Anti-tumor effect of high doses of carbon ions and x-rays during irradiation of Ehrlich ascites carcinoma cells ex vivo

Full Text

Ионная радиотерапия представляет собой перспективный метод лечения опухолей, резистентных к конвенциальной фотонной терапии, и опухолей, расположенных вблизи критических органов [1, 2]. В настоящее время в мире в центрах ионной терапии пролечено более 45 000 пациентов (https://www.ptcog.ch/). Применение пучков тяжелых ионов в онкологии дает огромное преимущество перед фотонной терапией из-за особенностей прохождения ионов через ткани организма: относительно низкая энергия частиц на входе в биологическую ткань и наличие пика Брэгга, при котором происходит максимальное энерговыделение в конце пробега частицы на заранее заданной глубине, непосредственно в опухоли, а затем резкое падение энергии до нуля, что позволяет более эффективно подавляет рост опухолей и не повреждать окружающие здоровые ткани, в отличие от рентгеновского излучения [3]. Лучевая терапия ионами углерода по сравнению с другим видом адронной терапии – протонной – является более эффективной, поскольку характеризуется высоким значением относительной биологической эффективности (ОБЭ) частиц от 2 до 3 в зависимости от типа клеток, доз и метода регистрации повреждений [4–6]. Поскольку высокое значение ОБЭ ионов углерода обусловлено меньшей зависимостью гибели клеток от фаз клеточного цикла, содержания кислорода в опухоли, преимущественной индукцией кластерных труднорепарируемых повреждений ДНК, подавлением некоторых этапов пострадиационной репарации, это позволяет рассматривать ионы углерода как эффективный инструмент уничтожения разных по радиочувствительности клеток солидных опухолей, которые характеризуются экстремально гипоксическими условиями по сравнению с окружающими тканями. Специфика биологического действия ионов углерода также позволяет предположить, что этот вид излучения будет эффективным и в отношении опухолевых стволовых клеток (ОСК), которые обладают потенциалом самообновления, устойчивы к химио- или лучевой терапии, провоцируют рецидивы опухоли и метастазирование за счет стимулирования к делению и дифференцировке после гибели основной массы опухолевых клеток [7–9]. Проблема радиоустойчивости ОСК в настоящее время остроактуальна и далека до решения. Одним из перспективных подходов к решению проблем резистентности, метастазирования и рецидивирования опухолей, обусловленных, в том числе, ОСК, является, на наш взгляд, применение ионной терапии, которая позволяет использовать более высокие, по сравнению с конвенциальной, дозы облучения. В данной работе используется модель индукции солидных опухолей, возникающих после имплантации мышам облученных опухолевых клеток, в пуле которых сохраняются зависимые от дозы уровни ОСК и клетки в сенесцентном состоянии.

Целью работы являлось изучение закономерностей индукции и роста опухолей на модели солидной формы асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) у мышей после облучения асцитных клеток ex vivo высокими дозами ускоренных ионов углерода и рентгеновского излучения.

Эксперименты проводили на 2-месячных самцах мышей колонии SHK (31–35 г), которые содержались в стандартных условиях вивария Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук (Пущино, Россия). В качестве модели опухолевого роста была использована солидная форма АКЭ [10]. Опухолевые клетки были получены из криобанка культур клеток Института биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН). Условия поддержания асцитной культуры in vivo и подготовки клеток для облучения описаны ранее [11].

Суспензию клеток АКЭ в концентрации 20 ∙ 10⁶ клеток/мл облучали в эппендорфе объемом 1.5 мл при комнатной температуре: 1) ионами углерода (¹²С) в модифицированном пике Брэгга (Е = 400 МэВ, 0.5 Гр/мин, ЛПЭ ~39 кэВ/мкм) в дозах 5; 10; 20 и 30 Гр на моноэнергетическом пучке c энергией 400 МэВ/нуклон ускорительного комплекса У-70 на базе ФГБУ “Институт физики высоких энергий имени А. А. Логунова НИЦ “Курчатовский институт” (Протвино); 2) рентгеновским излучением (РИ) в дозах 20; 30; 40 и 60 Гр на установке РУТ (200 кВ, 1 Гр/мин, ЛПЭ ~2 кэВ/мкм) в ЦКП “Источники излучения” (ИБК, Пущино). Дозы были выбраны как равноэффективные исходя из литературных и наших данных по определению ОБЭ при действии ионов углерода in vivo и in vitro [12, 13].

После облучения мышам имплантировали клетки АКЭ в количестве 2 ∙ 106 в объеме 0.1 мл внутримышечно в бедро левой лапы. Мышам контрольной группы инокулировали такое же количество необлученных клеток АКЭ. В каждой группе было 10 мышей, и для каждой экспериментальной точки было проведено не менее 2 повторов.

