Synthesis and Antimicrobial Activity of Thiosulfinates, Allicin Analogues

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Полимикробные инфекции, вызываемые сочетаниями бактерий, вирусов и грибов, все чаще усугубляют тяжесть течения заболеваний и ухудшают прогнозы выздоровления пациентов. Многие из этих полимикробных взаимодействий происходят внутри биопленок, которые образуются на естественных или искусственных поверхностях (имплантированных медицинских устройствах) и внутри организма человека [1] и ответственны за ~80% микробных инфекций у людей [2]. По сравнению с одновидовыми биопленками полимикробные часто обеспечивают специфические преимущества для каждого вида патогена [3]. Появление метициллинрезистентного золотистого стафилококка (methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA) и его способность к образованию биопленки стали серьезной проблемой здравоохранения в последние десятилетия [4, 5]. В организме хозяина бактерии S. aureus сосуществуют с различными патогенами, включая дрожжеподобные грибы Candida albicans [6]. Бактерия S. aureus признана третьим по частоте видом, изолируемым совместно с C. albicans при многих заболеваниях, таких как пародонтит, стоматит, муковисцидоз, кератит, ассоциированная с искусственной вентиляцией легких пневмония, а также инфекции мочевыводящих путей и ожоговых ран [7]. Растущее использование имплантированных медицинских устройств – еще одна причина неуклонного роста частоты кандидозной и стафилококковой инфекций. Эти патогены эффективно формируют полимикробные биопленкие на медицинских имплантатах [8]. Взаимодействие S. aureus и C. albicans сопровождается синергетическим эффектом в формировании биопленок и способствует возникновению антибиотикорезистентности у S. aureus [9]. Существующие противогрибковые и антибактериальные препараты в концентрациях, эффективных против планктонных клеток C. albicans и S. aureus, далеко не всегда “работают” против этих клеток в биопленках [10]. Увеличение терапевтических доз может иметь положительный эффект, но часто вызывает серьезные побочные эффекты (повреждение почек или печени), поэтому поиск новых противомикробных препаратов продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины.

Диаллилтиосульфинат (аллицин) образуется в растениях рода Allium в результате реакции β-элиминирования сульфоксида S-аллил-L-цистеина (аллиина), катализируемой пиридоксаль-5'-фосфатзависимым ферментом аллииназой (КФ 4.4.1.4), и обладает антимикробным действием, в том числе по отношению к MRSA [11, 12]. Противомикробный эффект аллицина обусловлен его способностью быстро реагировать с серосодержащими белками клетки благодаря присутствию в его структуре тиосульфинатной группы [13]. В отличие от большинства антибиотиков, применяемых в клинике, мишенью аллицина в клетке не является конкретный белок, поэтому развитие резистентности к нему маловероятно. Диалкилтиосульфинаты – аналоги аллицина с насыщенной углеводородной боковой цепью (диметилтиосульфинат, диэтилтиосульфинат, дипропилтиосульфинат) – более стабильны по сравнению с аллицином [14] и проявляют аналогичный механизм антимикробного действия [15]. В связи с тем, что диалкилтиосульфинаты проявляют как антибактериальную, так и противогрибковую активность [14, 16, 17], получение новых синтетических производных сульфинатов и изучение их противомикробных свойств – важное направление в разработке средств для борьбы с полимикробными биопленками.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы. Диметилдисульфид, диэтилдисульфид, дипропилдисульфид, трифторэтанол, трихлорэтанол, мета-хлорпербензойная кислота (m-CBPA, >77%) и H₂O₂ (30%-ный водный раствор) были приобретены у “Sigma-Aldrich” (США). Сульфат натрия, гидрокарбонат натрия, оксид фосфора, уксусная кислота, серная кислота, метанол, хлористый метилен, дитиодипропионовая кислота, н-гексан, этилацетат были приобретены в компании “РусХим” (Россия). Все вышеперечисленные реактивы имели чистоту не менее 98% и использованы в реакциях без дополнительной очистки. Среда RPMI-1640, 3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота (MOPS, > 99.5%) приобретены в компании “ПанЭко” (Россия). Агар и бульон Мюллера‒Хинтон – производства “HiMedia” (Индия); YPD-агар и вторичный фармацевтический стандарт флуконазола приобретены у “Sigma-Aldrich”; ванкомицин из Amycolatopsis orientalis – аптечный препарат (“Синтез”, Россия). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) выполняли на пластинках TLC Silica Gel 60 F254 (“Merck”, Германия).

