Otu and Rif1 double mutant enables analysis of satellite DNA in polytene chromosomes of ovarian germ cells in Drosophila melanogaster

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Polytene chromosomes in Drosophila serve as a classical model for cytogenetic studies. However, heterochromatic regions of chromosomes are typically under-replicated, hindering their analysis. Mutations in the Rif1 gene lead to additional replication of heterochromatic sequences, including satellite DNA, in salivary gland cells. Here, we investigated the impact of the Rif1 mutation on heterochromatin in polytene chromosomes formed in ovarian germ cells due to the otu gene mutation. By the analysis of otu11; Rif11 double mutants, we found that, in the presence of the Rif1 mutation, ovarian cells undergo additional polytenization of pericentromeric regions. This includes the formation of large chromatin blocks composed of satellite DNA. Thus, the effects of the Rif1 mutation were similar in salivary gland and germ cells. The otu11; Rif11 system opens new possibilities for studying factors associated with heterochromatin during oogenesis.

Full Text

Области конститутивного гетерохроматина, занимающие более трети генома D. melanogaster, состоят преимущественно из последовательностей мобильных элементов и высокоповторенной сателлитной ДНК, но также содержат важные для клетки функциональные элементы [1]. В политенных хромосомах (ПХ) D. melanogaster дикого типа гетерохроматиновые районы хромосом обычно практически не представлены вследствие явления недорепликации [2]. Недавно было обнаружено, что мутации гена Rif1, консервативного регулятора репликационного тайминга, приводят к полной репликации аннотированной области гетерохроматина в клетках слюнных желез (СЖ) [3]. Кроме того, на фоне мутаций Rif1 значительно подавлена недорепликация тандемных повторов – сателлитов и рибосомных генов [4].

Политенные хромосомы у дрозофилы могут образовывать не только клетки СЖ, но и герминальные клетки яичников. Яичники дрозофилы состоят из овариол – цепочек яйцевых камер, находящихся на разных этапах развития. Каждая яйцевая камера содержит оболочку соматических клеток, развивающийся ооцит и 15 герминальных питающих клеток, которые транскрипционно высокоактивны, поскольку обеспечивают продукцию белков и других факторов для развития транскрипционно- инертного ооцита. Хромосомы питающих клеток у мух дикого типа полиплоидны (до 8192 С), но не политенны [5]. Однако они могут стать политенными в результате определенных мутаций, например при мутации гена otu (ovarian tumor) [6]. Одним из аллелей, вызывающих образование политенных хромосом с четкой дисковой структурой в питающих клетках, является otu11 [6, 7]. При этом питающие клетки мутантов otu именуются псевдопитающими (ППК), потому что их морфология отличается от клеток дикого типа, и в яйцевых камерах часто отсутствуют ооциты, по отношению к которым питающие клетки выполняют трофическую функцию [8]. Стоит отметить, что в питающих клетках, в отличие от клеток СЖ, недорепликация гетерохроматина начинается не с первого, а только с пятого цикла репликации [9]. Вследствие этого в таких хромосомах несколько снижена недорепликация гетерохроматина по сравнению с политенными хромосомами СЖ, что ведет к появлению дополнительных политенизированных блоков и уменьшению частоты разломов хромосом [10, 11]. Однако в целом политенные хромосомы СЖ и ППК схожи между собой: дисковые паттерны хорошо коррелируют, проявляя лишь незначительные различия [7].

Целью данного исследования было проверить, будет ли мутация гена Rif1 влиять на недорепликацию гетерохроматина в политенных хромосомах клеток зародышевого пути – ППК. Для этого мы вывели линию otu11; Rif11 и охарактеризовали влияние Rif11 на гетерохроматиновые районы политенных хромосом в питающих клетках. Для объединения двух мутаций в одном генотипе вторая хромосома линии y w otu11 sn1/FM3 [7] была заменена на вторую хромосому из линии w118; Rif11 [3]. В результате была получена линия с генотипом y w otu11 sn1/FM3; Rif11.

