Features of the reduction division of the Malus Domestica tetraploid

Full Text

Введение

Яблоня – одна из самых распространенных плодовых культур в России. Триплоидные сорта (3х) яблони, полученные в последние годы, уверенно занимают нишу старых диплоидных сортов, так как имеют целый ряд преимуществ: более регулярное плодоношение, высокую товарность плодов, повышенное содержание витаминов (Седов и др., 2019; Седов и др., 2020; Седов и др., 2022).

Основным селекционным путем получения триплоидов являются скрещивания между собой тетраплоидов (4х) и диплоидов (2х). В качестве генетического ресурса 4x могут использоваться для получения 3x сортов путем межплоидного скрещивания (Liu et al., 2017). При этом гибриды получают от тетраплоидного родителя два генома и от диплоидного – один геном, что позволяет селекционеру в определенной степени управлять доминированием.

Для успешной работы по селекции яблони на полиплоидном уровне необходим широкий набор доноров диплоидных гамет, обладающих рядом селекционно значимых признаков.

Состояние генеративной сферы у исходных форм необходимо знать для определения их селекционной ценности, особенно важно в этом отношении цитоэмбриологическое изучение полиплоидных исходных форм, так как благодаря высокому числу хромосом, процесс мейоза у них может проходить с отклонениями от нормы. Поэтому от особенностей формирования гамет зависит качество последних, в конечном счете результаты гибридизации и плоидность гибридного потомства.

Можно отметить, что вопросы морфологии мейоза при микроспорогенезе у диплоидных сортов яблони исследованы достаточно полно (Константинов, 1971; Крылова, 1981; Singh et al., 1985; Гревцова, 1974; Седышева, 2012; Dar et al., 2015; Седышева, Горбачева, 2016). В значительной мере изучена генеративная сфера и у триплоидных сортов (Радионенко, 1972; Singh, Wafai, 1984; Singh et al., 1985; Седышева, 2013). Тетраплоидные формы в этом отношении малоизучены (Zakharova et al., 2013; Седышева и др., 2015). Объяснить этот пробел можно, по всей вероятности, тем, что диплоидные сорта являются преобладающими в мировом сортименте яблони, триплоидные также имеют достаточно широкое промышленное распространение. В связи с этим как те, так и другие не могли не заинтересовать биологов, как предмет всестороннего изучения. Тетраплоидные сорта и формы, менее изучены из-за их невысокой хозяйственной ценности. Но использование тетраплоидных форм в селекции как промежуточное звено в создании триплоидных сортов яблони привлекло исследователей (Седышева, Седов, 1994; Седышева, Горбачева, 2007; Седов и др., 2008; Горбачева, 2011; Седов и др., 2015).

В процессе работы по направлению селекции на полиплоидном уровне во ВНИИСПК были получены ряд тетраплоидных форм (Седов и др., 2020).

В лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК был изучен и по настоящее время изучается ход мейоза при микроспорогенезе и формирование микроспор у тетраплоидных форм яблони (Седов и др., 2008; Горбачева, 2011; Седов и др., 2015; Горбачева, 2019). Отмечается, что процент аномальных картин деления может варьировать в широких пределах в зависимости от стадии мейоза и формы: от 1,7 % [стадия тетрад у формы Папировка (2-4-4-4х)] до 96,7 % [(стадия тетрад у формы Мекинтош (4х)]. Наиболее правильным ходом микроспорогенеза характеризуются формы 25-37-45 (4х) и 20-9-27 (4х). Наиболее нарушенным – тетраплоидная форма сорта Мекинтош (4х). Данные по выходу триплоидных растений в разных комбинациях скрещивания, в основном, согласуются с данными характера аномалий в ходе микроспорогенеза. Формы, характеризующиеся сравнительно правильным ходом микроспорогенеза, формируют большую часть нормальных гамет и обеспечивают и более высокий выход триплоидных растений при скрещивании 2х × 4х. Приводятся данные, что тетраплоидные формы с наиболее правильным ходом мейоза, среднее число нарушений у которых составляет от 10,7 до 20,0 %, при опылении ими диплоидных сортов дают выход триплоидных гибридных сеянцев от 63,3 до 84,6 %, а тетраплоидная форма сорта Мекинтош с высоким количеством аномальных картин деления на завершающих стадиях мейоза (телофаза-I – 72,0 %, стадия тетрад – 96,2 %) дает невысокий выход триплоидов 31,3 % (Седов и др., 2015).

