Development of methods to analyse Plasmodium falciparum single nucleotide polymorphisms in PfCRT (А > C), PfMDR1 (A > T) and PfDHFR (G > A) genes that determine resistance to quinoline, diamino-pyrimidine and sulfonamide groups of antimalarial drugs

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

BACKGROUND: The drug resistance of tropical malaria pathogens to mefloquine, chloroquine, pyrimethamine and their derivatives is associated with three single nucleotide polymorphisms: K76T (A403627C), S1034C (A960989T) and S108N (G748410A). These mutations are linked to changes in the structure of the PfCRT and PfMDR1 genes of Plasmodium falciparum.

AIM: Develop methods for identifying single nucleotide polymorphisms that are suitable for early diagnosis of drug-resistant forms of tropical malaria.

RESULTS: A method was developed based on restriction fragment length analysis using ApoI endonuclease to detect the K76T polymorphism (A403627C). The criterion for determining parasite resistance to chloroquine was the appearance of a single 145 bp band on the electropherogram. The genotype of the pathogens remained unchanged and their drug sensitivity was preserved, as indicated by the separation of two fragments of 98 and 47 bp.

A system for detecting S108N (G748410A) was developed using the Bse1I endonuclease. The appearance of a single 507 bp band on the electropherogram indicated the mutant genotype of the pathogens, while the appearance of two fragments (323 and 184 bp) indicated an unchanged genotype and preservation of drug sensitivity of plasmodiae.

To identify the A > T polymorphism in the PfMDR1 gene at position 960989, polymerase chain reaction technology will be used with two allele-specific primers. One primer will detect the wild-type allele, and the other will detect the mutant genotype. The amplifiable fragment of the PfMDR1 gene contains sequences of the 1034th codon. Depending on the P. falciparum genotype, 261 bp fragments will be obtained with one of the allele-specific primers.

CONCLUSION: Criteria for assessing drug resistance of P. falciparum were developed based on the analysis of obtained data. Haplotypes K76T (band 145 bp) and S1034C (band 262 bp with the direct primer S1034C-F2) serve as indicators of the relative resistance of pathogens to chloroquine, mefloquine, and their derivatives. Positive results of examination for haplotype S108N (bands 323 and 184 bp) should be considered as a sign of decreased sensitivity to pyrimethamine. The developed methods can be used in clinical practice and for epidemiological monitoring.

About the authors

Artem R. Ariukov

Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: arukov.artem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8774-5467

postgraduate student

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksey I. Solovyov

Military Medical Academy

Email: solopiter@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3731-1756

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladimir A. Kapatsyna

S.P. Botkin Clinical infectious hospital

Email: ingashi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8959-0873

the Head of Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna A. Krutikova

Military Medical Academy

Email: anntim2575@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2561-145X

MD, Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladimir A. Romanenko

Military Medical Academy

Email: izvestiavmeda@mail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksander N. Kovalenko

Military Medical Academy

Email: ank561@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2976-8051

MD, Dr. Sci. (Medicine), Associate Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Akim A. Kolesnik

Military Medical Academy

Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-5809-9694
Russian Federation, Saint Petersburg

Artem S. Zinin

Military Medical Academy

Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-4308-7554
Russian Federation, Saint Petersburg