Для анализа политенных хромосом из ППК самок, гомозиготных по хромосоме y w otu11 sn1, содержали на питательной среде с добавлением сухих дрожжей при температуре 18 °C. Для получения препаратов политенных хромосом из самок возрастом 8–12 дней извлекали яичники в растворе PBS, затем переносили их в каплю ацетоорсеина (1%-й орсеин в 45%-й уксусной кислоте) на 20–30 мин, а после этого – в каплю 55%-й молочной кислоты, в которой яичники разделяли на отдельные яйцевые камеры.

Для анализа выбирали камеры, содержащие крупные ядра питающих клеток круглой формы. Отобранные яйцевые камеры переносили пипеткой в каплю 55%-й молочной кислоты на покровное стекло и накрывали предметным стеклом. После легкого постукивания препаровальной иглой под контролем настольного микроскопа и удаления лишней жидкости при помощи фильтровальной бумаги покровное стекло придавливали пальцем через фильтровальную бумагу для достижения оптимального распластывания и расправления хромосом. Препараты анализировали при помощи микроскопа Olympus BX51, с объективом 100×/1.30 Uplan FI Ph3 и цифровой камерой DP52.

В ядрах ППК мутантов otu11 политенные хромосомы не формируют общий хромоцентр: на препаратах плечи аутосом либо лежат отдельно, либо соединяются тонкими нитями (рис. 1А–В). Введение мутации Rif11 привело к резкому изменению морфологии прицентромерных районов. Плечи хромосом оказались соединены блоками компактного материала (рис. 1Г, Д).

 

Рис 1. Мутация Rif11 приводит к дополнительной политенизации прицентромерных районов в ППК. Показан прицентромерный район хромосомы 2 в ППК мутантов otu11 (А-В) и мутантов otu11; Rif11 (Г, Д). На фоне Rif1+ политенизированные плечи хромосомы 2 могут соединяться тонкими тяжами гетерохроматина (А). В других случаях левое (Б) и правое (В) плечи хромосомы 2 лежат отдельно друг от друга. Белые стрелки указывают на концы политенизированных участков хромосом. На фоне мутации Rif11, зона, фланкированная белыми стрелками, политенизируется, а хромосома 2 выглядит как единое целое и представлена блоками компактного хроматина, интенсивно окрашивающегося ацето-орсеином. Окраска – ацетоорсеином, фазовый контраст. Масштаб – 10 мкм.

 

Ранее мы показали, что в СЖ такое изменение морфологии связано с политенизацией сателлитной ДНК. Для проверки влияния мутации Rif11 на политенизацию сателлитной ДНК в ППК мы провели in situ гибридизацию (FISH) с зондом к сателлиту Prodsat (AATAACATAG), занимающему протяженные участки гетерохроматина в хромосомах 2L и 3R вблизи центромер [12]. Ранее политенизация этого сателлита на фоне мутации Rif11 была нами показана в политенных хромосомах СЖ [4]. Чтобы добиться наилучшей морфологии хромосом на препаратах для FISH из ППК, мы разработали новый подход приготовления препаратов, включающий дополнительную окраску хромосом ацетоорсеином. На первом этапе препараты хромосом готовили по схеме, описанной выше. Затем препараты прогревали на настольном термостате при 70°С 10 с для лучшего прикрепления хромосом к стеклу, фотографировали хромосомы при помощи фазово-контрастного микроскопа, после чего препараты замораживали в жидком азоте, скалывали покровное стекло, дофиксировали и хранили в 96%-й этаноле при температуре –18 °С. В хромосомах ППК мутантов otu11; Rif11 наблюдалось резкое усиление сигнала FISH Prodsat по сравнению с otu11 (рис. 2). В ППК одиночных мутантов otu11, несмотря на то что там проходит несколько раундов полной репликации генома, этот сателлит представлен лишь маленькой точкой.

 

Рис. 2. Мутация Rif11 приводит к политенизации сателлита Prodsat в хромосоме 2 ППК. Приведены фазово-контрастные изображения с окраской ацетоорсеином (верхний ряд), результат гибридизации in situ зонда к сателлиту Prodsat (средний ряд) и наложение сигнала на фазово-контрастное изображение (нижний ряд). Масштаб – 10 мкм.