Спектральный анализ. ¹H и ¹³С (с подавлением C–H взаимодействия) ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре Bruker Avance III (“Bruker BioSpin GmbH”, Германия) с частотой 300 МГц для 1H и 75.5 МГц для 13C ядер в ДМСО-d₆, если не указано иное. Химические сдвиги указаны относительно остаточного сигнала для ДМСО-d₆: δ 2.50 м. д. для ¹H ЯМР и 39.52 м. д. для ¹³С ЯМР – в качестве внутреннего стандарта; константы спин-спинового взаимодействия (J) указаны в герцах (Гц). Дополнительно для продукта 2h регистрировали ¹⁹F и ¹³C (с подавлением C–H взаимодействия) ЯМР-спектры на спектрометре Q. One AS600 (“Q. One Americas”, США) с частотой 150.7 МГц для ¹³С-ядер и 563.9 МГц для ¹⁹F-ядер в ДМСО-d₆.

ИК-спектры регистрировали на спектрометре Bruker ALPHA (“Bruker BioSpin GmbH”) в тонком слое между пластинами KBr, в области 4 000‒400 см^‒1 (16 сканов, разрешение 2 см^‒1).

Оптическую плотность культур микроорганизмов измеряли на спектрофотометре Varian Cary-50 (“Varian”, США) и микропланшетном фотометре iMark (“Bio-Rad”, США).

Клеточные культуры. Штаммы C. albicans ATCC10231 и S. aureus ATCC29213 и ATCC43300 (устойчивый к метициллину) были получены из американской коллекции типовых культур (“ATCC”, США). Субкультивирование и приготовление инокулятов проводили в соответствии с рекомендованными Институтом клинических и лабораторных стандартов (Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI) методами M27-A3 (для культур грибов) и M7-A11 (для бактериальных культур) при температуре инкубации 35°C и 37°C соответственно [18, 19]. Стоковые концентрации клеток C. albicans и S. aureus составляли 1 × 10⁶ и 1 × 10⁸ клеток/мл соответственно. Рабочую суспензию C. albicans (5.0 × 10² клеток/мл) готовили путем двухступенчатого разведения стоковой концентрации средой RPMI-1640. Рабочую суспензию S. aureus (1.0 × 10⁶ клеток/мл) готовили разведением стоковой концентрации средой Мюллера‒Хинтон.

Синтез эфиров 3,3'-дитиодипропионовой кислоты. Диметиловый эфир дитиодипропионовой кислоты (соединение 1g). Раствор дитиодипропионовой кислоты (500 мг, 2.38 ммоль) в 15 мл метанола и 100 мкл серной кислоты кипятили в течение 48 ч. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе гексан‒этилацетат (4 : 1). По окончании реакции в смесь вносили насыщенный раствор гидрокарбоната натрия до рН 8.0 и упаривали. Остаток растворяли в смеси вода‒этилацетат и экстрагировали этилацетатом (3 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость с желтоватым оттенком. Выход составил 468 мг (78%). ¹H ЯМР (δ): 3.62 (6H, с, CH₃OOC), 2.92 (4H, т, J = 6.9 Гц, CH₂COOMe), 2.72 (4H, т, J = 6.6 Гц, CH₂S).

Ди-(2,2,2-трифторэтил)овый эфир дитиодипропионовой кислоты (соединение 1h). Раствор дитиодипропионовой кислоты (400 мг, 1.90 ммоль) в 15 мл трифторэтанола и 100 мкл серной кислоты кипятили в течение 72 ч. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе хлористый метилен‒метанол‒уксусная кислота (30 : 1 : 0.1). После окончания реакции к смеси добавляли водный раствор аммиака до рН 8.0. Получившийся остаток экстрагировали этилацетатом (3 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость с желтоватым оттенком. Выход – 153 мг (21%). ¹H ЯМР (δ) : 4.77 (4H, кв, J = 9.1 Гц, CF₃CH₂OOC), 2.98–2.84 (8H, м, CH₂).