References

  1. Mulenga MC, Sitali L, Ciubotariu II, et al. Decreased prevalence of the Plasmodium falciparum PfCRT K76T and Pfmdr1 and N86Y mutations post-chloroquine treatment withdrawal in Katete District, Eastern Zambia. Malar J. 2021;20(1):329. doi: 10.1186/s12936-021-03859-z
  2. Hassen J, Alemayehu GS, Dinka H, Golassa L. High prevalence of PfCRT 76T and Pfmdr1 N86 genotypes in malaria infected patients attending health facilities in East Shewa zone, Oromia Regional State, Ethiopia. Malar J. 2022;21(1):286. doi: 10.1186/s12936-022-04304-5
  3. Njiro BJ, Mutagonda RF, Chamani AT, et al. Molecular surveillance of chloroquine-resistant Plasmodium falciparum in sub-Saharan African countries after withdrawal of chloroquine for treatment of uncomplicated malaria: A systematic review. J Infect Public Health. 2022;15(5):550–557. doi: 10.1016/j.jiph.2022.03.015
  4. Yobi DM, Kayiba NK, Mvumbi DM, et al. Assessment of Plasmodium falciparum anti-malarial drug resistance markers in pfk13-propeller, PfCRT and pfmdr1 genes in isolates from treatment failure patients in Democratic Republic of Congo, 2018–2019. Malar J. 2021;20(1):144. doi: 10.1186/s12936-021-03636-y
  5. Shrivastava SK, Gupta RK, Mahanta J, Dubey ML. Correlation of molecular markers, Pfmdr1-N86Y and PfCRT-K76T, with in vitro chloroquine resistant Plasmodium falciparum, isolated in the malaria endemic states of Assam and Arunachal Pradesh, Northeast India. PLoS One. 2014;9(8):e103848. doi: 10.1371/journal.pone.0103848
  6. Wang X, Zhang X, Chen H, et al. Molecular determinants of sulfadoxine-pyrimethamine resistance in Plasmodium falciparum isolates from Central Africa between 2016 and 2021: wide geographic spread of highly mutated Pfdhfr and Pfdhps alleles. Microbiol Spectr. 2022;10(5): e0200522. doi: 10.1128/spectrum.02005-22
  7. Amir A, Cheong FW, De Silva JR, Lau YL. Diagnostic tools in childhood malaria. Parasit Vectors. 2018;11(1):53. doi: 10.1186/s13071-018-2617-y
  8. Jiang T, Huang Y, Cheng W, et al. Multiple single-nucleotide polymorphism detection for antimalarial pyrimethamine resistance via allele-specific PCR coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor. Antimicrob Agents Chemother. 2021;65(3):e01063–20. doi: 10.1128/aac.01063-20
  9. Sharma D, Lather M, Dykes CL, et al. Disagreement in genotyping results of drug resistance alleles of the Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase (Pfdhfr) gene by allele-specific PCR (ASPCR) assays and Sanger sequencing. Parasitol Res. 2016;115(1):323–328. doi: 10.1007/s00436-015-4750-2
  10. Jiang T, Cheng W, Yao Y, et al. Molecular surveillance of anti-malarial resistance Pfdhfr and Pfdhps polymorphisms in African and Southeast Asia Plasmodium falciparum imported parasites to Wuhan, China. Malar J. 2020;19(1):434. doi: 10.1186/s12936-020-03509-w
  11. Dalimi A, Mosawi SH, Fotouhi-Ardakani R, Dalirghafari A. Evaluation of Drug Resistant Genotypes to Fansidar and Chloroquine by Studying Mutation in Pfdhfr and Pfmdr1 Genes in Plasmodium falciparum Isolates from Laghman Province, Afghanistan. IIran J Parasitol. 2022;17(1):18–27. doi: 10.18502/ijpa.v17i1.9012
  12. Cheng W, Song X, Zhu H, et al. A rapid and specific genotyping platform for Plasmodium falciparum chloroquine resistance via allele-specific PCR with a lateral flow assay. Microbiol Spectr. 2022;10(2): e0271921. doi: 10.1128/spectrum.02719-21
  13. Sambrook J, Russell DW. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006;2006(1): pdb.prot4455. doi: 10.1101/pdb.prot4455
  14. Lakshmanan V, Bray PG, Verdier-Pinard D, et al. A critical role for PfCRT K76T in Plasmodium falciparum verapamil-reversible chloroquine resistance. EMBO J. 2005;24(13):2294–2305. doi: 10.1038/sj.emboj.7600681
  15. Anderson TJ, Nair S, Qin H, et al. Are transporter genes other than the chloroquine resistance locus (PfCRT) and multidrug resistance gene (pfmdr) associated with antimalarial drug resistance? Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(6):2180–2188. doi: 10.1128/aac.49.6.2180–2188.2005
  16. Wernsdorfer WH, Noedl H. Molecular markers for drug resistance in malaria: use in treatment, diagnosis and epidemiology. Curr Opin Infect Dis. 2003;16(6):553–558. doi: 10.1097/01.qco.0000104295.87920.fd

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. ApoI and MluCI cut sites of the 145 bp amplicon (https://nc3.neb.com/NEBcutter/prj/PFCRT_K76T)

Download (19KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Amplified gene fragment. The restriction site of the ApoI endonuclease is located at position 76 of the PfCRT codon. The DNA arrows indicate fragment cut sites caused by this restriction site. The 76th codon of the PfCRT gene fragment is underlined

Download (47KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Location of the PfCRT gene containing the 76th codon and the AcsI (ApoI) restriction site. Point 1 — the 76th triplet of the PfCRT gene encoding lysine (wild type allele) or threonine (mutant allele) in the structure of the inner membrane transport protein of P. falciparum. Point 2 — is the site of action of the AcsI endonuclease (ApoI) in the PfCRT gene. Point 3 — the second nucleotide of the 76th codon (in this case adenine). Point 4 — restriction site of the AcsI endonuclease (ApoI)

Download (22KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Electrophoregram of PCR results on detection of mutation (A > C) in PfCRT gene (ApoI endonuclease) (1 — marker of lengths fragment length marker; 2–5 — negative control; 6–8 — wild plasmodium genotype (A); 9 — wild and mutant genotypes (A > C)

Download (53KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Amplifiable fragment of the PfMDR1 gene. Primers, point mutation and 1034th codon are in italics, bold and underlined, respectively

Download (131KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Electrophoregrams of the products of the 1st step of allele-specific PCR (1, 20 — fragment length marker; 2–5 — negative control; 5–7 and 9 — wild plasmodium genotype (A); 13, 15, 17–19 — mutant genotype (T)

Download (41KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. PCR-RFLP results for detection of S108N in PfDHFR gene using Bse1I enzyme (21, 40 — marker of fragment lengths fragments; 22–24 — negative control; 25, 27, 31, 33, 37 — wild plasmodium genotype (G); 26, 32 — mutant genotype (A))

Download (142KB)
Indexing metadata
9. Fig. 8. PCR-RFLP cleavage of fragment 76 using ApoI

Download (20KB)
Indexing metadata
10. Fig. 9. Schemes for electrophoresis of PCR products with allele-specific primers

Download (45KB)
Indexing metadata
11. Fig. 10. Structure of PCR–RFLP and cleavage of the amplified fragment using Bse1I. 108S — AGC codon (serine) does not match the restriction site, single fragment 507 bp unaltered genotype is retained, evidence of lack of resistance P. falciparum; 108N — AAC codon (aspargin), restriction occurred, fragments 323 and 184 bp appeared, sign of resistance P. falciparum; 108S/G — serine/aspargin (bends 507, 323 and 184 bp, persistence of common P. falciparum strains as well as of drug-resistant strains)

Download (33KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Eco-Vector

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».