Biofilms from the Kapova Cave Walls as a Source of Hydrolase Producers

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The studies of bacterial communities from extreme econiches are presently aimed mainly at analyzing the biodiversity of microorganisms using molecular biology methods. Cultivated bacteria from karst caves represent a unique group of microorganisms, the biochemical potential of which has been poorly studied. In the present work, bacteria from biofilms on the walls of the Kapova Cave (Shulgan-Tash Nature Reserve, Bashkortostan) were isolated and characterized in order to assess the ability of identified isolates to produce extracellular hydrolytic enzymes. Most of the isolates (89%) were members of the phylum Proteobacteria, with the remaining ones belonging to the phyla Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteroidetes, which accounted for 5, 4, and 2% of the isolates, respectively. Strains with high levels of secreted protease, RNase, and amylase activity were identified as Stenotrophomonas rhizophila, Lysinibacillus fusiformis, and Pseudomonas stutzeri, respectively.

Full Text

Пещера Шульган-Таш, или Капова, известна в мире благодаря наскальным рисункам, относящимся к Верхнему палеолиту (рис. 1).

 

Рис. 1. Карта пещеры Шульган-Таш с обозначением мест отбора образцов для исследования.

 

Как молекулярные, так и традиционные методы культивирования, примененные к анализу структуры бактериального сообщества этой пещеры, позволили идентифицировать представителей фил Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Nitrospirae, Bacteroidetes, Verrucomicrobia и Acidobacteria, а также выделить новые штаммы Pseudomonas (Galimzianova et al., 2020). Изучение биоразнообразия карстовых пещер служит отправной точкой для поиска полезных микробных метаболитов, имеющих перспективы практического использования. Секретируемые ферменты микроорганизмов широко используются в промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Протеазы широко используются в пищевой, кожевенной и кормовой промышленности, а также в производстве моющих средств (Abdul Razzaq et al., 2019). Амилаза занимает примерно 25% мирового рынка ферментов (Reddy et al., 2007). Амилазы широко используются в хлебопекарной, пивоваренной, алкогольной промышленности и других пищевых технологиях (Gopinath et al., 2017). Внеклеточные бактериальные РНКазы, обладающие значительным потенциалом в качестве противовирусных (Ilinskaya, Shah-Mahmud, 2014; Shah Mahmud et al., 2017, 2018) и противоопухолевых средств (Mitkevich et al., 2015; Ilinskaya et al., 2016; Surchenko et al., 2020), являются перспективными агентами для медицины.

Целью настоящей работы было охарактеризовать культивируемое бактериальное сообщество, собранное путем соскоба видимых колоний или биопленок со стен Каповой пещеры, и оценить способность изолятов синтезировать секретируемые гидролитические ферменты, а именно РНКазы, протеазы и амилазы.

Сообщества, отобранные с семи образцов видимых колоний или биопленок со стен разных участков пещеры, культивировали на жидких средах Лурия‒Бертани (LB), Ризонера 2А (R2A) и Гаузе. Для выделения отдельных бактерий использовали как глубинные, так и поверхностные посевы. Чистые культуры идентифицировали на основании секвенирования гена 16S рРНК (области V3‒V4). Полученные последовательности сравнивали с геномной базой данных Национального центра биологической информации (NCBI) с использованием алгоритма BLAST для нуклеотидов (BLASTn) (Zhanget al., 2000).

Скрининг бактерий на способность синтезировать секретируемые рибонуклеолитические, протеолитические и амилолитические ферменты проводили на следующих синтетических средах, соответственно: (а) — бесфосфорная среда, рН 8.5, г/л: Трис — 6.05; KCl — 5.0; NaCl — 1.0; (NH4)2SO4 – 2.0; Na3C6H5O7 – 1.0; MgSO4 ∙ 7 H2O — 2.0; агар — 20.0. Перед инокуляцией в среду добавляли 40% глюкозу (12.5 мл/л) и дрожжевую РНК (“Вектор”, Новосибирск, Россия) до конечной концентрации 5 мг/мл. (б) — cреда, содержащая (г/л): дрожжевой экстракт — 5.0; казеин — 5.0; NaCl — 5.0; агар-агар — 20.0; (в) — мясопептонный агар с 0.8% крахмала.

Изоляты выращивали на чашках Петри с вариантами сред (а, б, в) в течение 18 ч при 30C. Активность гидролаз оценивали путем измерения зон просветления вокруг колоний, выращенных на соответствующем субстрате (РНК, казеин, крахмал) после заливки чашек 5% раствором 1н HCl (среда а), трихлоруксусной кислоты (среда б) и раствором Люголя (среда в) для визуализации зон гидролиза. Коэффициент гидролазной активности изолята рассчитывали как соотношение радиуса колонии, включая зону прозрачности вокруг нее, к радиусу самой колонии. Согласно методике определения уровня активности гидролаз, коэффициент ферментативной активности, равный единице, отражает отсутствие активности, поскольку в этом случае колония изолята не образует вокруг зоны лизиса субстрата. Коэффициент со значением больше единицы отражает активность секретируемого фермента. Изоляты с самой высокой метаболической активностью были отобраны для дальнейшего секвенирования полноразмерного гена 16S рРНК.

