Биопленки со стен каповой пещеры как источник продуцентов гидролаз

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Современные исследования бактериальных сообществ экстремальных экониш в основном направлены на анализ биоразнообразия микроорганизмов методами молекулярной биологии. Культивируемые бактерии карстовых пещер представляют собой уникальную группу микроорганизмов, биохимический потенциал которых мало изучен. В настоящей работе с биопленок на стенах Каповой пещеры (заповедник “Шульган-Таш”, Башкортостан) выделены и охарактеризованы бактерии с целью оценки способности идентифицированных изолятов к продукции внеклеточных гидролитических ферментов. Большинство выделенных бактерий (89%) являются представителями филума Proteobacteria, остальные относятся к филумам Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes, на которые приходится 5, 4 и 2% изолятов, соответственно. Штаммы с высоким уровнем активности секретируемых протеаз, РНКаз и амилаз, были идентифицированы как Stenotrophomonas rhizophila, Lysinibacillus fusiformis и Pseudomonas stutzeri, соответственно.

Полный текст

Пещера Шульган-Таш, или Капова, известна в мире благодаря наскальным рисункам, относящимся к Верхнему палеолиту (рис. 1).

 

Рис. 1. Карта пещеры Шульган-Таш с обозначением мест отбора образцов для исследования.

 

Как молекулярные, так и традиционные методы культивирования, примененные к анализу структуры бактериального сообщества этой пещеры, позволили идентифицировать представителей фил Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes, Nitrospirae, Bacteroidetes, Verrucomicrobia и Acidobacteria, а также выделить новые штаммы Pseudomonas (Galimzianova et al., 2020). Изучение биоразнообразия карстовых пещер служит отправной точкой для поиска полезных микробных метаболитов, имеющих перспективы практического использования. Секретируемые ферменты микроорганизмов широко используются в промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Протеазы широко используются в пищевой, кожевенной и кормовой промышленности, а также в производстве моющих средств (Abdul Razzaq et al., 2019). Амилаза занимает примерно 25% мирового рынка ферментов (Reddy et al., 2007). Амилазы широко используются в хлебопекарной, пивоваренной, алкогольной промышленности и других пищевых технологиях (Gopinath et al., 2017). Внеклеточные бактериальные РНКазы, обладающие значительным потенциалом в качестве противовирусных (Ilinskaya, Shah-Mahmud, 2014; Shah Mahmud et al., 2017, 2018) и противоопухолевых средств (Mitkevich et al., 2015; Ilinskaya et al., 2016; Surchenko et al., 2020), являются перспективными агентами для медицины.

Целью настоящей работы было охарактеризовать культивируемое бактериальное сообщество, собранное путем соскоба видимых колоний или биопленок со стен Каповой пещеры, и оценить способность изолятов синтезировать секретируемые гидролитические ферменты, а именно РНКазы, протеазы и амилазы.

Сообщества, отобранные с семи образцов видимых колоний или биопленок со стен разных участков пещеры, культивировали на жидких средах Лурия‒Бертани (LB), Ризонера 2А (R2A) и Гаузе. Для выделения отдельных бактерий использовали как глубинные, так и поверхностные посевы. Чистые культуры идентифицировали на основании секвенирования гена 16S рРНК (области V3‒V4). Полученные последовательности сравнивали с геномной базой данных Национального центра биологической информации (NCBI) с использованием алгоритма BLAST для нуклеотидов (BLASTn) (Zhanget al., 2000).

Скрининг бактерий на способность синтезировать секретируемые рибонуклеолитические, протеолитические и амилолитические ферменты проводили на следующих синтетических средах, соответственно: (а) — бесфосфорная среда, рН 8.5, г/л: Трис — 6.05; KCl — 5.0; NaCl — 1.0; (NH4)2SO4 – 2.0; Na3C6H5O7 – 1.0; MgSO4 ∙ 7 H2O — 2.0; агар — 20.0. Перед инокуляцией в среду добавляли 40% глюкозу (12.5 мл/л) и дрожжевую РНК (“Вектор”, Новосибирск, Россия) до конечной концентрации 5 мг/мл. (б) — cреда, содержащая (г/л): дрожжевой экстракт — 5.0; казеин — 5.0; NaCl — 5.0; агар-агар — 20.0; (в) — мясопептонный агар с 0.8% крахмала.

Изоляты выращивали на чашках Петри с вариантами сред (а, б, в) в течение 18 ч при 30C. Активность гидролаз оценивали путем измерения зон просветления вокруг колоний, выращенных на соответствующем субстрате (РНК, казеин, крахмал) после заливки чашек 5% раствором 1н HCl (среда а), трихлоруксусной кислоты (среда б) и раствором Люголя (среда в) для визуализации зон гидролиза. Коэффициент гидролазной активности изолята рассчитывали как соотношение радиуса колонии, включая зону прозрачности вокруг нее, к радиусу самой колонии. Согласно методике определения уровня активности гидролаз, коэффициент ферментативной активности, равный единице, отражает отсутствие активности, поскольку в этом случае колония изолята не образует вокруг зоны лизиса субстрата. Коэффициент со значением больше единицы отражает активность секретируемого фермента. Изоляты с самой высокой метаболической активностью были отобраны для дальнейшего секвенирования полноразмерного гена 16S рРНК.

