного 20. В модельной дрожжевой системе с экспрессионной и репортерной плазмидой, несущей ген ядерного рецептора прогестерона В человека и репортерный ген β-галактозидазы, была изучена агонистическая и антагонистическая активность этих соединений [54]. Транскрипционная активность рецептора оценивалась по экспрессии репортерного гена β-галактозидазы под промотором цитохрома С, содержащего пять гормон-чувствительных элементов (HREs), активируемых лиганд-рецепторным комплексом. Для определения агонистической активности соединений изучалась транскрипционная активность nPR-В при добавлении серийных разведений изучаемых стероидов. Для тестирования антагонистической или ингибирующей активности соединений дрожжевые клетки инкубировали сначала с прогестероном в такой минимальной концентрации, которая дает максимальную экспрессию гена-репортера. Затем добавляли серийные разведения тестируемых на антагонистическую активность соединений. Было показано, что LS-01 и LS-02 не обладают ни агонистической, ни антагонистической активностью в отношении nPR-В [54]. Таким образом, данные стероиды можно считать селективными лигандами mPRs. В дальнейшей работе оказалось, что несмотря на относительно низкое сродство, эти соединения оказывают эффекты в клетках, где изучалось их действие. Следует отметить, что, в отличие от самого прогестерона и большинства его производных, выявленные нами селективные лиганды не связываются не только с nPR, но и с ядерными рецепторами других стероидов, поскольку лишены необходимой для такого взаимодействия кето/гидрокси-группы в третьем положении кольца А [55, 56]. Анализ полученных позднее данных позволяет предположить, что использованный в 19-м положении заместитель, по-видимому, оказался неудачным и препятствует взаимодействию LS-01 и LS-02 с mPRs.

Действие селективных лигандов LS-01 и LS-02 на экспрессию цитокинов про- и противовоспалительного действия изучалось в активированных иммунных клетках человека. Были использованы Т-лимфоциты линии Jurkat, моноциты линии ТНР-1 и мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) человека. В работе была исследована экспрессия mPRs и nPRs в изучаемых клетках. Только в моноцитах ТНР-1 была выявлена мРНК nPRs наряду с очень высоким уровнем мРНК mPRβ. В Т-лимфоцитах и в РВМС обнаружена только экспрессия mPRα, mPRβ, а мРНК nPRs отсутствовала. Селективные лиганды действовали однонаправленно с прогестероном во всех клетках. В РВМС под действием этих стероидов повышался уровень мРНК и секретируемого белка провоспалительных цитокинов IL-1β, TNFα, IL-6, мРНК INFγ, понижался – мРНК IL-2, повышался уровень мРНК противовоспалительного цитокина TGFβ, понижался – мРНК IL-4 и секретируемого белка IL-10. В моноцитах, как в РВМС, повышалась экспрессия IL-1β, TNFα, но экспрессия IL-10 также повышалась, а TGFβ достоверно не менялась. В Т-лимфоцитах Jurkat понижалась экспрессия IL-2 и TNFα, повышалась IL-10, а TGFβ не менялась. Таким образом, прогестины действуют на иммунные клетки через mPRs и оказывают как про-, так и противовоспалительные эффекты в зависимости от фенотипа этих клеток. В различных типах иммунных клеток три изучаемых соединения действовали между собой одинаково, но оказывали разные, иногда даже противоположные эффекты. Селективные лиганды mPRs перспективны как иммуномодуляторные прогестины, не оказывающие побочного действия на ткани и органы, клетки которых экспрессируют ядерные рецепторы стероидных гормонов [34].

