Thalassiosira tealata Takano, 1980 (Bacillariophyta), a Species of Diatoms New to the Seas of Russia

Full Text

Несмотря на продолжительную историю изучения фитопланктона дальневосточных морей России, современные сведения о его видовом составе не могут считаться окончательными. Для Мирового океана в литературных источниках существует информация о более чем 200 видах Thalassiosira Cleve, 1873, тогда как в Японском море зарегистрировано лишь 36 видов этого рода (Шевченко, Шульгина, 2020; Guiry, Guiry, 2023). Род является одним из самых больших и трудных в идентификации среди диатомовых водорослей, в том числе из-за наличия большого количества мелкоразмерных представителей. Одним из таких видов является Thalassiosira tealatа Takano, 1980, размер клеток которого составляет 5–12 мкм (Bérard-Therriault et al., 1987; Park et al., 2016). Согласно данным литературы, T. tealatа является обитателем теплых прибрежных вод Тихого океана (Takano, 1995). Идентификация новых видов необходима для точной оценки биоразнообразия диатомовых водорослей в морях России.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Сбор проб фитопланктона на станциях в бухтах Житкова и Парис (северо-западная часть о-ва Русский) проводили в рамках мониторинговых исследований в 2020 г. Пробы воды собирали с горизонта 0.5 м при помощи 5-литрового батометра Нискина два раза в месяц круглогодично, всего было отобрано 27 проб. Температуру и соленость поверхностного слоя воды измеряли с помощью многопараметрического зонда HORIBA U-52G (HORIBA Advanced Techno Co, Япония). Наряду с рутинными исследованиями, неидентифицированные клетки рода Thalassiosira изолировали из свежей пробы воды под световым инвертированным микроскопом (СМ) Carl Zeiss AxioVert.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany) (Andersen, 2005). Подробно метод выделения описан ранее (Schevchenko et al., 2022). Изучение морфологии панцирей Thalassiosira проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Carl Zeiss Sigma 300 (СЭМ) (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Германия), материал готовили по стандартной методике (Truby, 1997). Культуральный штамм T. tealata поддерживается в ресурсной коллекции Центра коллективного пользования “Морской биобанк” (http://marbank.dvo.ru/index.php/ru/).

Для получения тотальной ДНК из образцов Thalassiosira использовали набор ДНК-экстран-2 (ООО “Синтол”). С помощью праймеров SSU_F (5’-KACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) и SSU_R (5’-TCACCTACGGAAACCTTGT-3’) (Li et al., 2018) был амплифицирован фрагмент, фланкирующий консервативные домены 18S рДНК (далее 18S).

Реакционная смесь для ПЦР объемом 19 мкл включала 10 мкл AmpliTaq Gold 360 Master Mix, 0.5 мкл Enhancer (Thermo Fisher Scientific), 1 мкл раствора тотальной ДНК, по 0.12 мкл (0.048 мМ) прямого и обратного праймеров и деионизированную воду до конечного объема. Термический алгоритм ПЦР, визуализация и очистка ампликонов, а также методика секвенирования и первичной обработки данных описаны ранее (Shevchenko et al., 2019).

Для филогенетического анализа в качестве референсной базы были привлечены последовательности Thalassiosira, Conticribra и Skeletonema из ГенБанк (табл. 1).

 

Таблица 1. Информация об образцах, использованных в филогенетическом анализе для идентификации микроводорослей рода Thalassiosira по маркёру 18S

№	Вид	Название образца	Номер доступа в ГенБанке	Место сбора материала
1	Skeletonema grethae	–	AY684949	Тихий океан
2	S. costatum	CCAP1077/3	AY684941	–
3	Conticriba weissflogii	L1296	DQ514889	–
4	C. weissflogii	CCMP1010	DQ514879	Гольфстрим, Атлантический океан
5	C. guillardii	CCMP988	DQ514875	Северная Атлантика
6	C. guillardii	CC03-04	DQ514869	Клэм-Крик, Джорджия, США
7	Thalassiosira pseudonana	CCMP1335	AY485452	–
8	T. profunda	–	AM235383	–
9	T. curviseriata	–	AJ810859	–
10	T. minima	RCC2265	JN934676	Северный Ледовитый океан
11	T. minima	CCMP990	DQ514876	–
12	T. concaviuscula	–	AJ810857	–
13	T. nordenskioeldii	CCMP 997	DQ093365	–
14	T. nordenskioeldii	FB02-19	DQ514886	Залив Сан-Франциско, Калифорния, США
15	T. tumida	CCMP1469	DQ514883	Мак-Мердо, Южный океан
16	T. tumida	CCMP 1465	DQ093368	–
17	T. tumida	LA09-20	DQ514890	Пролив Дрейка, Южный океан
18	T. minuscula	CCMP1093	DQ514882	Тихий океан, Ла Джолла, Калифорния, США
19	T. minuscula	FB02-31	DQ514887	Зал. Сан-Франциско, Калифорния, США
20	T. tealata	ThZh031120-2	OR735490	Б. Житкова, о-в Русский, Японское море

