Expression of the Curvularia sp. P450 Monooxygenase Gene in Escherichia coli and Confirmation of Its 7-Hydroxylation Function

封面

如何引用文章

全文:

开放存取 开放存取
受限制的访问 ##reader.subscriptionAccessGranted##
受限制的访问 订阅存取

详细

The diversity and uniqueness of fungal cytochromes P450 (CYP), capable of catalyzing the regio- and stereospecific hydroxylation of steroids, makes them important for microbiological synthesis of valuable hydroxysteroids. In the present work, the function of recombinant fungal P450 monooxygenase (CYPI) of Curvularia sp. strain VKM F-3040, a promising biocatalyst of 7-hydroxylation of androstane steroids, was studied. RT-PCR amplification of cDNA of the candidate CYPI gene and of the gene of its natural redox partner (POR), their cloning and heterologous expression in the cells of E. coli BL 21 DE(3) was carried out. In vitro experiments showed the ability of the obtained recombinant monooxygenase to catalyze hydroxylation of dehydroepiandrosterone at positions 7α and 7β. Our results expand the knowledge about fungal steroid hydroxylases and open up the prospects for the synthesis of valuable 7-hydroxysteroids by using recombinant producers.

全文:

受限制的访问

作者简介

V. Kollerov

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

编辑信件的主要联系方式.
Email: svkollerov@rambler.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, 142290

S. Tarlachkov

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Email: svkollerov@rambler.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, 142290

A. Shutov

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Email: svkollerov@rambler.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, 142290

M. Donova

G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Federal Research Center “Pushchino Scientific Center for Biological Research of the Russian Academy of Sciences”

Email: svkollerov@rambler.ru
俄罗斯联邦, Pushchino, 142290

参考

  1. Kristan K., Rižner T.L. Steroid-transforming enzymes in fungi // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2012. V. 129. P. 79–91.
  2. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2011.08.012
  3. Nassiri-Koopaei N., Faramarzi M.A. Recent developments in the fungal transformation of steroids // Biocatal. Biotransform. 2015. V. 33. P. 1–28.
  4. https://doi.org/10.3109/10242422.2015.1022533
  5. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Biotransformation of androstenedione and androstadienedione by selected Ascomycota and Zygomycota fungal strains // Phytochem. 2020. V. 169. Art. 112160. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2019.112160
  6. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Steroid modification by filamentous fungus Drechslera sp.: Focus on 7-hydroxylase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities // Fungal Biol. 2022. V. 126. P. 91‒100.
  7. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2021.11.002
  8. Kollerov V.V., Tarlachkov S.V., Donova M.V. De novo transcriptome assembly of Curvularia sp. VKM F-3040, a promising steroid-modifying ascomycete // Microbiol. Resour. Announc. 2023.
  9. https://doi.org/10.1128/MRA.00663-23
  10. Črešnar B., Petrič Š. Cytochrome P450 enzymes in the fungal kingdom // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1814. P. 29–35.
  11. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2010.06.020
  12. Sánchez-Rodríguez A., Portal O., Rojas L.E., Ocaña B., Mendoza M., Acosta M., Jiménez E., Höfte M. An efficient method for the extraction of high-quality fungal total RNA to study the Mycosphaerella fijiensis-Musa spp. interaction // Mol. Biotechnol. 2008. V. 40. P. 299‒305.
  13. https://doi.org/10.1007/s12033-008-9092-1
  14. Lu W., Feng J., Chen X., Bao Y.J., Wang Y., Wu Q., Ma Y., Zhu D. Distinct regioselectivity of fungal P450 enzymes for steroidal hydroxylation // Appl. Environ. Microbiol. 2019. V. 85. Art. e01182–19.
  15. https://doi.org/10.1128/AEM.01182-19

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Visualization of PCR products of the CYPI(a) and POR(b) genes amplified using the first chain of cDNA and recombinant plasmid pET-22b(+)-CYPI(c) and pET-22b(+)-POR(d) as a matrix after treatment with NdeI restriction endonucleases/NotI and EcoRI/NotI, respectively; gel electrophoresis on 0.8% agarose (120 V; 40 min) with ethidium bromide staining; M — DNA marker (~0.5 mcg).

下载 (95KB)
索引源数据
3. Fig. 2. TLC profile of samples of the transformation liquid of the DHEA bioconversion (0.1 g/l) with sediment R20 000 (variants 1, 3) and supernatant S20 000 (variants 2, 4) obtained from the homogenate of destroyed recombinant E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+) cells bearing an empty vector (variants 1, 2) and a homogenate of destroyed recombinant E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-CYPI and E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-POR cells carrying the target genes CYPI and POR, respectively (variants 3 4) (72 hours of transformation); C is a mixture of standard steroids at the point (from top to bottom): DHEA (2 mcg), androstenediol (3 mcg), 7β-OH-DHEA (2 mcg), 7α-OH-DHEA (2 mcg) (a); Comparative HPLC analysis of compounds I and II with control samples 7β-OH-DHEA (b) and 7α-OH-DHEA (c).

下载 (171KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».