Амплификационная панель NGS HCV-seq для таргетного секвенирования РНК вируса гепатита С (Flaviviridae: Hepacivirus)

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Гепатит С является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире. Высокая вариабельность вируса гепатита С (ВГС) осложняет его полногеномное секвенирование, в большинстве исследований секвенированы только отдельные регионы генома. Существует необходимость в простом и надежном методе секвенирования полного генома ВГС.

Цель работы. Создание и апробация панели NGS для полногеномного секвенирования ВГС.

Материалы и методы. В работе представлена амплификационная панель NGS для секвенирования генома ВГС генотипов 1, 2 и 3. В зависимости от генотипа использован набор, состоящий из 79, 67 или 89 праймеров, при помощи которых осуществляется амплификация перекрывающихся участков генома ВГС.

Результаты. Панель была апробирована на 153 образцах РНК ВГC, выделенных из крови (93/6/54 образца генотипов 1/2/3 соответственно). Анализ энтропии Шеннона показал, что в пределах гена E2 генетическая неоднородность значительно выше, чем в остальной части генома. Была определена частота встречаемости мутаций, ассоциированных с лекарственной резистентностью. В частности, для генотипа 1 была отмечена следующая частота встречаемости мутаций в NS3: Y56F – 37,6%, V170I – 23,7%; в NS5a: R30Q – 8,6%, P58L/S/T – 6,5%, A92T – 4,3%; в NS5b: L159F – 45,2%, S556G/N – 33,3%.

Заключение. В работе изложен способ полногеномного секвенирования генома ВГС генотипов 1, 2 и 3. Панель для секвенирования ВГС обладает большим потенциалом для использования в научных исследованиях и эпидемиологическом мониторинге.

Об авторах

Михаил Дамирович Чанышев

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: chanishq@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6943-2915

канд. биол. наук, старший научный сотрудник Лаборатории геномных исследований

Россия, 111123, г. Москва

Анастасия Сергеевна Чернышова

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора; ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»

Email: chernyshova.a@cmd.su
ORCID iD: 0009-0000-2440-1309

лаборант Лаборатории геномных исследований ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Россия, 111123, г. Москва; 141701, г. Долгопрудный

Альбина Григорьевна Глущенко

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора; ФГАОУ ВО «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)»

Email: albinagluschenko@gmail.com
ORCID iD: 0009-0002-8851-8703

лаборант-исследователь Лаборатории геномных исследований ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора

Россия, 111123, г. Москва; 141701, г. Долгопрудный

Антонина Алексеевна Гришаева

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Email: antoninagrishaeva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1326-9274

канд. мед. наук, научный сотрудник Клинического отдела инфекционной патологии

Россия, 111123, г. Москва

Вера Васильевна Макашова

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Email: veramakashova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0982-3527

д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник Клинического отдела инфекционной патологии

Россия, 111123, г. Москва

Жанна Бетовна Понежева

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Email: doktorim@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6539-4878

д-р мед. наук, доцент, заведующая Клиническим отделом инфекционной патологии

Россия, 111123, г. Москва

Камиль Фаридович Хафизов

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Email: kkhafizov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5524-0296

канд. биол. наук, заведующий Лабораторией геномных исследований

Россия, 111123, г. Москва

Василий Геннадьевич Акимкин

ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Email: vgakimkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4228-9044