 

Конечная матрица для анализа состояла из 20 последовательностей от девяти видов Thalassiosira (включая одну последовательность, полученную в данной работе), двух видов Conticribra, а также Skeletonema costatum (Greville) Cleve, 1873 и S. grethae Zingone, Sarno, 2005 в качестве внешней группы. Выравнивание нуклеотидных последовательностей и метод подбора оптимальной модели нуклеотидных замещений описаны в работе Шевченко с соавторами (Shevchenko et al., 2019). Длина матрицы после выравнивания составила 1716 п.о., длина полученной последовательности ‒ 374 п.о.

Реконструкция филогенетических деревьев по методам MP, ML и NJ была выполнена в программной среде R 4.3.1 (R Core Team, 2023) с набором соответствующих функций (Shevchenko et al., 2019). Реконструкция деревьев по методу BI была выполнена в программе MrBayes 3.2.7a (Ronquist et al., 2012) на основе 1 000 000 поколений с двумя запусками четырех параллельных цепей Маркова с частотой выборки 1 на 100 поколений. Топология BI была принята как основная ввиду наиболее полного разрешения узлов.

Средние внутривидовые и межвидовые генетические расстояния с учетом коррекции по модели нуклеотидных замещений HKY+G были рассчитаны в программе MEGA X (Tamura et al., 2013).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение полевого материала и клеток штамма ThZh031120-2 с помощью СЭМ позволило идентифицировать и составить детальное таксономическое описание нового для флоры морей России вида T. tealata.

Отдел BACILLARIOPHYTA

Класс MEDIOPHYCEAE

Порядок THALASSIOSIRALES

Семейство Thalassiosiraceae

Thalassiosira tealata Takano, 1980

СМ

Клетки в культуре образуют короткие цепочки, соединенные одним тонким тяжом, иногда одиночные (рис. 1а).

 

Рис. 1. Thalassiosira tealata. a – клетки объединены в цепочки (стрелкой указан тяж); б – общий вид створки (короткой стрелкой указан центральный вырост с опорами, белой стрелкой указан краевой вырост с опорами, черной стрелкой – двугубый вырост); в – краевой вырост с опорами; г – внутренняя часть створки (короткой стрелкой указан центральный вырост с опорами, окруженный тремя сателлитными порами; белой стрелкой указан краевой вырост с опорами, окруженный четырьмя сателлитными порами; черной стрелкой – двугубый вырост); д – часть створки, показывающая крибрум; е – поясковая зона, в – вальвокопула, к – копула, П1 и П2 – плевры; а – СМ, б–е – СЭМ. Масштаб: а – 20 мкм, б, в, д, е – 1 мкм, г – 2 мкм.

 

Панцирь цилиндрический, с пояска с закругленными углами, высотой 3–9 мкм (n = 50). Створки слегка выпуклые, с углублением в центре, 4.8–12 мкм в диаметре (n = 56).