Ди-(2,2,2-трихлорэтил)овый эфир дитиодипропионовой кислоты (соединение 1i). Раствор дитиодипропионовой кислоты (250 мг, 1.90 ммоль) в 5 мл трихлорэтанола и 50 мкл серной кислоты перемешивали при 140°C в течение 10 сут. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе хлористый метилен‒метанол‒уксусная кислота (30 : 1 : 0.1). Растворитель упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали 0.1 М раствором NaOH (20 мл) и 0.1 М раствором соляной кислоты (2 × 20 мл). Органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали от растворителей на ротационном испарителе. Продукт представлял из себя прозрачное масло. Выход – 495 мг (88%). ¹H ЯМР (δ, CDCl₃) : 4.79 (4H, c, CCl₃CH₂OOC), 3.05–2.90 (8H, м, CH₂).

Синтез диалк(ен)илтиосульфинатов. Диметилтиосульфинат (DMTS; соединение 2a). К эмульсии диметилдисульфида (1 г, 10.6 ммоль) в 40 мл воды добавляли 30%-ный раствор перекиси водорода (1.08 мл, 10.6 ммоль) и перемешивали в течение 1 мес. до получения полностью гомогенного раствора. Реакционную массу экстрагировали хлористым метиленом (2 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость. Выход – 1.15 г (98%). ¹H ЯМР (δ, D₂O) : 3.03 (3Н, с), 2.65 (3Н, с).

Диэтилтиосульфинат (DETS; соединение 2b). К раствору диэтилдисульфида (1 г, 8.18 ммоль) в 10 мл муравьиной кислоты при 0°C медленно, по каплям добавляли 30%-ный раствор перекиси водорода (0.835 мл, 8.18 ммоль) в течение 20 мин и перемешивали 1.5 ч при 0°C. Далее реакционную массу экстрагировали хлористым метиленом (2 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт очищали методом колоночной хроматографии в системе н-гексан–этилацетат (8 : 1), целевые фракции упаривали от растворителей. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость. Выход – 0.735 г (65%). ¹H ЯМР (δ, CDCl₃) : 3.34 (2H, кв, J = 7.4 Гц, CH₂S(O)), 3.17 (2H, кв, J = 7.4 Гц, CH₂S), 1.48 (3H, т, J = 7.4 Гц, CH₃), 1.44 (3H, т, J = 7.4 Гц, CH₃).

Дипропилтиосульфинат (DPTS; соединение 2c). К раствору дипропилдисульфида (1 г, 6.65 ммоль) в 10 мл муравьиной кислоты при 0°C медленно, по каплям добавляли 30%-ный раствор перекиси водорода (0.679 мл, 6.65 ммоль) в течение 20 мин и перемешивали 4 ч при 0°C. Реакционную массу экстрагировали хлористым метиленом (2 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт очищали методом колоночной хроматографии в системе н-гексан–этилацетат (8 : 1), целевые фракции упаривали от растворителей. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость с желтоватым оттенком. Выход – 0.631 г (57%). ¹H ЯМР (δ) : 3.17–3.07 (4H, м, CH₂S), 1.81–1.67 (4H, м, CH₂CH₃), 1.44 (3H, т, J = 7.3 Гц, CH₃), 1.02 (3H, т, J = 7.4 Гц, CH₃).

Диаллилтиосульфинат (аллицин, DATS; соединение 2d). К раствору свежеперегнанного диаллилдисульфида (1 г, 6.84 ммоль) в 10 мл муравьиной кислоты при 0°C медленно, по каплям вносили 30%-ный водный раствор перекиси водорода (0.680 мл, 6.84 ммоль) в течение 20 мин и перемешивали 4 ч при 0°C. Реакционную массу экстрагировали хлористым метиленом (2 × 20 мл). Объединенную органическую фазу высушивали над сульфатом натрия и упаривали на ротационном испарителе. Продукт очищали методом колоночной хроматографии в системе н-гексан–этилацетат (10 : 1), целевые фракции упаривали от растворителей. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость с желтоватым оттенком. Выход – 0.632 г (53%). ¹H ЯМР (δ, CDCl₃) : 5.89–5.66 (2H, м), 5.45–5.15 (4H, м), 3.79–3.67 (4H, м).

