NGS amplification panel HCV-seq for sequencing hepatitis C virus RNA (Flaviviridae: Hepacivirus)

Cover Image

Cite item

Full Text

Abstract

Introduction. Hepatitis C is a pressing global public health issue. The high variability of the hepatitis C virus (HCV) complicates its whole-genome sequencing; most studies sequence only specific regions of the genome. There is a need for a simple and reliable method for sequencing the whole genome of HCV.

Objective. Development and validation of NGS panel for whole-genome sequencing of HCV.

Materials and methods. This study presents NGS amplification panel for sequencing the genomes of HCV genotypes 1, 2, and 3. Depending on the genotype, a set of 79, 67, or 89 primers is used. These primers enable amplification of overlapping regions of the HCV genome.

Results. The panel was tested on 153 HCV RNA samples isolated from blood plasma specimens (93/6/54 samples of genotypes 1/2/3, respectively). Shannon entropy analysis showed that genetic heterogeneity within the E2 gene is significantly higher than in other parts of viral genome. The frequency of mutations associated with drug resistance was determined. Specifically, for genotype 1, the following mutation detection rates were observed in NS3: Y56F – 37.6%, V170I – 23.7%; in NS5a: R30Q – 8.6%, P58L/S/T – 6.5%, A92T – 4.3%; in NS5b: L159F – 45.2%, S556G/N – 33.3%.

Conclusion. The current study describes a method for whole-genome sequencing of HCV genotypes 1, 2, and 3. The HCV sequencing panel shows great potential for use in scientific research and epidemiological monitoring.

About the authors

Mikhail D. Chanyshev

Central Research Institute of Epidemiology

Author for correspondence.
Email: chanishq@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6943-2915

PhD, Senior Researcher, Laboratory for Genomic Research

Russian Federation, 111123, Moscow

Anastasia S. Chernyshova

Central Research Institute of Epidemiology; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: chernyshova.a@cmd.su
ORCID iD: 0009-0000-2440-1309

Laboratory assistant, Laboratory for Genomic Research, Central Research Institute of Epidemiology

Russian Federation, 111123, Moscow; 141701, Dolgoprudny

Albina G. Glushchenko

Central Research Institute of Epidemiology; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: albinagluschenko@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-8851-8703

Laboratory research assistant, Laboratory for Genomic Research, Central Research Institute of Epidemiology

Russian Federation, 111123, Moscow; 141701, Dolgoprudny

Antonina A. Grishaeva

Central Research Institute of Epidemiology

Email: antoninagrishaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1326-9274

PhD, Researcher of the Clinical Department of Infectious Pathology

Russian Federation, 111123, Moscow

Vera V. Makashova

Central Research Institute of Epidemiology

Email: veramakashova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0982-3527

Dr. of Sci., Leading Researcher, Clinical Department of Infectious Diseases

Russian Federation, 111123, Moscow

Zhanna B. Ponezheva

Central Research Institute of Epidemiology

Email: doktorim@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6539-4878

Dr. of Sci., Associate Professor, Head of the Clinical Department of Infectious Diseases