Изучение особенностей генеративных структур у тетраплоидных форм дает возможность оценить их в качестве доноров диплоидных гамет для использования в селекции на полиплоидном уровне, а селекционеру – подбирать наиболее рациональные комбинации скрещивания (Горбачева, Клименко, 2019).

Цель работы – изучить процесс образования микроспор в микроспорангиях пыльников (микроспорогенез) у тетраплоида яблони 34-21-39 для определения качества формируемых гамет и использования его в селекции.

Материалы и методики исследований

Биологическим объектом исследования служила тетраплоидная форма 34-21-39, полученная в отделе селекции яблони ВНИИСПК в 2007 от скрещивания тетраплоида 30-47-88 (4х) и диплоидного сорта Краса Свердловска (2х). Объектом изучения являлся процесс образования микроспор в микроспорангиях пыльников (микроспорогенез) у тетраплоида яблони.

Для изучения хода мейоза при микроспорогенезе генеративные почки фиксировали в уксусном алкоголе. Фиксацию почек проводили в саду с момента появления стадии зеленого конуса до окончания мейоза в пыльниках. Из фиксированного материала готовили временные давленые препараты ацетогематоксилиновым методом. Для определения соматического числа хромосом окраску объектов проводили смесью из лакмоида и 50 % пропионовой кислоты, делали временные препараты (Седышева, Соловьева, 1999).

Визуализацию мейоза проводили методом световой микроскопии на микроскопе Nikon ECLIPSE при увеличении 10 х 1,5 х 40, 10 х 1,5 х 100.

Результаты и их обсуждение

Проанализировав данные, характеризующие последовательные стадии мейоза у тетраплоида 34-21-39 (4х), следует отметить, что мейоз протекает достаточно правильно.

На разных стадиях деления при формировании микроспор отмечено от 11,3 % (метафаза-I) до 22,5 % (анафаза-II) нарушений (таблица 1). Спектр отклонений небольшой, количество отклонений составило от одного до трех.

 

Таблица 1 – Стадии мейоза

Стадия мейоза	Всего изучено микроспоцитов шт.	в том числе:				± m
		нормальных		с нарушениями
		шт.	%	шт.	%
метафаза-I	100	78	78,0	22	22,0	± 4,2
анафаза-I	167	140	83,8	27	16,2	± 2,9
телофаза-I	157	133	84,7	24	15,3	± 2,9
метафаза-II	169	131	77,5	38	22,5	± 3,2
анафаза-II	177	157	88,7	20	11,3	± 2,4
телофаза-II	418	363	86,8	55	13,2	± 1,7
тетрады	658	511	77,7	147	22,3	± 1,6

 

Морфологические типы мейотических аномалий у гибрида 34-21-39 характерны, как и для других 4х форм яблони, ранее проанализированных (Седов и др., 2008; Горбачева, Клименко, 2019; Горбачева, 2019). Типы отклонений тетраплоида 34-21-39 представлены в таблице 2 и на рисунке 1.

 

Таблица 2 – Количество и морфология отклонений в мейозе

Стадия мейоза	Число типов нарушений	Тип отклонения	Количество отклонений, шт.	% от общего числа отклонений
метафаза-I	2	забегание 1-2	20	90,9
		выброс	2	9,1
анафаза-I	3	отставание 1-3	25	92,6
		выброс	1	3,7
		мост	1	3,7
телофаза-I	1	микроядра 1-3	24	100,0
метафаза-II	3	забегание 1-4	22	57,9
		выброс	15	39,5
		забегание + выброс	1	2,6
анафаза-II	3	отставание 1-3	14	70,0
		выброс	4	20,0
		мост	2	10,0
телофаза-II	2	микроядра, сверхчисленные ядра 1-3	54	98,2
		3 ядра + микроядрышко	1	1,8
тетрады	3	пентада	85	57,8
		гексада	59	40,2
		гептада	3	2,0

 

На стадии метафаза-I и II преобладает преждевременное отхождение хромосом к полюсам веретена деления и составляет в первом гетеротипическом делении от общего числа нарушений 90,9 %, во втором гомеотипическом – 57,9 %. В значительно меньшем количестве клеток наблюдали выброс хромосом за пределы ахроматинового веретена (9,1 и 39,5 %) и два типа нарушений в одном микроспороците (рисунок 1б). Ассоциации хромосом на стадии метафазы размещались очень плотно в результате этого детальный анализ провести не удалось.