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор

Россия, 111123, г. Москва

Список литературы

  1. Isakov V., Nikityuk D. Elimination of HCV in Russia: Barriers and perspective. Viruses. 2022; 14(4): 790. https://doi.org/10.3390/v14040790
  2. Пименов Н.Н., Комарова С.В., Карандашова И.В., Цапкова Н.Н., Волчкова Е.В., Чуланов В.П. Гепатит С и его исходы в России: анализ заболеваемости, распространенности и смертности до начала программы ликвидации инфекции. Инфекционные болезни. 2018; 16(3): 37–45. https://doi.org/10.20953/1729-9225-2018-3-37-45 https://elibrary.ru/ysjrqt
  3. Messina J.P., Humphreys I., Flaxman A., Brown A., Cooke G.S., Pybus O.G., et al. Global distribution and prevalence of hepatitis C virus genotypes. Hepatology. 2015; 61(1): 77–87. https://doi.org/10.1002/hep.27259
  4. Pimenov N., Kostyushev D., Komarova S., Fomicheva A., Urtikov A., Belaia O., et al. Epidemiology and genotype distribution of hepatitis C virus in Russia. Pathogens. 2022; 11(12): 1482. https://doi.org/10.3390/pathogens11121482
  5. Raimondi S., Bruno S., Mondelli M.U., Maisonneuve P. Hepatitis C virus genotype 1b as a risk factor for hepatocellular carcinoma development: a meta-analysis. J. Hepatol. 2009; 50(6): 1142–54. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2009.01.019
  6. Kalaghatgi P., Sikorski A.M., Knops E., Rupp D., Sierra S. Geno2pheno[HCV] – a Web-based interpretation system to support hepatitis C treatment decisions in the era of direct-acting antiviral agents. PLoS One. 2016; 11(5): e0155869. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155869
  7. Ahmed A., Felmlee D.J. Mechanisms of hepatitis C viral resistance to direct acting antivirals. Viruses. 2015; 7(12): 6716–29. https://doi.org/10.3390/v7122968
  8. Yamauchi K., Maekawa S., Osawa L., Komiyama Y., Nakakuki N., Takada H., et al. Single-molecule sequencing of the whole HCV genome revealed envelope deletions in decompensated cirrhosis associated with NS2 and NS5A mutations. J. Gastroenterol. 2024; 59(11): 1021–36. https://doi.org/10.1007/s00535-024-02146-3
  9. Fishman S.L., Factor S.H., Balestrieri C., Fan X., Dibisceglie A.M., Desai S.M., et al. Mutations in the hepatitis C virus core gene are associated with advanced liver disease and hepatocellular carcinoma. Clin. Cancer Res. 2009; 15(9): 3205–13. https://doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-08-2418
  10. Costantino A., Spada E., Equestre M., Bruni R., Tritarelli E., Coppola N., et al. Naturally occurring mutations associated with resistance to HCV NS5B polymerase and NS3 protease inhibitors in treatment-naïve patients with chronic hepatitis C. Virol. J. 2015; 12: 186. https://doi.org/10.1186/s12985-015-0414-1
  11. Iio E., Shimada N., Abe H., Atsukawa M., Yoshizawa K., Takaguchi K., et al. Efficacy of daclatasvir/asunaprevir according to resistance-associated variants in chronic hepatitis C with genotype 1. J. Gastroenterol. 2017; 52(1): 94–103. https://doi.org/10.1007/s00535-016-1225-x
  12. Spitz N., Barros J.J., do Ó K.M., Brandão-Mello C.E., Araujo N.M. The first complete genome sequences of hepatitis C virus subtype 2b from Latin America: molecular characterization and phylogeographic analysis. Viruses. 2019; 11(11): 1000. https://doi.org/10.3390/v11111000
  13. Bull R.A., Eltahla A.A., Rodrigo C., Koekkoek S.M., Walker M., Pirozyan M.R., et al. A method for near full-length amplification and sequencing for six hepatitis C virus genotypes. BMC Genomics. 2016; 17: 247. https://doi.org/10.1186/s12864-016-2575-8
  14. Aisyah D.N., Story A., Kremyda-Vlachou M., Kozlakidis Z., Shalcross L., Hayward A. Assessing hepatitis C virus distribution among vulnerable populations in London using whole genome sequencing: results from the TB-REACH study. WellcomeOpenRes. 2021; 6: 229. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.16907.1
  15. Котова В.О., Балахонцева Л.А., Базыкина Е.А., Троценко О.Е., Бельды В.Н., Кирдяшова С.Е. Генетическое разнообразие вируса гепатита С среди населения Нанайского района Хабаровского края. Инфекция и иммунитет. 2021; 11(1): 148–56. https://doi.org/10.15789/2220-7619-GDO-1265 https://elibrary.ru/enfery
  16. Рейнгардт Д.Э., Останкова Ю.В., Лялина Л.В., Ануфриева Е.В., Семенов А.В., Тотолян А.А. Распространенность мутаций лекарственной устойчивости вируса гепатита С среди пациентов с рецидивом заболевания на терапии препаратами прямого противовирусного действия. ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2023; 15(4): 86–93. https://doi.org/10.22328/2077-9828-2023-15-4-86-93
  17. Isakov V., Hedskog C., Wertheim J.O., Hostager R.E., Parhy B., Schneider A.B., et al. Prevalence of resistance-associated substitutions and phylogenetic analysis of hepatitis C virus infection in Russia. Int. J. Infect. Dis. 2021; 113: 36–42. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2021.09.041
  18. Чанышев М.Д., Власенко Н.В., Роев Г.В., Котов И.А., Глущенко А.Г., Макашова В.В. и др. Амплификационная панель NGS для секвенирования ДНК вируса гепатита В (Hepadnaviridae: Orthohepa DNA virus). Вопросы вирусологии. 2024; 69(1): 65–75. https://doi.org/10.36233/0507-4088-212
  19. Cheng X.D., Xu H.F., Wei X.M., Zhou H.Z. Variation analysis of E1 and E2 in HCV subtypes. Arch. Virol. 2015; 160(10): 2479–82. https://doi.org/10.1007/s00705-015-2533-9
  20. Kandel S., Hartzell S.L., Ingold A.K., Turner G.A., Kennedy J.L., Ussery D.W. Genomic surveillance of SARS-CoV-2 using long-range PCR primers. Front. Microbiol. 2024; 15: 1272972. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1272972
  21. Koskela von Sydow A., Lindqvist C.M., Asghar N., Johansson M., Sundqvist M., Mölling P., et al. Comparison of SARS-CoV-2 whole genome sequencing using tiled amplicon enrichment and bait hybridization. Sci. Rep. 2023; 13(1): 6461. https://doi.org/10.1038/s41598-023-33168-1
  22. Yoshimi S., Imamura M., Murakami E., Hiraga N., Tsuge M., Kawakami Y., et al. Long term persistence of NS5A inhibitor-resistant hepatitis C virus in patients who failed daclatasvir and asunaprevir therapy. J. Med. Virol. 2015; 87(11): 1913–20. https://doi.org/10.1002/jmv.24255
  23. Wyles D.L., Luetkemeyer A.F. Understanding hepatitis C virus drug resistance: clinical implications for current and future regimens. Top Antivir. Med. 2017; 25(3): 103–9.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Покрытие 153 образцов. Область генома считали прочитанной при глубине не менее 10 прочтений. Процент покрытия считали от области, ограниченной праймерами. Образцы отсортированы по проценту покрытия и генотипу.