Russian Federation, 111123, Moscow

Kamil F. Khafizov

Central Research Institute of Epidemiology

Email: kkhafizov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5524-0296

PhD, Head of Laboratory for Genomic Research

Russian Federation, 111123, Moscow

Vasily G. Akimkin

Central Research Institute of Epidemiology

Email: vgakimkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4228-9044

Academician of the Russian Academy of Sciences, Dr. of Sci., Professor, Director

Russian Federation, 111123, Moscow

References

  1. Isakov V., Nikityuk D. Elimination of HCV in Russia: Barriers and perspective. Viruses. 2022; 14(4): 790. https://doi.org/10.3390/v14040790
  2. Pimenov N.N., Komarova S.V., Karandashova I.V., Tsapkova N.N., Volchkova E.V., Chulanov V.P. Hepatitis С and its outcomes in Russia: analysis of incidence, prevalence and mortality rates before the start of the programme of infection elimination. Infectious diseases: news, opinions, training. 2018; 16(3): 37–45. https://doi.org/10.20953/1729-9225-2018-3-37-45 https://elibrary.ru/ysjrqt (in Russian)
  3. Messina J.P., Humphreys I., Flaxman A., Brown A., Cooke G.S., Pybus O.G., et al. Global distribution and prevalence of hepatitis C virus genotypes. Hepatology. 2015; 61(1): 77–87. https://doi.org/10.1002/hep.27259
  4. Pimenov N., Kostyushev D., Komarova S., Fomicheva A., Urtikov A., Belaia O., et al. Epidemiology and genotype distribution of hepatitis C virus in Russia. Pathogens. 2022; 11(12): 1482. https://doi.org/10.3390/pathogens11121482
  5. Raimondi S., Bruno S., Mondelli M.U., Maisonneuve P. Hepatitis C virus genotype 1b as a risk factor for hepatocellular carcinoma development: a meta-analysis. J. Hepatol. 2009; 50(6): 1142–54. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2009.01.019
  6. Kalaghatgi P., Sikorski A.M., Knops E., Rupp D., Sierra S. Geno2pheno[HCV] – a Web-based interpretation system to support hepatitis C treatment decisions in the era of direct-acting antiviral agents. PLoS One. 2016; 11(5): e0155869. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155869
  7. Ahmed A., Felmlee D.J. Mechanisms of hepatitis C viral resistance to direct acting antivirals. Viruses. 2015; 7(12): 6716–29. https://doi.org/10.3390/v7122968
  8. Yamauchi K., Maekawa S., Osawa L., Komiyama Y., Nakakuki N., Takada H., et al. Single-molecule sequencing of the whole HCV genome revealed envelope deletions in decompensated cirrhosis associated with NS2 and NS5A mutations. J. Gastroenterol. 2024; 59(11): 1021–36. https://doi.org/10.1007/s00535-024-02146-3
  9. Fishman S.L., Factor S.H., Balestrieri C., Fan X., Dibisceglie A.M., Desai S.M., et al. Mutations in the hepatitis C virus core gene are associated with advanced liver disease and hepatocellular carcinoma. Clin. Cancer Res. 2009; 15(9): 3205–13. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-08-2418
  10. Costantino A., Spada E., Equestre M., Bruni R., Tritarelli E., Coppola N., et al. Naturally occurring mutations associated with resistance to HCV NS5B polymerase and NS3 protease inhibitors in treatment-naïve patients with chronic hepatitis C. Virol. J. 2015; 12: 186. https://doi.org/10.1186/s12985-015-0414-1
  11. Iio E., Shimada N., Abe H., Atsukawa M., Yoshizawa K., Takaguchi K., et al. Efficacy of daclatasvir/asunaprevir according to resistance-associated variants in chronic hepatitis C with genotype 1. J. Gastroenterol. 2017; 52(1): 94–103. https://doi.org/10.1007/s00535-016-1225-x
  12. Spitz N., Barros J.J., do Ó K.M., Brandão-Mello C.E., Araujo N.M. The first complete genome sequences of hepatitis C virus subtype 2b from Latin America: molecular characterization and phylogeographic analysis. Viruses. 2019; 11(11): 1000. https://doi.org/10.3390/v11111000
  13. Bull R.A., Eltahla A.A., Rodrigo C., Koekkoek S.M., Walker M., Pirozyan M.R., et al. A method for near full-length amplification and sequencing for six hepatitis C virus genotypes. BMC Genomics. 2016; 17: 247. https://doi.org/10.1186/s12864-016-2575-8
  14. Aisyah D.N., Story A., Kremyda-Vlachou M., Kozlakidis Z., Shalcross L., Hayward A. Assessing hepatitis C virus distribution among vulnerable populations in London using whole genome sequencing: results from the TB-REACH study. WellcomeOpenRes. 2021; 6: 229. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.16907.1
  15. Kotova V.O., Balakhontseva L.A., Bazykina E.A., Trotsenko O.E., Beldy V.N., Kirdyashova S.E. Genetic diversity of hepatitis c virus in Nanaian region, Khabarovsk territory. Infektsiya i immunitet. 2021; 11(1): 148–56. https://doi.org/10.15789/2220-7619-GDO-1265 https://elibrary.ru/enfery (in Russian)
  16. Reingardt D.E., Ostankova Yu.V., Lyalina L.V., Anufrieva E.V., Semenov A.V., Totolian A.A. Distribution of hepatitis С virus drug resistance mutations among patients with recurrence of the disease during therapy with direct antiviral drugs. VICh-infektsiya i immunosupressii. 2023; 15(4): 86–93. https://doi.org/10.22328/2077-9828-2023-15-4-86-93 (in Russian)
  17. Isakov V., Hedskog C., Wertheim J.O., Hostager R.E., Parhy B., Schneider A.B., et al. Prevalence of resistance-associated substitutions and phylogenetic analysis of hepatitis C virus infection in Russia. Int. J. Infect. Dis. 2021; 113: 36–42. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.09.041
  18. Chanyshev M.D., Vlasenko N.V., Roev G.V., Kotov I.A., Glushchenko A.G., Makashova V.V., et al. NGS amplification panel for HBV (Hepadnaviridae: Orthohepadnavirus) sequencing. Voprosy virusologii. 2024; 69(1): 65–75. https://doi.org/10.36233/0507-4088-212 (in Russian)
  19. Cheng X.D., Xu H.F., Wei X.M., Zhou H.Z. Variation analysis of E1 and E2 in HCV subtypes. Arch. Virol. 2015; 160(10): 2479–82. https://doi.org/10.1007/s00705-015-2533-9
  20. Kandel S., Hartzell S.L., Ingold A.K., Turner G.A., Kennedy J.L., Ussery D.W. Genomic surveillance of SARS-CoV-2 using long-range PCR primers. Front. Microbiol. 2024; 15: 1272972. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1272972
  21. Koskela von Sydow A., Lindqvist C.M., Asghar N., Johansson M., Sundqvist M., Mölling P., et al. Comparison of SARS-CoV-2 whole genome sequencing using tiled amplicon enrichment and bait hybridization. Sci. Rep. 2023; 13(1): 6461. https://doi.org/10.1038/s41598-023-33168-1
  22. Yoshimi S., Imamura M., Murakami E., Hiraga N., Tsuge M., Kawakami Y., et al. Long term persistence of NS5A inhibitor-resistant hepatitis C virus in patients who failed daclatasvir and asunaprevir therapy. J. Med. Virol. 2015; 87(11): 1913–20. https://doi.org/10.1002/jmv.24255
  23. Wyles D.L., Luetkemeyer A.F. Understanding hepatitis C virus drug resistance: clinical implications for current and future regimens. Top Antivir. Med. 2017; 25(3): 103–9.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Coverage of 153 samples. The genome region was considered as read when coverage was at least 10 reads. The coverage percentage was calculated for the region flanked by primers. Samples are sorted by coverage percentage and genotype.