Синтез диарилтиосульфината. 2,2'-[(тио)сульфинил]-бис-(пиридин-1-оксид) (соединение 2e). К раствору 2,2'-дитиодипиридина (100 мг, 0.454 ммоль) в 10 мл CH₂Cl₂ при –78°C по каплям вносили раствор m-CPBA (763 мг, 1.362 ммоль) в 15 мл CH₂Cl₂ в течение 20 мин, смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и далее при 40°C в течение 170 ч. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе гексан–этилацетат (4 : 1). К реакционной смеси добавляли 30 мл этилацетата, выпавший осадок отфильтровывали, промывали этилацетатом (2 × 10 мл) и высушивали над оксидом фосфора. Продукт представлял собой белый аморфный порошок. Выход – 26 мг (21%). ИК-спектр (см^–1): 3 200 –2 600 (уш., ср., ν С_{гетаром.} – Н), 1 617, 1 599, 1 521, 1 458 (ср., ν C_{гетаром.} = С_{гетаром.}) 1 268, 1 245, 1 207 (в., ν C–N), 1 149, 1 040 (с., ν S–S=O), 769, 730 (ср., ν C–S=O), 672 см^–1 (сл., ν C-S). ¹H ЯМР (δ): 8.7 (2H, д, J = 5.1 Гц, N-CH), 8.51 (1H, дд, J = 1.5 Гц, J = 7.8 Гц, Ar-H), 8.50 (1H, дд, J = 1.5 Гц, J = 7.8 Гц, Ar-H), 8.15 (2H, д, J = 7.9 Гц, N-CH), 7.96–7.91 (2H, м, Ar-H). ¹³C ЯМР (δ): 157.64, 146.74, 143.16, 127.51, 123.95.

Синтез тиосульфинатных производных диалкилдикарбоксилатов. 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовая кислота (соединение 2f). К суспензии 3,3' -дитиодипропионовой кислоты (250 мг, 1.19 ммоль) в 10 мл CH₂Cl₂ при –78°C по каплям вводили раствор m-CPBA (267 мг, 1.19 ммоль) в 15 мл CH₂Cl₂ в течение 20 мин, смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе хлористый метилен–метанол– уксусная кислота (30 : 1 : 0.1). Растворители упаривали на ротационном испарителе, остаток еще раз упаривали с этанолом и высушивали в вакууме. Продукт очищали методом колоночной хроматографии в системе хлористый метилен–метанол‒уксусная кислота (50 : 1 : 0.1), целевые фракции упаривали от растворителей. Продукт представлял собой белый порошок. Выход – 86 мг (32%). ИК-спектр (см^–1): 3 550‒2 500 (уш., ν СОO–H), 1 699 (с., ν С=O), 1 432 (ср., δ_as C–H), 1 410, 1 315, 1 247, 1 166, 1 049 (ср., ν S–S=O), 720 (ср., ν C–S=O), 655 (сл., ν C-S). ¹H ЯМР (δ) : 3.79 (2H, т, J = 7.1 Гц, CH₂COOH), 3.29 (2H, т, J = 6.8 Гц, CH₂COOH), 2.75 (2H, т, J = 6.8 Гц, CH₂S(O)), 2.72 (2H, т, J = 7.1 Гц, CH₂S). ¹³C ЯМР (δ): 172.90, 171.53, 56.81, 34.42, 31.30, 28.95.