 

Снижение недорепликации сателлитов в политенных хромосомах СЖ у Rif1-мутантов приводит к появлению крупных чередующихся блоков DAPI-позитивного и DAPI-негативного материала, которые соответствуют тем же блокам в метафазных хромосомах D. melanogaster. Таким образом, можно получить своего рода “дифференциальное окрашивание”, выявляющее блоки разных сателлитов, что позволяет изучать особенности организации хроматина, которые связаны с сателлитной ДНК, а также облегчает идентификацию сателлитов [4]. Для доказательства дополнительной политенизации сателлитной ДНК на фоне Rif11 в ППК мы провели более детальный анализ морфологии прицентромерных районов хромосом с помощью окрашивания DAPI (рис. 3). Для этого препараты, приготовленные по методике, описанной выше, замораживали в жидком азоте, скалывали покровное стекло, дофиксировали в 96%-й этаноле, высушивали и покрывали средой VectaShield с добавлением 0.15 мкг/мл DAPI.

 

Рис. 3. Окрашенные DAPI прицентромерные районы хромосомы 3 в политенных хромосомах СЖ (А) и ППК (Б) на фоне мутации Rif11. Участок, ограниченный районами 80А и 81F, соответствует митотическому гетерохроматину хромосомы 3. Стрелками и линиями показаны районы, имеющие сходную морфологию в двух типах клеток, а также указан предполагаемый состав ДНК для некоторых районов согласно [4]. Белый треугольник указывает на DAPI-позитивный блок, соответствующий блоку h48 карты митотического гетерохроматина. Скобкой выделено положение сателлита Prodsat, фланкирующего центромеру хромосомы 3. Приблизительное положение центромеры указано пунктирной линией, пересекающей хромосому в соответствии с [4] для политенных хромосом СЖ и по сходству морфологии соответствующих районов в ППК. В.Г. Объединенные прицентромерные районы политенных хромосом Х и 4 в СЖ (В) и ППК (Г). Окрашивание – DAPI, масштаб – 10 мкм.

 

На примере хромосомы 3 можно видеть, что чередование DAPI-позитивных и DAPI-негативных блоков в прицентромерных районах политенных хромосом СЖ и ППК мутантов по гену Rif1 сходно и позволяет визуализировать отдельные блоки политенизированных сателлитов (см. рис. 3).

Например, DAPI-негативный блок сателлита ААГАГ характерен для политенных хромосом обоих типов. В хромосомах ППК мутантов otu11; Rif11 наблюдается характерное для политенных хромосом СЖ мутантов по гену Rif1 объединение прицентромерных районов хромосом Х и 4 (см. рис. 3 В,Г). Отчетливо видна зона, соответствующая ядрышкообразующему району (NOR). В основании хромосомы 4 расположены два сходных в двух типах клеток крупных блока DAPI-позитивного материала, соответствующие в ПХ СЖ блокам сателлита 1.688 и тандемным повторам типа AANAN из гетерохроматина хромосомы 4 и проксимального гетерохроматина хромосомы Х (см. рис. 3В,Г).

Чтобы дополнительно подтвердить, что сходные по морфологии блоки гетерохроматина в хромосомах СЖ и ППК – это одни и те же блоки сателлитной ДНК, мы провели FISH сателлитов 1.688 и Prodsat. Мы показали, что в ППК сателлит 1.688 выявляется в виде протяженного блока, присоединенного к хромосоме 4. Сателлит Prodsat, который фланкирует хромоцентры аутосом, выявляется в хромосомах 3 в виде большого блока DAPI-позитивного материала в середине гетерохроматина хромосомы 3 как в СЖ (рис.4 Б), так и в ППК (рис. 4В). Эти результаты полностью соответствует нашим ожиданиям, основанным на данных, полученных ранее для политенных хромосом СЖ мутантов Rif11.