Download (420KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Log10 of the reads per amplicon normalized by total reads per sample. a – genotype 1, b – genotype 2, c – genotype 3. The X-axis shows the amplicons, the Y-axis shows the samples. Unread (yellow) regions, singly distributed across genomes and samples, are associated with multiple mutations at the primer annealing sites in a given samples.

Download (1MB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Phylogenetic tree of sequenced HCV samples. The genotype colors correspond to [3]. Reference sequences are labeled in black, while sequences obtained in this study are highlighted in blue.

Download (1MB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Average Shannon entropy for non-overlapping 40-nucleotide regions of the genome. a – Shannon entropy profile for genotype 1, b – Shannon entropy profile for genotype 2, c – Shannon entropy profile for genotype 3. D – Schematic representation of the HCV genome with genome region boundaries indicated. Dashed lines indicate the boundaries of the E1 and E2 regions.

Download (668KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. The detection rates of mutations in the NS3, NS5a, and NS5b coding regions associated with resistance to therapy. Gray fields represent undefined areas, white – wild type, green – mutations characteristic of the genotype, yellow – substitutions not described in the literature, and red – mutations described in the literature as mutations of resistance to antiviral therapy. The X-axis shows mutations and genome regions, the Y-axis shows samples and genotypes.

Download (1MB)
Indexing metadata
7. Supplementary to the article
Download (351KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Chanyshev M.D., Chernyshova A.S., Glushchenko A.G., Grishaeva A.A., Makashova V.V., Ponezheva Z.B., Khafizov K.F., Akimkin V.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».