СЭМ

На створке ареолы расположены в радиальных рядах, 33–40 в 10 мкм (n = 35). Близ края створки ареолы переходят в тангенциальные ряды. Форамены ареол от округлых до вытянутых (рис. 1б). В центре створки, рядом с центральной ареолой, размер которой в 1.5–2 раза больше, чем остальных ареол, один центральный вырост с опорами, наружная часть его в виде короткой трубки (рис. 1б) (n = 35). На границе с загибом створки кольцо равномерно расположенных краевых выростов с опорами, 4–5 в 10 мкм (4–12 на створке) (n = 35). Выросты в виде цилиндрических полых трубок, оканчивающихся на вершине двумя противоположно направленными крыловидными отростками, расположенными параллельно краю створки, утончающиеся кончики которых загибаются к наружной поверхности створки (рис. 1б, 1в). Ближе к центру от кольца краевых выростов с опорами, вблизи одного из них, находится двугубый вырост. Наружная трубка его немного (в 1.3–1.5 раза) тоньше краевых выростов с опорами (рис. 1) (n = 35). Загиб створки высокий, со структурой из 1–2 рядов вытянутых ареол, продолжающихся со створки, и гиалиновым полем. На внутренней поверхности створки центральный вырост с опорами в виде короткой трубки, окруженной тремя сателлитными порами; трубки краевых выростов с опорами короткие, с 4 сателлитными порами; двугубый вырост в виде щели, направленной радиально (рис. 1г) (n = 35). Крибрум занимает центральную часть ареолы, с 20–22 крибральными порами в 1 мкм, расположенными в прямых и косо пересекающихся рядах (рис. 1). Цингулюм (поясковый ободок) состоит из открытых лигулятных элементов и включает вальвокопулу с тремя рядами округлых пор, 55–58 в 10 мкм; копулу с одним рядом более мелких пор, 75–77 в 10 мкм, и бесструктурные плевры (рис. 1е) (n = 35).

Распространение

Тихий океан: Внутреннее Японское море (Takano, 1980), зал. Калифорния (Hernández-Becerril, Tapia Peña, 1995), зал. Теуантепек (Aké-Castillo et al., 1999), прибрежные воды Кореи (Park et al., 2016), Южно-Китайское и Восточно-Китайское моря (Li et al., 2013, 2014). Атлантический океан: Северное море (Hoppenrath et al., 2007), зал. Шалёр (Bérard-Therriault et al., 1987). Встречается также в оз. Креран (Великобритания) (Harris et al., 1995). В бухтах Парис и Житкова вид редко был отмечен в июле и сентябре–ноябре (t_воды = 9–18 ˚С, S = 32‰).

При построении филогенетического дерева на основе топологии B1 рассматриваемые последовательности сформировали две филогруппы (рис. 2): первая филогруппа включает в себя вид T. pseudonana Hasle et Heimdal, 1970 (который занимает базальное положение), а также представителей рода Conticribra, формирующих две монофилетические клады с высокими поддержками; вторая филогруппа объединяет остальные виды рода Thalassiosira.

 

Рис. 2. Укорененное BI-дерево, показывающее филогенетические отношения между видами рода Thalassiosira. Реконструкция дерева основана на последовательностях 18S рДНК с использованием алгоритмов BI, NJ, MP и ML. Значения в узлах представлены процентной оценкой устойчивости топологии из 1000 повторений непараметрического бутстреп-теста соответственно для NJ, MP, ML и процентными значениями апостериорных вероятностей узлов для BI. Цифрами I и II отмечены две филогруппы.

 

Данное разделение имеет высокие поддержки по методам построения BI, MP, ML; по методу NJ разделение не поддержано.

Во второй филогруппе (рис. 2) в базальном положении находится группа из последовательностей AJ810857.1 T. concaviuscula Makarova, 1978 и DQ093365.1 T. nordenskioeldii Cleve, 1873 (поддержка по методу MP менее 50%), при этом другая последовательность DQ514886.1 T. nordenskioeldii располагается в монофилетической кладе вида T. minima Gaarder, 1951 (поддержка по методу NJ менее 50%). Таким образом, последовательности T. nordenskioeldii не формируют общую кладу, из-за чего у данного вида на нашем филогенетическом дереве прослеживается парафилия. Виды T. tumida (Janisch) Hasle, 1971 и T. minuscula Krasske, 1941 формируют отдельные монофилетические клады, в основном, с высокими поддержками (поддержка T. tumida по методу NJ менее 50%). Полученная в настоящем исследовании последовательность T. tealata находится в хорошо поддержанной группе с видами T. profunda (Hendey) Hasle, 1973 и T. curviseriata Takano, 1983. Ветви видов в данной группе формируются из одного узла, что является политомией.

Анализ генетических расстояний показал, что среднее межвидовое расстояние рода Thalassiosira, Conticribra и Skeletonema составило 0.041 ± 0.017 (табл. 2).

