Specific laboratory diagnosis of viral hepatitis

Full Text

Актуальность В РФ в последние годы заболеваемость хроническими формами гепатитов возросла более чем в 2 раза. По данным Роспотребнадзора, в 2013 г. зарегистрировано 73 570 случаев хронических вирусных гепатитов (заболеваемость составляет 51 случай на 100 тыс. населения), в том числе около 500 случаев у детей до 14 лет включительно. В г. Санкт-Петербурге заболеваемость хроническими формами гепатитов значительно выше, чем в среднем по стране и составляет 184 случая на 100 тыс. населения. Заболеваемость острыми вирусными гепатитами в Российской Федерации постепенно снижается (в 2013 г. зарегистрировано 12 745 случаев острых вирусных гепатитов, в том числе около 3 тыс. случаев у детей до 14 лет включительно). Цель исследования Правильно выбрать алгоритм специфической лабораторной диагностики и интерпретировать полученные результаты, что позволит выявить заболевших, предотвратить распространение вирусных гепатитов, определить схему лечения. Результаты и обсуждение Для специфической лабораторной диагностики применяют следующие методы: иммунная электронная микроскопия (ИЭМ); иммуно-ферментный анализ (ИФА); полимеразная цепная реакция (ПЦР). Специфическая лабораторная диагностика гепатита А Специфическая лабораторная диагностика гепатита А включает: 1. Выявление в сыворотке крови Ig M к вирусу гепатита A (ВГА, HAV) (anti-HAV Ig M) - маркер острой инфекции, в том числе бессимптомной формы. Иммуноглобулины класса М присутствуют в сыворотке крови с первых дней болезни и сохраняются до 3-6 месяцев [7]. 2. Определение «анамнестических» Ig G к ВГА (anti-HAV Ig G) - выявление в сыворотке крови (появляются с 3-4-й недели заболевания и сохраняются на протяжении всей жизни, обеспечивая иммунитет; их наличие указывает на перенесенный в прошлом гепатит А или эффективную вакцинацию). Используется для определения иммунного статуса [7, 11]. 3. Исследование фекалий на наличие ВГА методом ИЭМ. Проводится с эпидемиологической целью для выявления в очаге вспышки инфицированных лиц до проявления клинических симптомов заболевания, так как к моменту проявления клинических симптомов вирус в фекалиях практически отсутствует. Дети могут выделять вирус более длительно, чем взрослые, возможно, в течение нескольких недель после появления клинических симптомов заболевания [11, 12]. 4. Определение в сыворотке крови РНК ВГА методом ПЦР - позволяет установить диагноз «острый гепатит A» (ОГА). РНК ВГА в среднем может определяться до 95 дней [7]. В таблице 1 представлены основные серологические маркеры ВГА и их соответствие иммунному статусу обследуемого. Условной защитной концентрацией специфических антител к ВГА для населения является 22 МЕ/л, а для спецконтингентов, в том числе военнослужащих, - не менее 30 МЕ/л [7]. Специфическая лабораторная диагностика гепатита В Диагностика вирусного гепатита В (ГВ) основана на выявлении антигенов вируса - HBsAg, HВeAg, антител (Ig M и Ig G к НВсAg, Ig G к HВeAg, Ig G к HBsAg) методом ИФА (чувствительность 0,1 нг/мл), либо его ДНК в крови и других биологических жидкостях организма, а также в клетках и тканях органов методом ПЦР [2]. Самый важный маркер инфекции - HBsAg. Он обнаруживается начиная с 2-5-й недели от момента инфицирования и до момента выздоровления при острой инфекции (при хронической инфекции - пожизненно). Средняя продолжительность циркуляции в крови HBsAg - 70-80 суток. Однако при острой форме вирусного гепатита В существует период «окна», когда единственным маркером инфицированности являются Ig М к НВсAg. Время длительности фазы «окна» колеблется от 3 недель до 1 года [12]. Только комплексный анализ маркеров инфекции позволяет определить наличие вируса, установить клиническую стадию протекания инфекции (табл. 2) и иммунологический статус обследуемого, а также судить об эффективности лечения [11]. Взаимоисключающие маркеры (не могут присутствовать в крови одновременно): HBsAg и Ig G к HBsAg, HBeAg и Ig G к HBеAg. Краткая характеристика серологических маркеров ГВ HBsAg - основной