 

Рис. 4. Результаты FISH с зондами к сателлитам 1.688 и Prodsat в политенных хромосомах ППК (А,В) и СЖ (Б) мутантов otu11; Rif11. А. Один из двух блоков DAPI-позитивного материала в основании хромосомы 4 гибридизуется с пробой к сателлиту 1.688, что соответствует выводу, сделанному на основании морфологического анализа. Выявление фланкирующего центромеру хромосомы 3 сателлита Prodsat в СЖ (Б) и ППК (В). Положение сигнала полностью соответствует предсказанию, сделанному на основе анализа морфологии. Окрашивание – хромосом DAPI. Положения сигнала отмечены стрелками. Масштаб – 10 мкм.

 

В целом наши данные позволяют заключить, что в политенных хромосомах клеток зародышевого пути, так же как и в клетках слюнных желез, репликация гетерохроматиновых областей генома и сателлитной ДНК находится под контролем белка Rif1. Комбинация мутаций otu11; Rif11 приводит к появлению в герминальных клетках яичников политенных хромосом с полностью реплицированными прицентромерными областями, структура которых аналогична таковой в политенных хромосомах клеток слюнных желез мутантов по гену Rif1. Система otu11; Rif11 может быть использована для изучения районов гетерохроматина и связанных с ними белков в процессе оогенеза, что представляет особый интерес в связи с существованием герминально-специфичных механизмов репрессии мобильных элементов и сателлитов [13–15].

Благодарности

Авторы благодарят Д. Е. Корякова за помощь в освоении работы с хромосомами ППК.

Источники финансирования

Часть работы, связанная с морфологическим анализом хромосом питающих клеток, была выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00051-П). Часть работы, связанная с проведением гибридизации in situ выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00382).

Соблюдение этических норм и стандартов

В соответствии с пунктом 3 главы 1 Директивы 2010/63/ЕС от 2.09.2022 г. о защите животных, используемых в научных целях, требования биоэтики не распространяются на объект данного исследования.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

T. D. Kolesnikova

Institute of Molecular and Cellular Biology of the Siberian Branch of the RAS

Author for correspondence.
Email: doliolida@gmail.com
Russian Federation, Novosibirsk

A. R. Nokhova

Novosibirsk State University

Email: doliolida@gmail.com
Russian Federation, Novosibirsk

A. S. Shatskikh

National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: doliolida@gmail.com
Russian Federation, Moscow