 

Таблица 2. Генетические расстояния видов рода Thalassiosira, двух видов Conticribra и двух видов Skeletonema по генетическому маркёру 18S, скорректированные по модели HKY+G

№	Виды	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	Thalassiosira tealata	н/р
2	T. profunda	0.028	н/р
3	T. curviseriata	0.028	0.002	н/р
4	T. minima	0.038	0.016	0.016	0
5	T. concaviuscula	0.041	0.025	0.026	0.021	н/р
6	T. nordenskioeldii	0.051	0.021	0.021	0.013	0.023	0.03
7	T. minuscula	0.054	0.016	0.016	0.018	0.024	0.022	0
8	T. tumida	0.066	0.025	0.026	0.026	0.025	0.028	0.018	0
9	Conticribra guillardii	0.07	0.044	0.044	0.042	0.043	0.043	0.039	0.04	0
10	C. weissflogii	0.074	0.046	0.046	0.042	0.044	0.044	0.041	0.038	0.02	0
11	Thalassiosira pseudonana	0.074	0.052	0.053	0.05	0.047	0.051	0.047	0.052	0.04	0.044	н/р
12	Skeletonema grethae	0.066	0.047	0.048	0.042	0.05	0.049	0.05	0.052	0.054	0.048	0.062	н/р
13	S. costatum	0.074	0.052	0.053	0.047	0.055	0.055	0.055	0.058	0.059	0.053	0.067	0.004	н/р

Примечание. По диагонали даны значения внутри групп, по вертикали – значения между группами. Н/р – не рассчитано.

 

Межвидовое генетическое расстояние между T. tealata и T. profunda, а также между T. tealata и T. curviseriata было одинаковым и составило 0.028.

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ оригинальных данных показал, что морфологические признаки исследованных нами клеток Thalassiosira соответствуют первоописанию вида T. tealata и согласуются с данными других исследователей (Takano, 1980; Bérard-Therriault et al., 1987; Park et al., 2016). Морфологически T. tealata сходен с T. curviseriata по наличию крыловидных отростков у краевых выростов с опорами. Однако они имеют ряд морфологических отличий. У T. curviseriata крыловидные отростки вытянуты вверх, отходят из середины выроста с опорами и часто расходятся на 2–3 ветви (Takano, 1981). У T. tealata крыловидные отростки отходят от концов краевых выростов с опорами, их тонкие кончики упираются в поверхность створки (Takano, 1980) (рис. 1). Для T. curviseriata характерно наличие 1–2 центральных выростов с опорами, смещенных от центра створки, тогда как у T. tealata отмечено наличие одного центрального выроста с опорами. Также различается количество ареол в 10 мкм: у T. tealata их 30–40, у T. curviseriata – до 30 (Hoppenrath et al., 2007; Li et al., 2013).

Проведенный молекулярно-генетический анализ по маркёру 18S показал отличия полученной последовательности от остальных последовательностей рода Thalassiosira, привлеченных из ГенБанка. Положение видов, привлеченные из литературных данных, на нашем филогенетическом дереве было идентично положению этих же видов на филогенетических деревьях других авторов (Kaczmarska et al., 2006; Alverson et al., 2007; Hoppenrath et al., 2007; Balzano et al, 2016; Li et al., 2018).

Выделенная нами культура вида T. tealata по морфологическим и филогенетическим параметрам наиболее близка к видам T. curviseriata и T. profunda. В литературе уже отмечали сходство строения T. tealata и T. curviseriata (Hoppenrath et al., 2007), из-за чего авторы описали их как видовую группу T. tealata/T. curviseriata, но добавили, что более сложные молекулярно-генетические методы, например флуоресцентные микрочипы ДНК (Metfies, Medlin, 2004), помогут в работе с этими таксонами. Тем не менее мы можем говорить, что T. tealata отличается от упомянутых выше видов по тем же значениям дивергенции (> 0.02) и характеру ветвления на филогенетическом дереве. К сожалению, наша филогенетическая реконструкция была сильно ограничена из-за недостатка таксономических данных в ГенБанке.

Таким образом, для будущей работы с T. tealata необходимы молекулярно-генетические методы. Для более точных результатов стоит обратить внимание на другие молекулярные маркёры или более сложные методы, такие как отмеченные выше флуоресцентные микрочипы или зонды ДНК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа частично выполнена в Центре коллективного пользования “Приморский океанариум” ННЦМБ ДВО РАН (г. Владивосток).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Национального научного центра морской биологии ДВО РАН. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

M. A. Shulgina

Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: annekee@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4744-9230
Russian Federation, Vladivostok, 690041

D. I. Kachur

Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: annekee@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-9612-2391
Russian Federation, Vladivostok, 690041

References

Supplementary files