и первый маркер инфицирования вирусом ГВ, появляется в крови в инкубационном периоде, циркулирует при остром заболевании до 5-6 месяцев. Положительный результат исследования на HBsAg должен быть проверен путем перестановки и последующего подтверждения в одном из тестов. HВeAg - циркулирует только при наличии HBsAg. Появляется в крови больных острым или хроническим ГВ в фазе вирусемии, указывает на репликацию вируса в гепатоцитах и высокую инфекционность крови (антиген инфекционности). Тестировать кровь на наличие HBeAg необходимо лишь при положительном результате на HBsAg. Длительность циркуляции HBeAg - важный прогностический признак. Его выявление через два месяца с начала заболевания свидетельствует о вероятном развитии хронического гепатита. HBcAg - сердцевинный (коровый) антиген в крови в свободном виде не циркулирует и не определяется. Обнаруживается только в гепатоцитах при морфологическом исследовании биоптатов печени. Ig M±Ig G к HBсAg - антитела к сердцевинному антигену - важный диагностический маркер, особенно при отрицательных результатах индикации HBsAg, свидетельствует о встрече организма с вирусом ГВ. Ig M к HBcAg - один из наиболее ранних маркеров вирусного гепатита В. Выявляют у 100 % больных острым ГВ, т. е. они могут быть единственным маркером в фазу «окна». Ig G к HBеAg - указывают на начало стадии реконвалесценции при остром вирусном гепатите В. Ig G к HBsAg - протективные (защитные) антитела к поверхностному антигену, являются показателем иммунитета (выздоровления) или иммунного ответа на вакцинацию против ГВ. «Защитная» концентрация составляет 10 МЕ и более [1-6, 8, 10-12]. В таблице 3 представлены основные алгоритмы интерпретации сочетаний серологических маркеров вируса ГВ. ДНК вируса ГВ обнаруживается в сыворотке или плазме крови методом ПЦР. Ее наличие свидетельствует о высокой репликативной активности вируса. Количество ДНК вируса в крови быстро возрастает в течение инкубационного периода и становится максимальным в острой фазе заболевания. Циркуляция более 5-6 месяцев является неблагоприятным прогностическим критерием и свидетельствует о переходе инфекции в хроническую форму. Количественная характеристика содержания ДНК вируса ГВ в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии. Если концентрация вируса меньше 105 копий/мл, то прогноз курса лечения благоприятный, если выше, то необходимо применить другие схемы лечения. Частота выявления ДНК вируса ГВ коррелирует с частотой определения HBsAg, HBeAg и Ig M к HBcAg. Используя технику ПЦР, можно определить и подтип HBsAg. Так как в практику отечественного здравоохранения были включены национальные стандарты обязательного обнаружения различных концентраций поверхностного антигена вируса ГВ в образцах сывороток крови (с 2003 г. - 0,1 нг/мл), решающее значение для индикации HBsAg имеют такие методы как ИФА в различных модификациях и ПЦР [10, 12]. В исключительных случаях (если нет специального оборудования) разрешено использовать иммунохроматографический экспресс-тест (чувствительность 5 нг/мл) [2]. Специфическая лабораторная диагностика гепатита D Серологическое исследование крови на маркеры вируса гепатита D (ВГD) показано только у пациентов с наличием в крови HBsAg, т. е. инфицированных вирусом ГВ. Ежегодно на ВГD обследуют «здоровых» носителей HBsAg, а также пациентов с хроническим вирусным гепатитом В при обострениях и ухудшении состояния. Маркеры инфицированности ВГD: РНК ВГD, Ig M±Ig G к ВГD, Ig M к ВГD, Ig G к ВГD. Методы лабораторной диагностики: антитела в крови определяют методом ИФА, РНК ВГD - методом ПЦР. При коинфекции в желтушный период на протяжении 2 недель выявляют РНК вируса и Ig M к ВГD. Несколько позднее, через 1-2 месяца с момента появления желтухи, выявляют Ig G к ВГD. Титр Ig G снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован ВГD. При суперинфекции в острый период РНК ВГD может не выявляться. Наряду с Ig M к ВГD выявляют Ig G к ВГD, причем в более высоких титрах, чем при коинфекции. Стойкое увеличение титра Ig M ± Ig G к ВГD является