После инокуляции клеток АКЭ ежедневно наблюдали за частотой индукции и скоростью роста солидных опухолей у мышей в течение 90 сут. Латентный период оценивали как временной интервал между датой инокуляции клеток карциномы Эрлиха и датой появления пальпируемой опухоли, объем которой был равен 0.4 см³ (V₀). Дважды в неделю с помощью электронного штангенциркуля с точностью ±0.01 мм измеряли три ортогональных диаметра опухоли, и объем опухоли (V_t ) рассчитывали по стандартной формуле. Динамику роста опухоли оценивали по среднему относительному объему в зависимости от дней после появления, нормализованному к первоначальному объему (V_t /V₀). Скорость роста опухоли определяли по среднему времени 5-кратного увеличения опухоли, которое рассчитывалось как среднее количество дней от начала роста опухоли до объема опухоли, достигающего увеличения в 5 раз. Статистические расчеты проводились с помощью программы STATISTICA 10, различия считали статистически значимыми при p ≤ 0.01.

На рис. 1 представлена динамика появления опухолей у мышей после инокуляции клеток АКЭ, облучённых ¹²С и РИ. На 5-е сут у 100% мышей, которым были инокулированы необлученные клетки, индуцировались солидные опухоли АКЭ. В группах, которым были инокулированы облученные ex vivo клетки, появление опухолей наблюдали с задержкой начала роста, которая зависела от величины дозы. При облучении клеток ¹²С в дозе 5 Гр появление первых опухолей наблюдали на 8-е сут, 10 Гр – на 11-е сут, 20 Гр – на 21-е сут. После облучения опухолевых клеток РИ в дозе 20 Гр первые опухоли фиксировались на 11-е сут, 30 Гр – 14-е сут, 40 Гр – 18-е сут.

Через 30 сут частота индукции опухолей после облучения ¹²С в дозах 5 Гр (88%) и 10 Гр (89%) не отличалась, в группе 20 Гр этот показатель снижался до 35%, а после облучения 30 Гр опухоли не появлялись (рис. 1а). Частота индукции опухолей после облучения клеток РИ в дозах 20; 30 и 40 Гр не отличалась и составляла 88; 70 и 80% соответственно, при этом у мышей, которым инокулировали клетки, облученные 60 Гр, опухоли в течение месяца не наблюдались (рис. 1б). Таким образом, если время появления первых опухолей зависело от дозы, то частота индукции опухолей в течение 1 мес при действии ¹²С и РИ не зависела от величины дозы при более низких дозах исследуемого диапазона. Ранее нами при исследовании действия протонов на АКЭ ex vivo в дозах 30–150 Гр было показано, что частота индукции опухолей к концу первого месяца при более низких дозах также не зависела от дозы, в отличие от времени появления первых опухолей [11]. Можно предположить, что отсутствие зависимости частоты индукции опухолей от величины дозы на этом этапе развития опухолей свидетельствует о том, что на фоне гибели опухолевых клеток происходят стимулирование деления и дифференцировка ОСК, и эти закономерности зависят от свойств разных видов излучения [11].

 

Рис. 1. Динамика появления опухолей у мышей после инокуляции клеток АКЭ, облученных: (a) ионами углерода в диапазоне доз 5–30 Гр; (б) РИ в дозах 20–60 Гр.

 

При дальнейшем наблюдении до 90 сут было обнаружено, что после облучения ¹²С в дозе 5 Гр у всех мышей появились опухоли, в дозе 10 Гр – у 90% животных, а при 20 Гр – у 47%. При облучении клеток АКЭ РИ в дозе 20 Гр на 90 сут 100% мышей были с опухолями, в дозах 30 Гр и 40 Гр – 90 и 80% соответственно. После облучения суспензии АКЭ ¹²С в дозе 30 Гр, а РИ в дозе 60 Гр опухоли у мышей не индуцировались в течение 90 сут. Следовательно, динамика появления опухолей после облучения клеток АКЭ ex vivo 12С и РИ, как и через месяц после облучения, зависела от дозы. При этом эффективность ¹²С относительно РИ была максимальной при более низких дозах, а затем уменьшалась.

Полученные данные позволили определить интервал времени, в течение которого появляются опухоли, а затем их количество не меняется. Интервал индукции опухолей после инокуляции клеток, облученных ¹²С в дозе 5 Гр, составил 6–37 сут, 10 Гр – 9–27 сут, 20 Гр – 20–34 сут. При облучении клеток РИ в дозе 20 Гр это время составляло 11– 49 сут, 30 Гр – 14–39 сут, а 40 Гр – 18–21 сут. Видно, что с ростом дозы интервал индукции АКЭ сокращался как для ¹²С, так и для РИ. Медиана латентного периода при облучении ¹²С в дозах 5 и 10 Гр составила 10 сут, а в дозе 20 Гр – 25 сут, при РИ медиана для 20 Гр равнялась 11 сут, 30 Гр – 17 сут, 40 Гр – 18 сут, что свидетельствует об увеличении латентного периода с ростом дозы для обоих типов излучений (p ≤ 0.01). Эти закономерности несколько отличаются от действия высоких доз протонов на АКЭ ex vivo, где интервал индукции не зависел от дозы, а латентный период также увеличивался с ростом дозы [11].

