Том 65, № 4 (2023)

Гибридизация ДНК in situ (in situ hybridization, ISH) – широко используемый метод молекулярной цитогенетики, который позволяет локализовать конкретные последовательности ДНК в определенных участках хромосом. Для реализации гибридизации ДНК in situ необходимо использование ДНК-зондов, которые могут быть коммерческими (серийными), а также несерийными, т.е. могут быть разработаны под конкретные задачи исследования (homemade). Одним из существенных недостатков последних является низкая интенсивность гибридизационного сигнала, когда ДНК-зонд имеет небольшие размеры. Поэтому разработка подходов, направленных на получение оптимального соотношения шум/сигнал при использовании таких несерийных ДНК-зондов, является актуальной задачей современной молекулярной цитогенетики. Методом, позволяющим визуализировать небольшие последовательности ДНК непосредственно на хромосоме, является тирамидная амплификация сигнала (tyramide signal amplification, TSA). В основе системы TSA лежит образование ковалентной связи между богатыми электронами фрагментами белков образца и молекулами тирамида, связанными с гаптеном (при хромогенной ISH) или флуорофором (при флуоресцентной ISH). Это реализуется за счет превращения молекул тирамида в свободнорадикальные промежуточные соединения под действием пероксидазы хрена (HRP), а затем отложения осажденных молекул вблизи нее. В результате наблюдается усиление сигнала малой интенсивности. Таким образом, TSA является хорошим дополнением метода гибридизации ДНК in situ благодаря своей высокой чувствительности и возможности детекции небольших геномных дисбалансов и, соответственно, может стать ценным инструментом для диагностики хромосомных перестроек в клинической практике.

Расшифровка механизмов развития нейродегенерации на досимптоматической стадии – актуальная задача, решение которой позволит оптимизировать методы ранней диагностики и профилактики болезни Альцгеймера (БА). В настоящей работе изучены особенности нейрогенеза в нейрогенных нишах головного мозга при экспериментальной БА на досимптоматической стадии нейродегенерации. Было осуществлено моделирование БА in vivo у экспериментальных животных (мышей-самцов, C57BL/6 в возрасте 8 мес.). Для этого контрольной группе (n = 30) в поле СА1 гиппокампа вводили по 2 мкл раствора 0.9%-ного NaCl, а экспериментальной группе, (n = 30) – 1М раствор (2 мкл билатерально) олигомеризованного бета-амилоида 25–35 (Аβ25–35). Оценку нарушений когнитивных функций у животных осуществляли с использованием теста условной реакции пассивного избегания (УРПИ). Для иммуногистохимического исследования использовали замороженные срезы головного мозга, в которых анализировали изменения экспрессии маркеров Nestin, Pax6, NeuroD1, VEGFR2; апоптоз клеток оценивали по протоколу TUNEL в субгранулярной зоне гиппокампа (SGZ) и субвентрикулярной зоне (SVZ). Были установлены разнонаправленные изменения экспрессии маркеров нейрогенеза, неоангиогенеза и выраженность апоптоза в SGZ и SVZ в период 9–17 сут после интрагиппокампального введения Аβ25–35. На 9-е сут развития нейродегенерации альцгеймеровского типа была увеличена экспрессия Pax6 и VEGFR2 в SGZ и Nestin в SVZ. Последующее применение протокола УРПИ с предъявлением аверсивного раздражителя (10-е сут) или соответствующего контекста (11- и 17-е сут) приводило к динамическим изменениям экспрессии маркеров клеток, находящихся на разных стадиях нейрогенеза. Таким образом, на досимптоматической стадии развития нейродегенерации альцгеймеровского типа зоны SGZ и SVZ проявляют признаки аберрантного нейрогенеза, связанного с нарушением пула стволовых и прогениторных клеток и подавлением производства нейробластов (незрелых нейронов) в период, предшествующий формированию когнитивной дисфункции.

Сведения о влиянии криоконсервации на клеточные функции и генетический аппарат клеток разного генеза неоднозначны и находятся в стадии накопления. Настоящая работа направлена на изучение влияния длительного пребывания (7 лет) в замороженном состоянии эндометриальных мезенхимных стволовых клеток человека (эМСК) на стабильность их генома in vitro. Результаты показали дестабилизацию структуры кариотипа у потомков клеток после их размораживания, а именно анеуполиплоидизацию хромосомного набора, повышенную ломкость хромосом, влекущую за собой огромный пул аберрантных хромосом, и нарушение конденсации в гомологах. Хромосомные поломки, затрагивающие прицентромерные области, в ряде случаев сопровождались сохранением генетического материала в виде самостоятельных хромосом. В процесс дестабилизации клеточного генома эМСК были вовлечены почти все хромосомы набора. Показано, что процедура многолетней криоконсервации может стать индуктором преждевременного клеточного старения эМСК после их размораживания. Сравнение полученных данных с результатами кариотипирования трансформированных клеток китайского хомячка, претерпевших аналогичную процедуру, позволило заключить, что криоконсервация для биологических систем может являться стрессом, индуцирующим разнотипные генетические дефекты на уровне кариотипа. Реакция генома клеток различного происхождения на одни и те же условия криоконсервации может различаться.