Далее действие LS-01 и LS-02 было изучено в клетках аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС3, содержащей высокий уровень mPRα и mPRγ. Ядерные рецепторы не были обнаружены в этих клетках. Здесь эффекты селективных лигандов существенно отличались между собой. Прогестерон и соединение LS-01 действовали одинаково практически на все исследуемые процессы пролиферации и гибели клеток. Соединение LS-02 оказывало собственные эффекты, отличающиеся от действия двух других изучаемых стероидов [57]. В работе изучалось влияние стероидов на жизнеспособность клеток, на различные проявления апоптотических процессов, на экспрессию генов факторов, связанных с этими процессами, а также участие двух киназ – р38 МАРК и JNK в сигнальных каскадах при активации mPRs с использованием их ингибиторов SB203580 и SP600125. Действие первого ингибитора парадоксальным образом усиливало в ряде случаев эффекты изучаемых прогестинов. Загадка получила объяснение, когда было изучено активирующее фосфорилирование р38 МАРК и JNK под действием стероидов и на фоне ингибиторов. Ингибитор SB203580 блокирует связывание АТФ в соответствующем кармане р38 МАРК, но он не ингибирует фосфорилирование р38 МАРК вышерасположенными в сигнальном каскаде (upstream) киназами. На фоне ингибитора фосфорилирование киназы р38 усиливалось, но не могло ее активировать. По механизму отрицательной обратной связи вышерасположенные в сигнальном каскаде киназы, видимо, активировались, пытаясь восстановить инактивированный ингибитором фермент. Самым интересным был факт значительного усиления активирующего фосфорилирования JNK на фоне ингибитора р38 МАРК SB203580. Очевидно, в ВхРС3 клетках JNK и р38 МАРК фосфорилировались общей вышерасположенной в сигнальном каскаде киназой. Активация JNK на фоне ингибитора р38 МАРК приводила к усилению эффектов стероидов, опосредуемых этой киназой. Действие ингибитора SP600125 связано с подавлением активирующего фосфорилирования JNK и не имело побочных эффектов. Было обнаружено антипролиферативное подавляющее действие прогестерона и LS-01 на клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека ВхРС3 с участием сигнального каскада JNK. При этом мишенями этого действия были гены белков циклина D1, р21, Ki67, PCNA. Прогестерон и соединение LS-01 оказывали проапоптотическое действие, стимулируя процесс фрагментации ДНК ядер клеток с участием сигнального каскада р38 МАРК. При этом подавлялась экспрессия гена антиапоптотического белка BCL2А1. Соединение LS-02 не влияло на процесс пролиферации, но вызывало апоптотические изменения в проницаемости мембран, связанные с появлением фосфатидилсерина на поверхности клеток. Выявленными мишенями действия этого стероида были гены белков каспазы 9, DAPK (Death-associated protein kinase 1), HRK (harakiri). LS-02 активировал оба сигнальных каскада JNK и р38 МАРК. Возможно, отличающееся действие LS-01 и LS-02 в клетках ВхРС3 связано с активацией разных подтипов mPRs и сигнальных каскадов, поскольку сродство этих стероидов к конкретным субтипам mPRs – α, β и γ пока не изучено детально [57].

В клетках LNCaP карциномы простаты не было обнаружено ни nPRs, ни mPRs. Влияния прогестерона, а также LS-01 и LS-02 на жизнеспособность этих клеток не было выявлено [57].

В клетках HepG2 гепатоцеллюлярной карциномы человека был обнаружен высокий уровень только одного рецептора прогестинов – mPRβ. С использованием селективных лигандов mPRs и прогестерона были изучены функции этого белка и участие р38 МАРК и JNK в сигнальных каскадах при его активации. Действие LS-01, LS-02 и прогестерона в клетках HepG2 было антипролиферативным и проапоптотическим, а также однонаправленным в связи с наличием лишь одного подтипа mPRs. Стероиды подавляли жизнеспособность клеток, стимулировали появление фосфатидилсерина на наружной поверхности мембран, связанное с процессом апоптоза, но не влияли на фрагментацию ДНК ядер в использованном интервале времени. Возможно, поздние проявления апоптоза еще не успели проявиться в этих клетках в изученные сроки. Активирующего фосфорилирования р38 МАРК не наблюдалось под действием данных соединений, но происходила активация всех изоформ JNK. Только прогестерон достоверно изменял экспрессию генов факторов, связанных с пролиферацией и апоптозом в клетках HepG2. При этом изменения не всегда соответствовали его результирующему эффекту. LS-01 и LS-02 не влияли на транскрипцию изученных генов, возможно, из-за их более низкого сродства к mPRβ и недостаточной его активации [58].