На рис. 2 представлена динамика роста опухолей у мышей после инокуляции суспензии клеток АКЭ, облученных ¹²С. Во всех группах, независимо от дозы, было обнаружено значительное торможение роста опухолей по сравнению с контрольной группой (р ≤ 0.01). Среднее время пятикратного увеличения объема опухоли при облучении ¹²С составило 20.7 ± 4.5 сут, а у контроля 12.5 ± 3.5 сут.

 

Рис. 2. Динамика роста опухолей у мышей после инокуляции суспензии клеток АКЭ облученных ¹²С: (а) средние относительные объемы опухоли в зависимости от дней после появления опухоли; (б) данные рисунка (a) представлены в виде количества дней для увеличения объема опухоли в 5 раз по сравнению с первым измеренным объемом. Объемы нормализованы к первому измеренному объему ≥0.40 cм³. Статистическая значимость от контрольной группы оценивалась с помощью U-критерия Манна – Уитни (* р ≤ 0.01).

 

На рис. 3 представлена динамика роста опухолей у мышей после инокуляции клеток АКЭ в зависимости от дозы РИ. Обнаружено, что скорость роста опухолей во всех группах достоверно ниже, чем в необлученном контроле (р ≤ 0.01). Среднее время пятикратного увеличения объема опухоли при облучении РИ было близко к величине этого показателя, определенного для ¹²С, и равнялось 22.7 ± 5.2 сут.

 

Рис. 3. Динамика роста опухолей у мышей после инокуляции суспензии клеток АКЭ облученных РИ: (а) средние относительные объемы опухоли в зависимости от дней после появления опухоли; (б) данные рисунка (a) представлены в виде количества дней для увеличения объема опухоли в пять раз по сравнению с первым измеренным объемом. Объемы нормализованы к первому измеренному объему ≥0.40 cм³. Статистическая значимость от контрольной группы оценивалась с помощью U-критерия Манна – Уитни (* р ≤ 0.01).

 

Таким образом, скорость роста АКЭ после облучения клеток ex vivo ¹²C и РИ не зависела ни от дозы, ни от вида излучения, ни от времени начала роста солидной опухоли. В работе [14] при облучении ¹²С (Е = 109.5МэВ, ЛПЭ = 59 кэВ/мкм) в дозе 10 Гр и РИ (225 кВ) в дозах 20, 25 и 30 Гр саркомы мягких тканей у мышей скорость роста опухолей, облученных 10 Гр ¹²С и 30 Гр РИ, также была одинаковой. Появление опухолей после инокуляции облученных асцитных клеток ex vivo в высоких дозах ¹²C свидетельствует о высокой радиорезистентности, как мы предполагаем, ОСК. В исследовании [15] показано, что после облучения ¹²С опухоли поджелудочной железы в дозе 25 Гр рост опухоли не наблюдался, в дозе 15 Гр у 80% мышей возобновлялся рост опухолей, тогда как при облучении РИ в дозе 60 Гр у 60% мышей опухоли росли. Авторы предполагают, что высокие дозы ¹²С могут по сравнению с РИ более эффективно повреждать ОСК, расположенные в гипоксических областях опухоли в стадии G₀, за счет индукции нерепарируемых кластерных повреждений ДНК независимо от стадий клеточного цикла и концентрации кислорода. Полученные нами результаты еще раз демонстрируют высокий туморогенный потенциал и радиорезистентность ОСК АКЭ, поскольку наблюдалась индукция опухолей у здоровых мышей после облучения опухолевых клеток в сублетальных и летальных дозах, величины которых, определенные по клеточной гибели и колониеобразующей способности при облучении ¹²С in vitro, находятся в интервале 4–6 Гр [16].

На основе данных динамики индукции опухолей, были построены дозовые зависимости вероятности развития опухолей через 90 сут после инокуляции облученных клеток (рис. 4).