Анализ альфа-разнообразия культивируемых бактерий в биопленках показал, что образец 7 обладает наибольшим таксономическим разнообразием, а образцы 2 и 3 — наименьшим (табл. 1).

 

Таблица 1. Таксономическое разнообразие культивируемых бактерий внутри сообществ со стен Каповой пещеры

№ образца

Число изолятов

R

Индекс Шеннона‒Винера

Место отбора биопленок

Морфотип биопленок со стен Каповой пещеры

1

15

4

1.285

1 этаж, зал Знаков, северо-западная стена

Белые, шаровидные

2

9

2

0.678

1 этаж, низ колодца, западная стена

Белые, плоские с волнистым краем

3

11

2

0.678

2 этаж, арка зала Рисунков

Бежевые выпуклые

4

13

3

0.798

1 этаж, начало зала Знаков, южная стена

Беловато-желтые корраловидные

5

8

2

0.697

1 этаж, зал Сталагмитовый

Синие-оливковые крупнозернистые

6

26

6

1.36

2 этаж, начало Большого западного тупика

Оливковые крупнозернистые

7

17

6

1.61

1 этаж, зал Купольный, восточная стена

Коричневые с белой обводкой

Примечание. Индексы альфа-разнообразия: R ‒ количество таксонов; индекс Шеннона‒Винера ‒ равномерность распределения таксономических единиц.

 

99 из 102 бактерий были идентифицированы до уровня рода или семейства. Большинство выделенных бактерий (89%) оказались представителями филума Proteobacteria, тогда как остальные изоляты разделились между тремя другими филумами, а именно Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes, на которые пришлось 5, 4 и 2% изолятов, соответственно. Два изолята были идентифицированы только на уровне семейства как Burkholderiaceae и Enterobacteriaceae (рис. 2а). Количественно (42 изолята) преобладали представители рода Pseudomonas.

 

Рис. 2. Количество идентифицированных бактериальных изолятов (а) и их гидролитическая активность (б). На рисунке (а): * — изолят определен только до уровня семейства; на рисунке (б) — номера изолятов указаны по окружности; А — значение коэффициента ферментативной активности равно 1.0, Б ‒ равно 1.5, В — равно 2.0.

 

Разнообразие бактериальных сообществ активно изучается в пещерах Австралии, Китая, Италии, Испании и Турции (Holmes et al., 2001; Schabereiter-Gurtner et al., 2004; Zhou et al., 2007; Ahamada Rachid, Doğruöz Güngör, 2023; Leuko et al., 2017). В большинстве этих пещер выявлено присутствие девяти групп доминантных бактерий: Proteobacteria, Acidobacteria, Planctomycetes, Chloroflexi, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Firmicutes, Nitrospirae, Actinobacteria, а также Archaea. Преобладание представителей филума Proteobacteria зафиксировано также и в Каповой пещере.

Установлено, что 6 изолятов вообще не секретировали гидролазы, тогда как 73 изолята проявили протеазную активность, 57 изолятов — амилазную активность и 71 изолят — внеклеточную РНКазную активность, а 39 изолятов обладали всеми тремя внеклеточными ферментативными активностями (рис. 2б).

Самой высокой протеазной активностью обладали представители родов Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus, Acinetobacter и Yersinia. Изоляты родов Pseudomonas, Bacillus, Yersinia, Acinetobacter, Lysinibacillus, Polaromonas и Caulobacter показали наибольший уровень активности РНКазы, а родов Pseudomonas, Serratia, Yersinia и Acinetobacter — амилазы.

Изолят с самой высокой протеазной активностью (изолят 7) был идентифицирован как Stenotrophomonas rhizophila, изолят с самой высокой РНКазной активностью (номер 27) — как Lysinibacillus fusiformis, изолят с самой высокой амилазной активностью (номер 1) — как Pseudomonas stutzeri. Ранее сообщалось о способности Stenotrophomonas rhizophila секретировать протеазы (Lich et al., 2022), Pseudomonas stutzeri — амилазу (Schmidt et al., 1979). Секретируемая РНКаза Lysinibacillus fusiformis обнаружена впервые.