Анализ альфа-разнообразия культивируемых бактерий в биопленках показал, что образец 7 обладает наибольшим таксономическим разнообразием, а образцы 2 и 3 — наименьшим (табл. 1).

 

Таблица 1. Таксономическое разнообразие культивируемых бактерий внутри сообществ со стен Каповой пещеры

№ образца

Число изолятов

R

Индекс Шеннона‒Винера

Место отбора биопленок

Морфотип биопленок со стен Каповой пещеры

1

15

4

1.285

1 этаж, зал Знаков, северо-западная стена

Белые, шаровидные

2

9

2

0.678

1 этаж, низ колодца, западная стена

Белые, плоские с волнистым краем

3

11

2

0.678

2 этаж, арка зала Рисунков

Бежевые выпуклые

4

13

3

0.798

1 этаж, начало зала Знаков, южная стена

Беловато-желтые корраловидные

5

8

2

0.697

1 этаж, зал Сталагмитовый

Синие-оливковые крупнозернистые

6

26

6

1.36

2 этаж, начало Большого западного тупика

Оливковые крупнозернистые

7

17

6

1.61

1 этаж, зал Купольный, восточная стена

Коричневые с белой обводкой

Примечание. Индексы альфа-разнообразия: R ‒ количество таксонов; индекс Шеннона‒Винера ‒ равномерность распределения таксономических единиц.

 

99 из 102 бактерий были идентифицированы до уровня рода или семейства. Большинство выделенных бактерий (89%) оказались представителями филума Proteobacteria, тогда как остальные изоляты разделились между тремя другими филумами, а именно Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes, на которые пришлось 5, 4 и 2% изолятов, соответственно. Два изолята были идентифицированы только на уровне семейства как Burkholderiaceae и Enterobacteriaceae (рис. 2а). Количественно (42 изолята) преобладали представители рода Pseudomonas.

 

Рис. 2. Количество идентифицированных бактериальных изолятов (а) и их гидролитическая активность (б). На рисунке (а): * — изолят определен только до уровня семейства; на рисунке (б) — номера изолятов указаны по окружности; А — значение коэффициента ферментативной активности равно 1.0, Б ‒ равно 1.5, В — равно 2.0.

 

Разнообразие бактериальных сообществ активно изучается в пещерах Австралии, Китая, Италии, Испании и Турции (Holmes et al., 2001; Schabereiter-Gurtner et al., 2004; Zhou et al., 2007; Ahamada Rachid, Doğruöz Güngör, 2023; Leuko et al., 2017). В большинстве этих пещер выявлено присутствие девяти групп доминантных бактерий: Proteobacteria, Acidobacteria, Planctomycetes, Chloroflexi, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Firmicutes, Nitrospirae, Actinobacteria, а также Archaea. Преобладание представителей филума Proteobacteria зафиксировано также и в Каповой пещере.

Установлено, что 6 изолятов вообще не секретировали гидролазы, тогда как 73 изолята проявили протеазную активность, 57 изолятов — амилазную активность и 71 изолят — внеклеточную РНКазную активность, а 39 изолятов обладали всеми тремя внеклеточными ферментативными активностями (рис. 2б).

Самой высокой протеазной активностью обладали представители родов Pseudomonas, Stenotrophomonas, Bacillus, Acinetobacter и Yersinia. Изоляты родов Pseudomonas, Bacillus, Yersinia, Acinetobacter, Lysinibacillus, Polaromonas и Caulobacter показали наибольший уровень активности РНКазы, а родов Pseudomonas, Serratia, Yersinia и Acinetobacter — амилазы.

Изолят с самой высокой протеазной активностью (изолят 7) был идентифицирован как Stenotrophomonas rhizophila, изолят с самой высокой РНКазной активностью (номер 27) — как Lysinibacillus fusiformis, изолят с самой высокой амилазной активностью (номер 1) — как Pseudomonas stutzeri. Ранее сообщалось о способности Stenotrophomonas rhizophila секретировать протеазы (Lich et al., 2022), Pseudomonas stutzeri — амилазу (Schmidt et al., 1979). Секретируемая РНКаза Lysinibacillus fusiformis обнаружена впервые.

Результаты проведенных исследований согласуются с данными литературы, подтверждающими доминирование представителей филума Proteobacteria в сообществах культивируемых бактерий, изолированных в карстовых пещерах, и открывают перспективы использования активных продуцентов гидролитических ферментов в практических целях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена с использованием оборудования Центров Программы стратегического академического лидерства КФУ (Приоритет-2030).