Диметиловый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (соединение 2g). К раствору диметилдитиодипропионата (455 мг, 1.91 ммоль) в 10 мл CH₂Cl₂ при –78°C по каплям добавляли раствор m-CPBA (427 мг, 1.91 ммоль) в 15 мл CH₂Cl₂ в течение 20 мин, смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Протекание реакции контролировали с помощью ТСХ в системе гексан‒этилацетат (4 : 1). Через 170 ч растворитель упаривали, продукт очищали методом флеш-хроматографии в градиенте гексан–этилацетат (5 : 1) → этилацетат. Продукт представлял собой прозрачную вязкую жидкость с желтоватым оттенком. Выход – 68 мг (14%). ИК-спектр (см^–1) : 2 999 (уш., сл., ν С–H (CH₂)), 2 955 (ср., ν С–H (CH₃)), 1 737 (с., ν С=O), 1 438 (ср., δ_as C–H), 1 418, 1 362, 1 227‒1 178 (уш., с., ν С–O), 1 049 (с., ν S–S=O), 672 (сл., ν C–S). ¹H ЯМР (δ): 3.64 (3H, с, CH3OOC), 3.63 (3H, с, CH₃OOC), 3.50‒3.30 (4H, м, CH₂COOMe), 2.83–2.77 (4H, м, CH₂S). ¹³C ЯМР (δ) : 171.80, 171.70, 52.31, 52.07, 50.60, 35.61, 27.80, 27.68.

Ди-(2,2,2-трифторэтил)овый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (соединение 2h). К раствору ди-(2,2,2-трифторэтил)-3,3'-дитиодипропионата (153 мг, 0.41 ммоль) в CH₂Cl₂ при –78°C по каплям добавляли раствор m-CPBA (92 мг, 0.41 ммоль) в 15 мл CH₂Cl₂ в течение 20 мин, смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе гексан‒этилацетат (2 : 1). Продукт очищали методом флеш-хроматографии в градиенте гексан–этилацетат (5 : 1) → этилацетат, высушивали от растворителей на ротационном испарителе и получали соединение 2h в виде прозрачной вязкой жидкости с желтоватым оттенком. Выход – 59 мг (37%). ¹H ЯМР (δ) : 4.77 (2H, кв, J = 9.1 Гц, CF₃CH₂OOC), 4.76 (2H, кв, J = 9.1 Гц, CF₃CH₂OOC), 3.55–3.36 (4H, м, CH₂CH₂COO), 2.97‒2.91 (4H, м, CH₂S), 2.83–2.77 (4H, м, CH₂S). ¹³C ЯМР (150.7 МГц, δ): 170.17 (2 × c), 123.90 (2 × кв, J = 279 Гц), 60.35 (2 × кв, J = 35 Гц), 50.26, 35.34, 27.58, 27.50. ¹⁹F ЯМР (563.9 МГц, δ): –72.29 (2 × т, J = 11.3 Гц).

Ди-(2,2,2-трихлорэтил)овый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (соединение 2i). К раствору 2,2,2-трихлорэтилдитиодипропионата (905 мг, 1.913 ммоль) в 10 мл CH₂Cl₂ при –78°C по каплям вносили раствор m-CPBA (432 мг, 1.913 ммоль) в 15 мл CH₂Cl₂ в течение 20 мин, смесь перемешивали при 0°C в течение 1 ч и затем 48 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролировали методом ТСХ в системе гексан–этилацетат (4 : 1). Продукт очищали методом колоночной хроматографии в градиенте гексан–этилацетат (10 : 1) → (4 : 1) и получали соединение 2i в виде прозрачного масла. Выход – 168 мг (18%). ИК-спектр (см^–1) : 3 009 (сл., ν С–H (CH₂CCl₃)), 2 959, 2 943, 2 928 (сл., ν С–H), 1 761 (с., ν С=O), 1 429, 1 405, 1 379 (ср., δ_as C–H), 1 272, 1 207‒1 137 (уш., с., ν С–O), 1 073 (с., ν S–S=O), 846, 797 (ср., ν C–Cl), 717 (ср., ν C–S=O), 650 (сл., ν C–S). ¹H ЯМР (δ, ацетон-d₆): 4.90 (2H, с, CCl₃CH₂OOC), 4.89 (2H, с, CCl₃CH₂OOC), 3.60‒3.40 (4H, м, CH₂CH₂COO), 3.15–2.95 (4H, м, CH₂S). ¹³C ЯМР (δ): 170.06, 170.00, 95.58, 95.52, 73.97, 73.80, 50.27, 35.62, 27.73, 27.59.