M. S. Klenov

Institute of Molecular Genetics RAS

Email: doliolida@gmail.com
Russian Federation, Moscow

I. F. Zhimulev

Institute of Molecular and Cellular Biology of the Siberian Branch of the RAS

Email: doliolida@gmail.com

Academician

Russian Federation, Novosibirsk

References

  1. Marsano R.M., Giordano E., Messina G., et al. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster // Trends Genet. 2019. V. 35. P. 615–631.
  2. Zhimulev I.F. Polytene Chromosomes, Heterochromatin, and Position Effect Variegation // Adv. Genet. 1998. V. 37. P. 1–555.
  3. Munden A., Rong Z., Sun A., et al. Rif1 inhibits replication fork progression and controls DNA copy number in Drosophila // eLife. 2018. V.7. e39140.
  4. Kolesnikova T.D., Kolodyazhnaya A.V., Pokholkova G.V., et al. Effects of Mutations in the Drosophila melanogaster Rif1 Gene on the Replication and Underreplication of Pericentromeric Heterochromatin in Salivary Gland Polytene Chromosomes // Cells. 2020. V. 9. P. 1501.
  5. McLaughlin J.M., Bratu D.P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview // Methods Mol Biol. 2015. V. 1328. P. 1-20.
  6. King R.C., Riley S.F., Cassidy, J.D., et al. Giant polytene chromosomes from the ovaries of a Drosophila mutant // Science. 1981. V. 212. P. 441–443.
  7. Mal’ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromosome from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu11 and fs(2)B mutants // Chromosome. 1995. Res. Int. J. Mol. Supramol. Evol. Asp. Chromosome Biol. V. 3. P. 191–200.
  8. Heino T.I. Polytene chromosomes from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu mutant. I. Photographic map of chromosome 3 // Chromosoma. 1989. V. 97. P. 363–373.
  9. Dej K.J., Spradling A.C. The endocycle controls nurse cell polytene chromosome structure during Drosophila oogenesis // Dev. Camb. Engl. 1999. V. 126. P. 293–303.
  10. Mal’ceva N.I., Zhimulev I.F. Extent of polytene in the pericentric heterochromatin of polytene chromosomes of pseudonurse cells of otu (ovarian tumor) mutants of Drosophila melanogaster // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 273–276.
  11. Koryakov D.E., Domanitskaya E.V., Belyakin S.N., et al. Abnormal tissue-dependent polytenization of a block of chromosome 3 pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster // J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 1035–1044.
  12. Garavís M., Méndez-Lago M., Gabelica V., et al. The structure of an endogenous Drosophila centromere reveals the prevalence of tandemly repeated sequences able to form i-motifs // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 13307.
  13. Yang F., Xi R. Silencing transposable elements in the Drosophila germline // Cell Mol Life Sci. 2017. V. 74. P. 435–448.
  14. Sato K., Siomi M.C. The piRNA pathway in Drosophila ovarian germ and somatic cells // Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2020. V. 96. P. 32–42.
  15. Wei X., Eickbush D.G., Speece I., et al. Heterochromatin-dependent transcription of satellite DNAs in the Drosophila melanogaster female germline // Elife. 2021. V. 10. e62375.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The Rif11 mutation leads to additional polytenization of the pericentromeric regions in the ACC. Shown is the pericentromeric region of chromosome 2 in the ACC of otu11 mutants (A-B) and otu11 mutants; Rif11 (D, E). In the Rif1+ background, the polytenized arms of chromosome 2 can be connected by thin strands of heterochromatin (A). In other cases, the left (B) and right (C) arms of chromosome 2 lie separately from each other. White arrows point to the ends of polytenized chromosome regions. Against the background of the Rif11 mutation, the zone flanked by white arrows becomes polytenized, and chromosome 2 looks like a single whole and is represented by blocks of compact chromatin, intensely stained with aceto-orcein. Stained with acetoorcein, phase contrast. Scale: 10 µm.

Download (486KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. The Rif11 mutation leads to polytenization of the Prodsat satellite on chromosome 2 of the PPC. Shown are phase-contrast images stained with acetoorcein (top row), the result of in situ hybridization of the probe to the Prodsat satellite (middle row), and the signal superimposed on the phase-contrast image (bottom row). Scale: 10 µm.

Download (216KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. DAPI-stained pericentromeric regions of chromosome 3 in polytene chromosomes SG (A) and ACC (B) against the background of the Rif11 mutation. The area bounded by regions 80A and 81F corresponds to the mitotic heterochromatin of chromosome 3. Arrows and lines indicate regions that have similar morphology in the two types of cells, and also indicate the expected DNA composition for some regions according to [4]. The white triangle indicates a DAPI-positive block corresponding to block h48 of the mitotic heterochromatin map. The position of the Prodsat satellite flanking the centromere of chromosome 3 is indicated by a bracket. The approximate position of the centromere is indicated by a dotted line crossing the chromosome in accordance with [4] for polytene chromosomes of the SG and by the similarity of the morphology of the corresponding regions in the ACC. V.G. United pericentromeric regions of polytene chromosomes X and 4 in SG (B) and ACC (D). Staining – DAPI, scale – 10 µm.

Download (204KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. FISH results with probes to satellites 1.688 and Prodsat in the polytene chromosomes of the PPC (A, B) and SG (B) otu11 mutants; Rif11. A. One of the two blocks of DAPI-positive material at the base of chromosome 4 hybridizes to the probe to satellite 1.688, consistent with the conclusion drawn from morphological analysis. Identification of the Prodsat satellite flanking the centromere of chromosome 3 in the SG (B) and ACC (C). The position of the signal is fully consistent with the prediction made based on the morphology analysis. Staining – chromosomes with DAPI. Signal positions are indicated by arrows. Scale: 10 µm.

Download (204KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».