Скачать (420KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Log10 глубины прочтения для каждого ампликона, нормированной на общее количество прочтений на образец. а – генотип 1, б – генотип 2, в – генотип 3. По оси X отмечены ампликоны, по оси Y – образцы. Непрочитанные (желтые) участки единично распределены по геномам и образцам и связаны с множественными мутациями на местах отжига праймера в конкретном образце.

Скачать (1MB)
Метаданные
4. Рис. 3. Филогенетическое дерево секвенированных образцов ВГC. Цвета генотипов соответствуют [3]. Референсные последовательности отмечены черным цветом, а секвенированные в данной работе – синим.

Скачать (1MB)
Метаданные
5. Рис. 4. Среднее значение энтропии Шеннона для неперекрывающихся участков генома длиной 40 нуклеотидов. a – профиль энтропии Шеннона для генотипа 1, б – профиль энтропии Шеннона для генотипа 2, в – профиль энтропии Шеннона для генотипа 3, D – схематическое представление генома ВГС с обозначением границ генов. Пунктирные линии обозначают границы генов E1 и E2.

Скачать (668KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Встречаемость мутаций в генах NS3, NS5a, NS5b, ассоциированных с резистентностью к терапии. Серые поля представляют собой неопределенные области, белые – дикий тип, зеленые – мутации, характерные для данного генотипа, желтые – замены, не описанные в литературе, красные – мутации, описанные в литературе как мутации устойчивости к противовирусной терапии. По оси X отмечены мутации и гены, по оси Y – образцы и генотипы.

Скачать (1MB)
Метаданные
7. Приложение к статье
Скачать (351KB)
Метаданные

© Чанышев М.Д., Чернышова А.С., Глущенко А.Г., Гришаева А.А., Макашова В.В., Понежева Ж.Б., Хафизов К.Ф., Акимкин В.Г., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».