Определение минимальных ингибирующих концентраций тиосульфинатов. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) определяли методом двукратных серийных разведений согласно CLSI M27-A3 [18] и M07-A11 [19] в трех независимых экспериментах с тремя повторами в каждом. В качестве положительного контроля в случае C. albicans использовали флуконазол, для S. aureus – ванкомицин. Стоковый раствор аллицина готовили в ДМСО в концентрации 6 400 мкг/мл; для остальных веществ – в стерильной воде в концентрации 1 280 мкг/мл. Стоковые растворы препаратов разбавляли до конечных концентраций в среде для анализа и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов, после чего добавляли по 100 мкл инокулята. Ряды 11 и 12 оставляли для отрицательного контроля (среда с инокулятом без препарата) и контроля стерильности. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 35°C для C. albicans и при 37°C для S. aureus. Тестируемый диапазон концентраций для флуконазола и соединений 2a, 2d, 2h, 2g, 2f составлял от 0.125 до 64 мкг/мл; для ванкомицина и соединений 2b, 2c, 2e, 2i – от 0.0625 до 32 мкг/мл. Значение МПК определяли спектрофотометрически. За МПК принимали наименьшую концентрацию препарата, вызывающую значительное (~80% для флуконазола) или полное (все другие препараты) подавление роста микроорганизма по сравнению с контролем.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез природных тисульфинатов и их аналогов: арилтиосульфинатов и тиосульфинатных производных диалкилдикарбоксилатов

Природный компонент аллицин обладает широким спектром противомикробного действия, но при этом имеет низкую стабильность [14]. Его аналоги, например диметилтиосульфинат, механизм действия которого аналогичен аллицину, более стабильны. В ходе работы были получены как природные алкил-аналоги аллицина (2a–2c), действующие одновременно против патогенных грибов и бактерий, так и синтезированы новые тиосульфинатные производные (2e–2i) аллицина (рис. 1) с замещенными фрагментами алкилкарбоксилатов и их эфиров, а также остатком пиридин-N-оксида. Последнее производное относится к привилегированной структуре в медицинской химии [20] и служит миметиком малоизученного противомикробного компонента лука (Allium stipitatum) – 2-(метилдитио)пиридин-3-карбонитрила [21].

 

Рис. 1. Схема синтеза тиосульфинатов. Реагенты и общие условия: (i) H₂O₂, HCOOH, 0°C; (ii) m-CPBA, CH₂Cl₂, –78°C → 0°C; (iii) ROH, кипячение, H₂SO₄. В скобках указан выход продукта. Обозначения: Me ‒ метильная группа, Et ‒ этильная группа, Pr ‒ пропильная группа, Allyl ‒ аллильная группа, Py-N-oxide ‒ пиридин-N-оксид, propionic acid ‒ пропионовая кислота.

 

К основным методам получения алифатических тиосульфинатов относится воздействие смеси 30%-ного раствора перекиси водорода и муравьиной кислоты на дисульфид [14, 22, 23]. В результате в реакционной смеси in situ генерируется пермуравьиная кислота, которая и действует как окислитель на дисульфидную связь. В качестве альтернативного окислителя применяют мета-хлорпербензойную кислоту (m-CРВA) [22]. Оба метода требуют поддержания низких температур: 0–4°C в случае перекиси водорода и –78°C в случае m-CPBA. Однако даже при соблюдении заданного температурного режима происходит образование побочных продуктов – сульфонов. Именно поэтому для выделения каждого из продуктов 2a–2i пришлось вводить стадию очистки с использованием колоночной хроматографии.

В случае диалкилдикарбоксилатов и их производных (1f‒1i) было обнаружено, что при “мягком” окислении, под действием 30%-ного раствора H2O2 и муравьиной кислоты, образуются лишь следовые количества продуктов. Вероятно, это вызвано сильным электроноакцепторным влиянием карбоксильных заместителей, которые приводят к электронодефицитному состоянию атомов серы. В связи с этим мы применили более “жесткий” окислитель — m-CBPA — и повысили температурный режим реакции. В таких условиях образовался как целевой продукт, так и значительное количество сульфона.