Результаты проведенных исследований согласуются с данными литературы, подтверждающими доминирование представителей филума Proteobacteria в сообществах культивируемых бактерий, изолированных в карстовых пещерах, и открывают перспективы использования активных продуцентов гидролитических ферментов в практических целях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования Центров Программы стратегического академического лидерства КФУ (Приоритет-2030).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование поддержано грантом РНФ № 22-24-00036.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

W. Kurdy

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: yakovleva_galina@mail.ru
Russian Federation, Kazan, 420008

G. Yu. Yakovleva

Kazan (Volga Region) Federal University

Author for correspondence.
Email: yakovleva_galina@mail.ru
Russian Federation, Kazan, 420008

O. N. Ilyinskaya

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: yakovleva_galina@mail.ru
Russian Federation, Kazan, 420008

References

  1. Галимзянова Н.Ф., Гильванова Е.А., Рябова А.С., Гуватова З.Г., Кудрявцева А.В., Мелентьев А.И. Филогенетическое разнообразие прокариотов в микробных сообществах скальных поверхностей пещеры Шульган-Таш (Капова), южный Урал // Экобиотех. 2020. Т. 3. № 3. С. 298–304.
  2. Ahamada Rachid N., Doğruöz Güngör N. Major impacts of caving activities on cave microbial diversity: case study of Morca Cave, Turkey // Int. Microbiol. 2023. V. 26. P. 179–190.
  3. Gopinath S.C., Anbu P., Arshad M.K., Lakshmipriya Т., Voon С.H., Hashim U., Chinni S.V. Biotechnological processes in microbial amylase production // Biomed. Res. Int. 2017. Art. 1272193. https://doi.org/10.1155/2017/1272193
  4. Holmes A.J., Tujula N.A., Holley M., Contos A., James J.M., Rogers P., Gillings M.R. Phylogenetic structure of unusual aquatic microbial formations in Nullarbor caves, Australia // Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 256‒264.
  5. Ilinskaya O.N., Shah-Mahmud R.S. Ribonucleases as antiviral agents // Mol. Biol. 2014. V. 48. P. 615–623.
  6. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova.V, Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1863 (7 Pt A). P. 1559‒1567.
  7. Leuko S., Koskinen K., Sanna L., D’Angeli I.M., De Waele J., Marcia P., Moissl-Eichinger C., Rettberg P. The influence of human exploration on the microbial community structure and ammonia oxidizing potential of the Su Bentu limestone cave in Sardinia, Italy // PLoS One. 2017. V. 12. Art. e0180700.
  8. Lich N.Q., Thao T.T. P., Huy N.D. Characterization of extracellular protease from Stenotrophomonas rhizophila MT1 isolated from aquaculture sludge waste // Appl. Ecol. Environ. Res. 2022. V. 20. P. 2409–2423.
  9. Mitkevich V.A., Pace C.N., Koschinski A., Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxicity mechanism of the RNase Sa cationic mutants involves inhibition of potassium current through Ca2+-activated channels // Mol. Biol. 2015. V.49. P. 933–938.
  10. Reddy L., Wee Y.-J., Yun J.-S., Ryu H.-W. Optimization of alkaline protease production by batch culture of Bacillus sp. RKY3 through Plackett–Burman and response surface methodological approaches // Bioresour. Technol. 2008. V. 99. P. 2242–2249.
  11. Schabereiter-Gurtner C., Saiz-Jimenez C., Piñar G., Lubitz W., Rölleke S. Phylogenetic diversity of bacteria associated with Paleolithic paintings and surrounding rock walls in two Spanish caves (Llonín and La Garma) // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 47. P. 235–247.
  12. Schmidt J., John M. Starch metabolism in Pseudomonas stutzeri. I. Studies on maltotetraose-forming amylase // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 566. P. 88–99.
  13. Shah Mahmud R., Mostafa A., Müller C., Kanrai P., Ulyanova V., Sokurenko Y., Dzieciolowski J., Kuznetsova I., Ilinskaya O., Pleschka S. Bacterial ribonuclease binase exerts an intra-cellular anti-viral mode of action targeting viral RNAs in influenza a virus-infected MDCK-II cells // Virol. J. 2018. V. 15. Art. 5.
  14. Shah Mahmud R., Müller C., Romanova Y., Mostafa A., Ulyanova V., Pleschka S., Ilinskaya O. Ribonuclease from Bacillus acts as an antiviral agent against negative- and positive-sense single stranded human respiratory RNA viruses // Biomed. Res. Int. 2017. Art. 5279065.
  15. Surchenko Y.V., Dudkina E.V., Nadyrova A.I., Ulyanova V.V., Zelenikhin P.V., Ilinskaya O.N. Сytotoxic potential of novel bacillary ribonucleases balnase and balifase // BioNanoSci. 2020. V. 10. P. 409‒415.
  16. Zhang Z., Schwartz S., Wagner L, Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences // J. Comput. Biol. 2000. V. 7. P. 203–214.
  17. Zhou J.P., Gu Y.Q., Zou C.S., Mo M.H. Phylogenetic diversity of bacteria in an earth-cave in Guizhou province, southwest of China // J. Microbiol. 2007. V. 45. P. 105–112.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Map of the Shulgan-Tash cave with the designation of sampling sites for research.

Download (176KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. The number of identified bacterial isolates (a) and their hydrolytic activity (b). In Figure (a): * — the isolate is determined only up to the family level; in Figure (b) — the numbers of isolates are indicated around the circle; A — the value of the coefficient of enzymatic activity is 1.0, B ‒ is 1.5, B is equal to 2.0.

Download (328KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».