В работе изучали способность трех модельных зеленых белков ковалентно связываться с микрочастицами (МЧ) на основе поли(D,L-молочной кислоты) (ПМК). Зеленый флуоресцентный белок (sfGFP), рекомбинантный белок слияния бета2-микроглобулина человека (β2M) с sfGFP (β2M-sfGFP), а также рекомбинантный белок слияния амилина человека (IAPP) с sfGFP (IAPP-sfGFP) выделяли методом аффинной хроматографии. Для формирования МЧ-ПМК использовали метод двойной эмульсии. Модификацию МЧ-ПМК белком подтверждали при помощи лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ). Кроме того, при помощи ЛСМ исследовали фагоцитоз МЧ-ПМК, модифицированных различными белками, и свободных модельных белков макрофагами. Было показано, что рекомбинантный sfGFP связывается с поверхностью частиц в меньших количествах по сравнению с β2M-sfGFP и IAPP-sfGFP. По-видимому, это обусловлено тем, что аминогруппы белка, которые потенциально могли бы вступить в реакцию с активированными карбоксильными группами на поверхности частиц, оказываются стерически недоступными для этой реакции из-за структуры sfGFP. Белки β2M и IAPP в составе соответствующих рекомбинантных белков слияния являются спейсерными структурами между поверхностью сферических частиц и sfGFP. Установлено, что увеличение соотношения белок : частицы в три раза не приводило к повышению количества связанного белка на единицу массы частиц, что может свидетельствовать о том, что количество белка, которое может быть связано на единицу массы частиц, ограничивается емкостью самих частиц. Изучение фагоцитоза модифицированных белками МЧ-ПМК показало, что МЧ-ПМК, содержащие на поверхности модельные белки (β2M-sfGFP и IAPP-sfGFP), успешно фагоцитируются макрофагами и, таким образом, могут способствовать активации клеточного иммунного ответа, что важно при борьбе с различными инфекциями, в том числе вирусными. Кроме того, в работе был показан фагоцитоз модельных белков (β2M-sfGFP, IAPP-sfGFP). Это может быть связано с тем, что как β2M, так и IAPP являются амилоидогенными и склонными к агрегации белками. По всей видимости, агрегаты этих белков тоже способны поглощаться макрофагами благодаря увеличению размера по сравнению с их мономерными формами.

Цель исследования заключалась в анализе особенностей морфологии и морфометрических параметров эозинофилов и их гранул у енотовидных собак Nyctereutes procyonoides (Grey, 1834). На мазках крови, окрашенных по Паппенгейму, определяли состав лейкоцитарной формулы, оценивали особенности морфологии и морфометрические параметры эозинофилов и их гранул. Цитохимическими методами выявляли локализацию катионных белков, а также эозинофильной пероксидазы в эозинофилах. Для оценки влияния пола применяли ANOVA. В результате исследования установлено, что для енотовидных собак характерно высокое относительное содержание эозинофилов (7–10% от общей популяции лейкоцитов), а также наличие в них крупных секреторных гранул. На мазках крови, наряду с эозинофилами с типичной богатой зернистостью цитоплазмы, присутствовали более крупные клетки, содержавшие секреторные гранулы в небольшом количестве, а также в некоторых случаях вакуолеподобные гранулы. Влияние пола выразилось в более высокой доле эозинофилов с низким уровнем зернистости цитоплазмы у самцов по сравнению с самками, тогда как у самок обнаружены более высокие значения морфометрических показателей (числа и средней площади гранул в одной клетке, а также соотношения площади, занимаемой гранулами, к площади клетки). Поскольку причины появления эозинофилов с низким содержанием гранул, а также с вакуолизацией цитоплазмы у енотовидных собак не до конца ясны, существует необходимость в дальнейших исследованиях этого вопроса.

V. E. Yurinskaya, I. I. Marakhova, I. A. Gamaley, A. A. Rubashkin, A. V. Moshkov, A. N. Tomilin