Синтез соединений 1g и 1h выполняли при кипячении соответствующего спирта с дикислотой 1f в присутствии каталитических количеств серной кислоты. В случае соединения 1i реакцию проводили при 140°C — чтобы избежать разложения 2,2,2-трихлорэтанола. Выбор галогенсодержащих спиртов в роли заместителей был проведен на основании теоретического анализа стабильности образуемых ими дисульфидов и соответствующих тиосульфинатов. Кроме того, при разложении 2,2,2-трифторэтил- и 2,2,2-трихлорэтилкарбоксилатов ожидали образования менее токсичных и хорошо экскретируемых из организма продуктов по сравнению с другими вариантами замещенных галогенэфиров [24].

Синтезированные соединения охарактеризованы физико-химическими методами анализа, для ранее описанных тиосульфинатов 2a‒2d данные соответствовали ранее опубликованным [17].

Противомикробная активность диалк(ен)илтиосульфинатов и их аналогов в отношении культур C. albicans ATCC10231 и S. aureus ATCC29213 и ATCC43300

Для оценки противомикробной активности диалк(ен)илтиосульфинатов, диарилтиосульфината и тиосульфинатных производных диалкилдикарбоксилатов в отношении C. albicans и S. aureus использовали метод серийных разведений с определением величины МПК для каждого соединения. Анализ проводили на контрольных штаммах: C. albicans ATCC10231 и S. aureus ATCC29213, — рекомендованных для использования в лабораторных исследованиях. Также действие соединений было проверено на устойчивом к метициллину и оксациллину штамме S. aureus ATCC43300.

Диэтилтиосульфинат (2b) и дипропилтиосульфинат (2с) в отношении штаммов S. aureus ATCC29213 и ATCC43300 оказались одинаково малоэффективны (МПК ~200 мкМ, табл. 1). Чувствительность S. aureus к действию диметилтиосульфината (2a) для штамма ATCC29213 (МПК 272 мкМ) снизилась более чем на 30%, по сравнению с действием диэтилтиосульфината и дипропилтиосульфината. Диметилтиосульфинат оказался неэффективен в отношении MRSA штамма ATCC (МПК 435 мкМ). Оба штамма S. aureus также были нечувствительны к действию аллицина (2d) в диапазоне тестируемых концентраций (МПК > 400 мкМ). Высокие значения МПК для этого соединения соответствовали ранее полученным А. Muller и др. [13] для штаммов S. aureus ATCC DSM 20231 и ATCC43300. Авторами этой работы было показано, что аллицин действует на культуру C. albicans, причем для штамма DSM 1386 значение МПК было в два раза ниже (196 мкМ) полученного для аллицина на клетках S. aureus. Ранее мы определили, что значения МПК для диалк(ен)илтиосульфинатов в отношении штамма C. albicans ATCC10231 находятся в пределах 4.1–20 мкМ [17]. Эти величины почти на два порядка меньше, чем МПК для штаммов стафилококка (табл. 1).

 

Таблица 1. Значения МПК для синтетических тиосульфинатов и коммерческих антимикробных препаратов в отношении C. albicans и S. aureus

Соединение	МПКa
	C. albicans ATCC 10231		S. aureus ATCC 29213		S. aureus ATCC 43300
	мкг/мл	мкМ	мкг/мл	мкМ	мкг/мл	мкМ
2a (DMTS)	2.68 ± 0.57	24.32 ± 5.17b	30.0 ± 4.73	272.2 ± 42.9	48.0 ± 14.3	435.6 ± 129.8
2b (DETS)	0.72 ± 0.16b	5.21 ± 1.15b	≥32.0	≥231.4	≥32.0	≥231.4
2c (DPTS)	0.69 ± 0.26b	4.15 ± 1.54b	≥32.0	≥ 192.4	≥32.0	≥192.4
2d (DATS)	3.31 ± 1.10b	20.39 ± 6.65b	>64	>394.3	>64	>394.3
2e	>32	>119.3	>32	>119.3	>32	>119.3
2f	>64	>282.8	>64	>282.8	>64	>282.8
2g	5.44 ± 1.16	21.39 ± 4.56	>64	>251.7	>64	>251.7
2h	2.24 ± 0.50	5.74 ± 1.28	>64	>164.0	>64	>164.0
2i	1.36 ± 0.23	2.78 ± 0.47	6.50 ± 1.73	13.29 ± 3.54	10.0 ± 5.36	20.45 ± 10.96
Флуконазол	0.85 ± 0.17	2.76 ± 0.56	н/оc
Ванкомицин	н/о		1.86 ± 0.35	1.28 ± 0.24	2.5 ± 0.77	1.72 ± 0.53

^aРезультаты представлены как среднее ± 95%-ный доверительный интервал.