маркером хронического гепатита D [3-6, 11]. Специфическая лабораторная диагностика гепатита С Материал для исследования - кровь и сыворотка крови. Первый метод - ИФА - определение антител к белкам вируса гепатита С (ВГС). Современные диагностические тест-системы ИФА в качестве антигенов должны содержать полный спектр структурных и неструктурных белков вируса. Теперь используются тест-системы 4-го поколения, содержащие рекомбинантные С-, NS3-, NS4-, NS5-белки [2]. Также разработаны тест-системы ИФА и иммуноблотинга для раздельного определения антител к различным белкам ВГС. Их используют в качестве подтверждающих тестов и устанавливают стадию инфекционного процесса, так как первыми появляются антитела к С- и NS3-белкам, а антитела к NS4 и NS5 появляются позже. Но все эти антитела являются только маркерами инфицированности ВГС и защитной роли не играют. Второй метод диагностики - ПЦР для определения РНК вируса. Этот метод позволяет выявить ВГС на 2-3-й неделе после заражения и это единственный достоверный критерий присутствия вируса в организме. Выявление РНК ВГС считается «золотым» стандартом в диагностике ГС и подтверждением положительных результатов обнаружения антител к белкам вируса. В настоящее время для индикации РНК ВГС используется ПЦР в качественном и количественном варианте. Чувствительность метода составляет 10-50 копий РНК в 1 мл крови. Кроме того, методом ПЦР определяют вирусную нагрузку (вирусная нагрузка считается высокой, если в крови содержится более 800000 МЕ/мл или 2 000 000 копий/мл вирусных РНК) и проводят генотипирование вируса. Для клинической практики достаточно разграничивать 5 субтипов ВГС: 1a, 1b, 2a, 2b, 3a. На территории РФ преобладающим генотипом является 1b, составляющий 80 % популяции вируса, далее с убывающей частотой - 3a, 1a, 2a. Генотипирование необходимио проводить всем пациентам до начала лечения для правильного назначения противовирусных препаратов и продолжительности терапии [9, 10]. Типируют ВГС путем обнаружения генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома: амплификация консервативных областей и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей при помощи метода прямого секвенирования амплифицированных фрагментов с последующей ПЦР с типоспецифичными праймерами RFLP (анализ амплифицированных фрагментов с помощью ферментов рестрикции), обратной гибридизации с типоспецифичными зондами (LiPA) и SSCP (анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК). ПЦР позволяет выявить РНК ВГС не только в сыворотке крови, но и в ткани печени, что важно в подтверждении роли вируса в формировании гепатоцеллюлярной карциномы при отсутствии антител к вирусу и его РНК в сыворотке крови [9, 10, 12]. Специфическая лабораторная диагностика гепатита Е Лабораторная диагностика гепатита Е проводится методом исключения специфических маркеров острых гепатитов А, В, С, а также методом ИЭМ - обнаружение вируса гепатита Е (ВГЕ) в фекалиях. Разработана ПЦР для детекции вирусной РНК. Кроме того, разработаны тест-системы ИФА для выявления антител в сыворотке крови к ВГЕ: Ig М (выявление больных в острой стадии болезни); общие антитела (Ig M±Ig G) - выявление больных в период реконвалесценции [11, 12]. Выводы Признавая огромное значение вирусных гепатитов, Всемирная ассамблея здравоохранения в 2010 году приняла резолюцию WHA63.18, призвав применять комплексный подход к профилактике вирусных гепатитов и борьбе с ними. В связи с чем необходимо обеспечить качественную и своевременную диагностику этих заболеваний. Методы специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов все время совершенствуются, перечень маркеров инфицирования расширяется, и правильная интерпретация их сочетаний позволит врачам быстро оценить результаты лабораторных исследований и назначить больному лечение.

About the authors

Alla Mikhaylovna Sokurova

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Email: ansokurov@yandex.ru
PhD, Associate Professor, Department of Microbiology, Virology and Immunology

References

Supplementary files