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование поддержано грантом РНФ № 22-24-00036.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

Об авторах

У. Курди

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: yakovleva_galina@mail.ru
Россия, Казань, 420008

Г. Ю. Яковлева

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: yakovleva_galina@mail.ru
Россия, Казань, 420008

О. Н. Ильинская

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: yakovleva_galina@mail.ru
Россия, Казань, 420008

Список литературы

  1. Галимзянова Н.Ф., Гильванова Е.А., Рябова А.С., Гуватова З.Г., Кудрявцева А.В., Мелентьев А.И. Филогенетическое разнообразие прокариотов в микробных сообществах скальных поверхностей пещеры Шульган-Таш (Капова), южный Урал // Экобиотех. 2020. Т. 3. № 3. С. 298–304.
  2. Ahamada Rachid N., Doğruöz Güngör N. Major impacts of caving activities on cave microbial diversity: case study of Morca Cave, Turkey // Int. Microbiol. 2023. V. 26. P. 179–190.
  3. Gopinath S.C., Anbu P., Arshad M.K., Lakshmipriya Т., Voon С.H., Hashim U., Chinni S.V. Biotechnological processes in microbial amylase production // Biomed. Res. Int. 2017. Art. 1272193. https://doi.org/10.1155/2017/1272193
  4. Holmes A.J., Tujula N.A., Holley M., Contos A., James J.M., Rogers P., Gillings M.R. Phylogenetic structure of unusual aquatic microbial formations in Nullarbor caves, Australia // Environ. Microbiol. 2001. V. 3. P. 256‒264.
  5. Ilinskaya O.N., Shah-Mahmud R.S. Ribonucleases as antiviral agents // Mol. Biol. 2014. V. 48. P. 615–623.
  6. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova.V, Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) // Biochim. Biophys. Acta. 2016. V. 1863 (7 Pt A). P. 1559‒1567.
  7. Leuko S., Koskinen K., Sanna L., D’Angeli I.M., De Waele J., Marcia P., Moissl-Eichinger C., Rettberg P. The influence of human exploration on the microbial community structure and ammonia oxidizing potential of the Su Bentu limestone cave in Sardinia, Italy // PLoS One. 2017. V. 12. Art. e0180700.
  8. Lich N.Q., Thao T.T. P., Huy N.D. Characterization of extracellular protease from Stenotrophomonas rhizophila MT1 isolated from aquaculture sludge waste // Appl. Ecol. Environ. Res. 2022. V. 20. P. 2409–2423.
  9. Mitkevich V.A., Pace C.N., Koschinski A., Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxicity mechanism of the RNase Sa cationic mutants involves inhibition of potassium current through Ca2+-activated channels // Mol. Biol. 2015. V.49. P. 933–938.
  10. Reddy L., Wee Y.-J., Yun J.-S., Ryu H.-W. Optimization of alkaline protease production by batch culture of Bacillus sp. RKY3 through Plackett–Burman and response surface methodological approaches // Bioresour. Technol. 2008. V. 99. P. 2242–2249.
  11. Schabereiter-Gurtner C., Saiz-Jimenez C., Piñar G., Lubitz W., Rölleke S. Phylogenetic diversity of bacteria associated with Paleolithic paintings and surrounding rock walls in two Spanish caves (Llonín and La Garma) // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. V. 47. P. 235–247.
  12. Schmidt J., John M. Starch metabolism in Pseudomonas stutzeri. I. Studies on maltotetraose-forming amylase // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 566. P. 88–99.
  13. Shah Mahmud R., Mostafa A., Müller C., Kanrai P., Ulyanova V., Sokurenko Y., Dzieciolowski J., Kuznetsova I., Ilinskaya O., Pleschka S. Bacterial ribonuclease binase exerts an intra-cellular anti-viral mode of action targeting viral RNAs in influenza a virus-infected MDCK-II cells // Virol. J. 2018. V. 15. Art. 5.
  14. Shah Mahmud R., Müller C., Romanova Y., Mostafa A., Ulyanova V., Pleschka S., Ilinskaya O. Ribonuclease from Bacillus acts as an antiviral agent against negative- and positive-sense single stranded human respiratory RNA viruses // Biomed. Res. Int. 2017. Art. 5279065.
  15. Surchenko Y.V., Dudkina E.V., Nadyrova A.I., Ulyanova V.V., Zelenikhin P.V., Ilinskaya O.N. Сytotoxic potential of novel bacillary ribonucleases balnase and balifase // BioNanoSci. 2020. V. 10. P. 409‒415.
  16. Zhang Z., Schwartz S., Wagner L, Miller W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences // J. Comput. Biol. 2000. V. 7. P. 203–214.
  17. Zhou J.P., Gu Y.Q., Zou C.S., Mo M.H. Phylogenetic diversity of bacteria in an earth-cave in Guizhou province, southwest of China // J. Microbiol. 2007. V. 45. P. 105–112.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Карта пещеры Шульган-Таш с обозначением мест отбора образцов для исследования.

Скачать (176KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Количество идентифицированных бактериальных изолятов (а) и их гидролитическая активность (б). На рисунке (а): * — изолят определен только до уровня семейства; на рисунке (б) — номера изолятов указаны по окружности; А — значение коэффициента ферментативной активности равно 1.0, Б ‒ равно 1.5, В — равно 2.0.

Скачать (328KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных

 

Используя сайт https://journals.rcsi.science, я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных») даю согласие на обработку персональных данных на этом сайте (текст Согласия) и на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика» (текст Согласия).