High-Quality RNA Extraction and Evaluation of Reference Genes for qPCR Assay of  Pinus sylvestris  L. Trunk Tissues

Yu. L. Moshchenskaya; Мощенская Ю. Л.; N. A. Galibina; Галибина Н. А.; M. A. Korzhenevskiy; Корженевский М. А.; T. V. Tarelkina; Тарелкина Т. В.; K. M. Nikerova; Никерова К. М.; O. V. Chirva; Чирва О. В.

doi:10.31857/S0475145023010093

Получение качественного препарата РНК и оценка референсных генов для постановки количественной ПЦР при работе с тканями ствола Pinus sylvestris L.

Авторы: Мощенская Ю.Л.¹, Галибина Н.А.¹, Корженевский М.А.¹, Тарелкина Т.В.¹, Никерова К.М.¹, Чирва О.В.¹
Учреждения:
1. Институт леса — обособленное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра “Карельский научный центр Российской академии наук”
Выпуск: Том 54, № 1 (2023)
Страницы: 27-40
Раздел: ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
URL: https://journals.rcsi.science/0475-1450/article/view/137042
DOI: https://doi.org/10.31857/S0475145023010093
EDN: https://elibrary.ru/FRMYSQ
ID: 137042

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Только для подписчиков

Аннотация
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) относится к видам древесных растений, для которых характерно наличие ядровой древесины (HW), формирующейся в ходе старения заболони (SW). Благодаря четкой границе между SW и HW P. sylvestris может служить модельным древесным растением для изучения закономерностей формирования HW. В настоящее время для изучения процессов формирования тканей ствола древесных растений активно применяются молекулярно-генетические методы. Особенностью тканей ствола хвойных древесных растений является содержание большого количества вторичных метаболитов, низкое содержание нуклеиновых кислот и возможная частичная деградация РНК. В данной работе рассматривается выбор наиболее успешного метода выделения высококачественного препарата РНК для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) в тканях ствола P. sylvestris по радиальному вектору “проводящая флоэма/камбиальная зона – дифференцирующаяся ксилема – внешняя часть SW (1–2 годичных кольца) – внутренняя часть SW (1–2 кольца перед транзитной зоной (TZ)) – TZ (2 кольца перед HW)” для получения воспроизводимых данных ПЦР-РВ. Во всех описанных тканях проведена оценка стабильности экспрессии шести потенциальных референсных генов (Actin1, α-Tubulin, β-Tubulin, Ef1a, GAPDH, UBQ). Показаны различия в уровнях экспрессии целевых генов при нормализации данных с использованием референсных генов с различной стабильностью экспрессии.

Ключевые слова

Pinus sylvestris, выделение РНК, нормализация, ПЦР-РВ, референсные гены, экспрессия генов