^bПриведены данные из работы [17, Creative Common CC BY license].

^cНе определяли.

 

Таким образом, бактерии S. aureus менее чувствительны к действию диалк(ен)илтиосульфинатов, чем грибы C. albicans. Это коррелирует с данными исследования по изучению противомикробных свойств аналогичных соединений в отношении грамположительных бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae, Micrococcus luteus) и дрожжеподобных грибов Saccharomyces cerevisiae. В этой работе R. Leontiev с соавт. [14] показали, что противогрибковая активность диалк(ен)илтиосульфинатов выше, чем антибактериальная. По приведенным в табл. 1 данным видно, что из всех исследованных нами диалк(ен)илтиосульфинатов максимальной противомикробной активностью обладает дипропилтиосульфинат (2c).

Значения МПК для серии синтетических аналогов тиосульфинатов: диарилтиосульфината и тиосульфинатных производных диалкилдикарбоксилатов — находились в диапазоне концентраций от 2.78 до более 282 мкМ (табл. 1). Показано, что 2,2'-[(тио)сульфинил]-бис-(пиридин-1-оксид) (2e) и 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовая кислота (2f) не оказывали ингибирующего действия ни на грибы, ни на бактерии в терапевтически значимых концентрациях (МПК > 100 мкМ). В то же время более липофильные эфиры, такие как диметиловый (2g), ди-(2,2,2-трифторэтил)овый (2h) и ди-(2,2,2-трихлорэтил)овый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (2i), проявляли выраженную антикандидозную активностью (МПК 2.78–21 мкМ), что, по всей видимости, связано с их лучшей проницаемостью мембран патогенов по сравнению с отрицательно заряженной кислотой 2f. Наиболее универсальным противомикробным препаратом, действующим как на грибы, так и на бактериальные клетки, оказалось соединение 2i – ди-(2,2,2-трихлорэтил)овый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (МПК 2.78–20 мкМ). Низкие значения МПК, сравнимые с таковыми для известных коммерческих противогрибковых и антибактериальных препаратов, позволяют рассматривать соединение 2i как перспективное для использования в клинической практике.

Таким образом, синтезирован ряд природных диалк(ен)илтиосульфинатов и их новых синтетических аналогов и оценена их антибактериальная и антимикотическая активность на клинически значимых патогенах: бактериях S. aureus и грибах С. albicans. Показано, что некоторые соединения этого класса обладают выраженными противогрибковыми свойствами, эффективно подавляя рост С. albicans в концентрациях до 10 мкМ. Среди всех полученных соединений ди-(2,2,2-трихлорэтил)овый эфир 3,3'-[(тио)сульфинил]дипропионовой кислоты (2i) оказывал наиболее выраженное противомикробное действие как на штаммы S. aureus (МПК 13–20 мкМ), так и на С. albicans (МПК 2.78 мкМ), которое сравнимо с применяемыми лекарственными средствами. Это позволяет рассматривать соединение 2i в качестве перспективного кандидата в противомикробные препараты. Полученные результаты формируют основу для создания новых универсальных лекарственных средств против полимикробных инфекций, при терапии которых имеющиеся в арсенале коммерческие препараты могут быть малоэффективны и/или требуют использования высоких терапевтических доз.

Работа выполнена в рамках проекта Российского научного фонда (грант № 23-24-00151).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

V. M. Puchkov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

A. D. Lyfenko

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

V. S. Koval

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

S. V. Revtovich

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

V. V. Kulikova

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

N. V. Anufrieva

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

A. S. Zemskaya

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

E. A. Morozova

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

P. N. Solyev

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: elmorozova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files