На стадии анафаза-I и анафаза-II число нарушений по сравнению с предыдущей стадией снижается. В большинстве случаев здесь наблюдается запоздалое деление бивалентов или хромосом в центре веретена (92,6 % – анафаза-I, 70,0 % – анафаза-II от общего числа нарушений) (рисунок 1а), реже встречались выбросы хромосом или хроматид в цитоплазму за пределы ахроматинового веретена, мосты.

 

Рисунок 1 – Нарушения в микроспорогенезе: а – анафаза-I отставание; б – метафаза-II выбросы; в – телофаза-II три ядра; г – телофаза-II сверхчисленные ядра; д – пентада

 

Наименьшее разнообразие типов нарушений отмечено на стадии телофаза-I (15,3 %) и телофаза-II (13,2 %). В основном на этих стадиях наблюдается микроядра и сверхчисленные ядра в цитоплазме микроспороцита (рисунок 1г). Единичный случай отмечен в телофазе-II, когда в клетке было три ядра, по размеру крупнее обычных и одно микроядрышко (рисунок 1в).

На заключительной стадии деления 22,0 % клеток образуют полиады. От общего количества полиад пентады составляют – 57,8 %, гексады – 40,2 %, изредка встречаются гептады – 2,0 % (рисунок 1д). В полиадах формируются микроспоры разной величины, соответственно такие гаметы будут не сбалансированные по количеству хромосом. Тетракенез у 34-21-39 (4х) заканчивается образованием правильных тетрад в 77,7 % случаев. Одномерная пыльца составляет 89,0 %, доля разнокалиберной (мелкой и крупной) пыльцы составила 11,0 %.

Таким образом, несмотря на наличие аномальных картин деления в ходе микроспорогенеза, форма яблони 34-21-39 (4х) имеет высокий процент визуально нормальной жизнеспособной пыльцы. Это подтверждается и результатами скрининга плоидности гибридных растений, полученных с участием тетраплоида 34-21-39 (4х) в качестве опылителя (таблица 3).

 

Таблица 3 – Плоидность гибридного потомства

Материнская форма	Отцовская форма	Число изученных растений, шт.	диплоиды, шт./%		триплоиды, шт./%
Гирлянда (2х)	34-21-39 (4х)	160	128/80,0		32/20,0

 

В комбинации скрещивания Гирлянда (2х) × 34-21-39 (4х) 80 % гибридного потомства оказалось с триплоидным набором хромосом.

Выводы

Установлено, что тетраплоидная форма яблони 34-21-39(4х) имеет незначительное число отклонений на последовательных этапах мейоза при микроспорогенезе, формирует более 80,0 % полноценной пыльцы и рекомендуется для применения в селекции на полиплоидном уровне в качестве опылителя.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в публикации, принадлежат исключительно авторам и соавторам. ФГБНУ ВНИИСПК и редакция журнала снимают с себя ответственность за любой ущерб людям и/или имуществу в результате использования любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в публикации.

About the authors

Natalya Lavrusevich

Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding

Author for correspondence.
Email: lavrusevich@orel.vniispk.ru
ORCID iD: 0000-0001-8985-8967
SPIN-code: 3205-4188

PhD in Agriculture, senior researcher, Head of laboratory of cytoembryology

Russian Federation, Zhilina village, VNIISPK, Orel district, Orel region 302530

Anastasiya Borodkina

Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding

Email: borodkina@orel.vniispk.ru
SPIN-code: 6335-4964

junior researcher in the laboratory of cytoembryology of the Russian Research Institute

Russian Federation, Zhilina village, VNIISPK, Orel district, Orel region 302530

References

Supplementary files