Список литературы

Су М., Цзан В., Яо Н., Хуан М. Выделение высококачественной РНК из различных тканей Populus // Физиология растений. 2009. Т. 56. № 5. С. 791.
Antonova G.F., Stasova V.V. Effects of environmental factors on wood formation in larch (Larix deciduas Ldb.) stems // Trees. 1997. V. 11. P. 462. https://doi.org/10.1007/PL00009687
Bustin S.A., Beaulieu J.F., Huggett J., Jaggi R., Kibenge F.S., Olsvik P.A., Penning L.C., Toegel S. MIQE précis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments // BMC Mol. Biol. 2010. V. 11. P. 74. https://doi.org/10.1186/1471-2199-11-74
Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Hugget J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments // Clinical Chemistry. 2009. V. 55. P. 611. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797
Chan K.L., Ho C.L., Namasivayam P., Napis S. A simple and rapid method for RNA isolation from plant tissues with high phenolic compounds and polysaccharides // Protocol Exchange. 2007. https://doi.org/10.1038/nprot.2007
Chang E., Shi S., Liu J., Cheng T., Xue L., Yang X., Yang W., Lan Q., Jiang Z. Selection of reference genes for quantitative gene expression studies in Platycladus orientalis (Cupressaceae) Using real-time PCR // PLoS One. 2012. V. 7(3): e33278.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033278
Chang S., Puryear J., Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees // Plant Mol. Biol. Report. 1993. V. 11. P. 113.
Chen H., Yang Z., Hu Y., Tan J., Jia J., Xu H., Chen X. Reference genes selection for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana L. // Trees. 2016. V. 30. P. 685. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0205182
Chen Y., Weining S., Daggard G. Preparation of total RNA from a very small wheat embryo suitable for differential display // Ann. Appl. Biol. 2003. V. 143. P. 261. https://doi.org/10.1111/j.1744-7348.2003.tb00293.x
Chi X., Hu R., Yang Q., Zhang X., Pan L., Chen N., Chen M., Yang Z., Wang T., He Y., Yu S. Validation of reference genes for gene expression studies in peanut by quantitative real-time RT-PCR // Mol. Genet. Genomics. 2012. V. 287(2). P. 167. https://doi.org/10.1007/s00438-011-0665-5
de Castro E., Sigrist C.J., Gattiker A., Bulliard V., Langendijk-Genevaux P.S., Gasteiger E., Bairoch A., Hulo N. ScanProsite: detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 362. https://doi.org/10.1093/nar/gkl124
Fischer U., Kucukoglu M., Helariutta Y., Bhalerao R.P. The dynamics of cambial stem cell activity // Annu. Rev. Plant Biol. 2019. V. 70. P. 293. https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-050718-100402
Ghawana S., Paul A., Kumar H., Kumar A., Singh H., Bhardwaj P.K., Rani A., Singh R.S., Raizada J., Singh K., Kumar S. An RNA isolation system for plant tissues rich in secondary metabolites // BMC Res. Notes. 2007. V. 4. P. 85. https://doi.org/10.1186/1756-0500-4-85
Han X., Lu M., Chen Y., Zhan Z., Cui Q., Wang Y. Selection of reliable reference genes for gene expression studies using real-time PCR in tung tree during seed development // PLoS One. 2012. V. 7. P. e43084. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043084
Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets // Mol. Biol. Evol. 2016. V. 33. P. 1870. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
Lal L., Sahoo R., Gupta R.K., Sharma P., Kumar S. RNA isolation from highphenolic tea leaves and apical buds // Plant Mol. Biol. Rep. 2001. V. 19. P. 181a. https://doi.org/10.1007/BF02772161
Lim K.J., Paasela T., Harju A., Venäläinen M., Paulin L., Auvinen P., Kärkkäinen K., Teeri T.H. Developmental changes in scots pine transcriptome during heartwood formation // Plant Physiol. 2016. V. 172. P. 1403. https://doi.org/10.1104/pp.16.01082
Marchler-Bauer A., Bryant S.H. CD-Search: protein domain annotations on the fly Nucleic // Acids Res. 2004. V. 32. P. 327. https://doi.org/10.1093/nar/gkh454
Meyer-Gauen G., Herbrand H., Pahnke J., Cerff R., Martin W. Gene structure, expression inEscherichia coliand biochemicalproperties of the NAD1-dependent glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase from Pinus sylvestris chloroplasts // Gene. 1998. V. 209. P. 167. https://doi.org/10.1016/S0378-1119(98)00034-1
Mo J., Xu J., Jin W., Yang L., Yin T., Shi J. Identification of reference genes for quantitative gene expression studies in Pinus massoniana and its introgression hybrid // Forests 2019. V. 10. P. 787. https://doi.org/10.3390/f10090787
Niu X., Zhang G., Xu J., Tao A., Fang P., Su J. Selection of reliable reference genes for quantitative real-time PCR gene expression analysis in Jute (Corchorus capsularis) under stress treatments // Frontiers in Plant Science. 2015. V. 6. P. 848. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00848
Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data // Neurosci. Lett. 2003. V. 339. P. 62. https://doi.org/10.1016/S0304-3940(02)01423-4
Saitou N., Nei M. The Neighbor-Joining Method – a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 406. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.molbev.a040454
Svec D., Tichopad A., Novosadova V., Pfaffl M.W., Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments // Biomol. Detect. Quantif. 2015. V. 3. P. 9. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor S., Wakem M., Dijkman G., Alsarraj M., Nguyen M. A practical approach to RT-qPCR–Publishing data that conform to the MIQE guidelines // Methods. 2010. V. 50. P. S1. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.005
Zhu P., Ma Y., Zhu L., Chen Y., Li R., Ji K. Selection of suitable reference genes in Pinus massoniana Lamb. under different abiotic stresses for qPCR normalization // Forests. 2019. V. 10. P. 632. https://doi.org/10.3390/f10080632
Pfaffl M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. E45. https://doi.org/10.1093/nar/29.9.e45