Перспективы

К настоящему времени выявленные селективные лиганды mPRs, используемые в различных исследованиях, представлены тремя соединениями – Org OD 02-0, LS-01 и LS-02. Первое имеет существенное сродство к nPRs и в некоторых случаях проявляет себя как агонист этих рецепторов [49]; другие два не взаимодействуют с nPRs и с другими ядерными рецепторами стероидов, но их сродство к mPRs низкое [53], поэтому эффекты часто слабее, чем у прогестерона. В 2021 г. вышел обзор, в котором была сделана попытка обобщить имеющиеся данные о строении взаимодействующих с mPRs соединений и проанализировать их различия в связывании с nPRs и mPRs. На основании этого анализа были выявлены основные структурные фрагменты молекулы стероида, которые ответственны за эффективность связывания и избирательность взаимодействия с mPRs. Были предложены направления модификации стероидного каркаса для создания новых селективных лигандов мембранных рецепторов прогестерона [59].

Функциональные домены nPRs были идентифицированы, а их структуры подробно изучены еще в 1998 г. [55, 56]. Остатки алифатических и ароматических аминокислот в лиганд-связывающем домене (LBD) окружают гидрофобное ядро прогестерона. Структура LBD, выявленная с помощью рентгеноструктурного анализа, показывает, что 3-кетогруппа прогестерона принимает водородные связи от двух аминокислотных остатков Q725 и R766 [55, 56, 60]. Это было подтверждено мутационным анализом, показывающим, что мутанты Q725A или R766H демонстрируют полную потерю аффинности связывания с nPR-B [60]. Эти результаты иллюстрируют важность 3-кетогруппы в прогестероне в связывании с nPRs. 20-кетогруппа прогестерона не связывается с LBD водородными связями, важны только гидрофобные контакты для связывания прогестерона с этой частью LBD.

В 2022 г. появилось новое исследование, посвященное поиску путей к созданию новых селективных лигандов mPRs. Было осуществлено моделирование структуры mPRα на основе структуры рецепторов адипонектина (AdipoR), определенной по их кристаллам рентгеноструктурным анализом. Модель гомологии mPRα показала, что водородная связь 20-кетогруппы прогестерона с остатком глютамина (Q) в положении 206 в связывающем кармане этого рецептора критически важна. Это подтвердил мутационный анализ, который не выявил связывания прогестерона с мутантным рецептором при замене глютамина (Q) 206 на аланин или аргинин. Модель предсказала гидрофобные взаимодействия прогестерона с аминокислотными остатками, окружающими лиганд-связывающий карман, в том числе с валином 146, мутация которого с заменой на полярный серин привела к полной потере связывания прогестерона. Но что особенно важно, модель mPRα показала отсутствие донора водородной связи вблизи 3-кетогруппы прогестерона. Исследования активности взаимодействия mPRα с 3-дезоксистероидами показали, что в отличие от nPRs, для связывания с mPRα 3-карбонильный кислород не является необходимым [61]. Таким образом, эта работа подтвердила наши исследования и правильность выбора 3-дезоксистероидов LS-01 и LS-02. Очевидно, именно эта особенность структуры – отсутствие кислородной функции в третьем положении, будет в дальнейшем основой для разработки синтеза эффективных и избирательно взаимодействующих с mPRs соединений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Используемые в настоящее время селективные лиганды mPRs – Org OD 02-0, LS-01 и LS-02 имеют существенные недостатки и не перспективны как лекарственные средства для клинического применения, но позволяют исследовать функции изучаемых мембранных рецепторов в эксперименте. Их использование помогло выработать стратегию для выработки направлений модификации стероидной молекулы с высокой эффективностью и избирательностью взаимодействия. Мембранные рецепторы прогестерона могут играть значительную роль в гомеостазе, создавая баланс между воспалением и иммуносупрессией. Разработка аналогов прогестерона как препаратов, нацеленных на специфическое действие через mPRs, может иметь терапевтическое значение для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, во время трансплантации, при терапии рака, при беременности, когда есть риск потери плода, при болезни сосудов, пролактинемии, болезни Паркинсона, мужском бесплодии.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета гранта Российского научного фонда № 23-25-00071, https://rscf.ru/project/23-25-00071/. Никаких дополнительных грантов на проведение и/или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор данной работы заявляет, что у нее нет конфликта интересов.

Об авторах

Т. А. Щелкунова

Автор, ответственный за переписку.
Email: Schelkunova-t@mail.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рисунок 1

Скачать (24KB)

Метаданные

3. Рисунок 2

Скачать (25KB)

Метаданные

4. Рисунок 3

Скачать (25KB)

Метаданные

5. Рисунок 4

Скачать (25KB)

Метаданные