Экспрессия гена P450-монооксигеназы гриба Curvularia sp. в бактериях Escherichia coli и подтверждение функции 7-гидроксилирования

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Разнообразие и уникальность грибных цитохромов Р450 (CYP), способных катализировать регио- и стереоспецифическое гидроксилирование стероидов, делает их важным объектом в области микробиологического синтеза ценных гидроксистероидов. В ходе настоящей работы изучена функция рекомбинантной грибной P450 монооксигеназы (CYPI) штамма Curvularia sp. ВКМ F-3040 — перспективного биокатализатора реакции 7-гидроксилирования стероидов андростанового ряда. Осуществлена ОТ-ПЦР амплификация кДНК последовательностей кандидатного гена CYPI и гена его природного редокс партнера (POR), их клонирование и гетерологическая экспрессия в клетках Escherichia coli BL 21 DE(3). В экспериментах in vitro показана способность полученной рекомбинантной монооксигеназы катализировать гидроксилирование дегидроэпиандростерона в положениях 7α и 7β. Полученные результаты расширяют знания о грибных стероидных гидроксилазах и открывают перспективы синтеза ценных 7-гидроксистероидов с использованием рекомбинантных продуцентов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

В. В. Коллеров

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Автор, ответственный за переписку.
Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

C. В. Тарлачков

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

А. А. Шутов

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

М. В. Донова

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: svkollerov@rambler.ru
Россия, Пущино, 142290, Московская обл.

Список литературы

  1. Kristan K., Rižner T.L. Steroid-transforming enzymes in fungi // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 2012. V. 129. P. 79–91.
  2. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2011.08.012
  3. Nassiri-Koopaei N., Faramarzi M.A. Recent developments in the fungal transformation of steroids // Biocatal. Biotransform. 2015. V. 33. P. 1–28.
  4. https://doi.org/10.3109/10242422.2015.1022533
  5. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Biotransformation of androstenedione and androstadienedione by selected Ascomycota and Zygomycota fungal strains // Phytochem. 2020. V. 169. Art. 112160. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2019.112160
  6. Kollerov V., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Steroid modification by filamentous fungus Drechslera sp.: Focus on 7-hydroxylase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities // Fungal Biol. 2022. V. 126. P. 91‒100.
  7. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2021.11.002
  8. Kollerov V.V., Tarlachkov S.V., Donova M.V. De novo transcriptome assembly of Curvularia sp. VKM F-3040, a promising steroid-modifying ascomycete // Microbiol. Resour. Announc. 2023.
  9. https://doi.org/10.1128/MRA.00663-23
  10. Črešnar B., Petrič Š. Cytochrome P450 enzymes in the fungal kingdom // Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1814. P. 29–35.
  11. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2010.06.020
  12. Sánchez-Rodríguez A., Portal O., Rojas L.E., Ocaña B., Mendoza M., Acosta M., Jiménez E., Höfte M. An efficient method for the extraction of high-quality fungal total RNA to study the Mycosphaerella fijiensis-Musa spp. interaction // Mol. Biotechnol. 2008. V. 40. P. 299‒305.
  13. https://doi.org/10.1007/s12033-008-9092-1
  14. Lu W., Feng J., Chen X., Bao Y.J., Wang Y., Wu Q., Ma Y., Zhu D. Distinct regioselectivity of fungal P450 enzymes for steroidal hydroxylation // Appl. Environ. Microbiol. 2019. V. 85. Art. e01182–19.
  15. https://doi.org/10.1128/AEM.01182-19

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Визуализация ПЦР-продуктов генов CYPI (а) и POR (б), амплифицированных с использованием в качестве матрицы первой цепи кДНК и рекомбинантной плазмиды pET-22b(+)-CYPI (в) и pET-22b(+)-POR (г) после обработки эндонуклеазами рестрикции NdeI/NotI и EcoRI/NotI, соответственно; гель-электрофорез на 0.8% агарозе (120 В; 40 мин) с окрашиванием этидиум бромидом; М — ДНК маркер (~0.5 мкг).

Скачать (95KB)
Метаданные
3. Рис. 2. ТСХ профиль образцов трансформационной жидкости биоконверсии ДГЭА (0.1 г/л) осадком R20 000 (варианты 1, 3) и супернатантом S20 000 (варианты 2, 4), полученными из гомогената разрушенных рекомбинантных клеток E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+), несущих пустой вектор (варианты 1, 2) и гомогената разрушенных рекомбинантных клеток E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-CYPI и E. coli BL 21 DE(3)-pET-22b(+)-POR, несущих целевые гены CYPI и POR, соответственно (варианты 3, 4) (72 ч трансформации); С ‒ смесь стандартных стероидов в точке (сверху вниз): ДГЭА (2 мкг), андростендиол (3 мкг), 7β-OH-ДГЭА (2 мкг), 7α-ОН-ДГЭА (2 мкг) (а); Сравнительный ВЭЖХ анализ соединений I и II с контрольными образцами 7β-ОН-ДГЭА (б) и 7α-ОН-ДГЭА (в).

Скачать (171KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».