Доза, при которой у 50% мышей на 90 сут не будет опухолей, для ¹²C составила 19.1 Гр, а для РИ – 49.4 Гр, что позволило определить по этому показателю величину ОБЭ для ¹²C, равную 2.59. Это значение ОБЭ сопоставимо с полученным нами ранее по ЛД50/30 при облучении мышей этим же пучком ионов [12]. Наши данные также хорошо согласуются с результатами по определению ОБЭ на трех сублиниях клеток рака предстательной железы крыс, облученных ионами углерода (Е = 290 МэВ, ЛПЭ = 75 кэВ/мкм) в дозах 17–37 Гр, где значение ОБЭ, определенное по 50%-ному появлению опухолей через 300 сут, составляло 1.62–2.30 [17]. При изучении радиочувствительности стволовых клеток глиомы ОБЭ для ¹²C варьировалась от 1.87 до 3.44 в зависимости от условий [18]. В работе [19] по выживаемости клеток двух линий мезотелиомы человека после облучения в дозе 6 Гр ¹²C ОБЭ составляло 2.82 и 2.93, а доля ОСК-подобных клеток увеличивалась через 10 дней после РИ, но не изменялась при облучении ¹²C.

 

Рис. 4. Зависимость количества мышей без опухолей от дозы ¹²C и РИ через 90 сут после инокуляции облученных клеток.

 

Таким образом, было обнаружено, что после облучения суспензии клеток АКЭ ex vivo ионами углерода в дозе 30 Гр и 60 Гр РИ солидные опухоли у мышей не появлялись в течение всего времени наблюдения. Показано, что динамика появления опухолей после облучения клеток АКЭ ex vivo ¹²С и РИ зависела от дозы. Величина латентного периода, как при облучении клеток ¹²С, так и РИ, увеличивалась с ростом дозы. Скорость роста опухолей после облучения клеток АКЭ ex vivo не зависела ни от дозы, ни от вида излучения, но значительно отличалась от контроля. Величина ОБЭ, определенная по равноэффективной дозе вероятности индукции опухолей у 50% мышей в течение 90 сут, составила 2.59, что свидетельствует о высокой противоопухолевой эффективности исследуемого пучка ионов углерода.

Ранее нами при разработке биомедицинских моделей и способов повышения эффективности высокоэнергетических протонов было показано, что после облучения асцитных клеток высокими дозами в условиях ex vivo и in vivo динамика индукции и рост опухолей не зависят от условий облучения [11]. Облучение опухолевых клеток не только ex vivo с последующей инокуляцией животным является удобным, результативным и экономичным подходом к изучению разных по радиочувствительности форм опухолей (асцитной и солидной), зависимости радиочувствительности от количества клеток, содержания кислорода в суспензии, но и позволяет быстрее проводить скрининг химических и физических способов модификации ионного излучения, использовать методы генной инженерии для повышения противоопухолевой эффективности, поскольку не требует транспортировки животных, сложного позиционирования при локальном облучении на ускорителях, упрощает контроль дозы и ее равномерного распределения. Мы предполагаем, что поскольку регистрируемые в нашей работе показатели опухолевого роста являются интегральным результатом гибели, задержки деления разных по радиочувствительности клеток опухоли, стимулирования дифференцировки и пролиферации ОСК в условиях влияния микроокружения опухоли и естественного противоопухолевого иммунитета организма, то предложенная экспериментальная модель может послужить полезным инструментом для исследования проблем радиорезистентности и рецидивирования опухолей и дальнейшего исследования потенциала ионной терапии.

Благодарности

Авторы выражают глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории ионного лучевого комплекса НИЦ “Курчатовский институт” Пикалову В. А. и Васильевой А. Г. за помощь в организации и проведении экспериментов на оборудовании “Радиобиологического стенда на углеродном пучке У-70”.

Конфликт интересов

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования

Работа выполнена в рамках Государственного задания № 075-01025-23-01 Федерального государственного бюджетного учреждения науки – Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и при частичном финансировании из средств договора НИР № 28/22 между Филиалом “Физико-технический центр” Федерального государственного бюджетного учреждения науки Физического института им. П.Н. Лебедева Российской академии наук и Федеральным государственным бюджетным учреждением науки – Институтом теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук.

Соблюдение этических норм и стандартов

Эксперименты с животными проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (http://oacu.od.nih.gov/regs/index.htm). Протоколы с использованием животных были одобрены комиссией ИТЭБ РАН по биологической безопасности и биоэтике (№ 11/2023 от 08.02.2023).

About the authors

V. E. Balakin

P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: belyakovata@lebedev.ru

Corresponding Member, Branch “Physical-Technical Center” 

Russian Federation, Protvino

Т. А. Belyakova

P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: belyakovata@lebedev.ru

Branch “Physical-Technical Center”

Russian Federation, Protvino

О. М. Rozanova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences

Email: belyakovata@lebedev.ru
Russian Federation, Pushchino

E. N. Smirnova

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences

Email: belyakovata@lebedev.ru
Russian Federation, Pushchino

N. S. Strelnikova

P.N. Lebedev Physical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: belyakovata@lebedev.ru

Branch “Physical-Technical Center”

Russian Federation, Protvino

Е. А. Кузнецова

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of the Russian Academy of Sciences

Email: belyakovata@lebedev.ru
Russian Federation, Pushchino

References

Supplementary files