Особенности редукционного деления тетраплоида Malus Domestica

Полный текст

Введение

Яблоня – одна из самых распространенных плодовых культур в России. Триплоидные сорта (3х) яблони, полученные в последние годы, уверенно занимают нишу старых диплоидных сортов, так как имеют целый ряд преимуществ: более регулярное плодоношение, высокую товарность плодов, повышенное содержание витаминов (Седов и др., 2019; Седов и др., 2020; Седов и др., 2022).

Основным селекционным путем получения триплоидов являются скрещивания между собой тетраплоидов (4х) и диплоидов (2х). В качестве генетического ресурса 4x могут использоваться для получения 3x сортов путем межплоидного скрещивания (Liu et al., 2017). При этом гибриды получают от тетраплоидного родителя два генома и от диплоидного – один геном, что позволяет селекционеру в определенной степени управлять доминированием.

Для успешной работы по селекции яблони на полиплоидном уровне необходим широкий набор доноров диплоидных гамет, обладающих рядом селекционно значимых признаков.

Состояние генеративной сферы у исходных форм необходимо знать для определения их селекционной ценности, особенно важно в этом отношении цитоэмбриологическое изучение полиплоидных исходных форм, так как благодаря высокому числу хромосом, процесс мейоза у них может проходить с отклонениями от нормы. Поэтому от особенностей формирования гамет зависит качество последних, в конечном счете результаты гибридизации и плоидность гибридного потомства.

Можно отметить, что вопросы морфологии мейоза при микроспорогенезе у диплоидных сортов яблони исследованы достаточно полно (Константинов, 1971; Крылова, 1981; Singh et al., 1985; Гревцова, 1974; Седышева, 2012; Dar et al., 2015; Седышева, Горбачева, 2016). В значительной мере изучена генеративная сфера и у триплоидных сортов (Радионенко, 1972; Singh, Wafai, 1984; Singh et al., 1985; Седышева, 2013). Тетраплоидные формы в этом отношении малоизучены (Zakharova et al., 2013; Седышева и др., 2015). Объяснить этот пробел можно, по всей вероятности, тем, что диплоидные сорта являются преобладающими в мировом сортименте яблони, триплоидные также имеют достаточно широкое промышленное распространение. В связи с этим как те, так и другие не могли не заинтересовать биологов, как предмет всестороннего изучения. Тетраплоидные сорта и формы, менее изучены из-за их невысокой хозяйственной ценности. Но использование тетраплоидных форм в селекции как промежуточное звено в создании триплоидных сортов яблони привлекло исследователей (Седышева, Седов, 1994; Седышева, Горбачева, 2007; Седов и др., 2008; Горбачева, 2011; Седов и др., 2015).

В процессе работы по направлению селекции на полиплоидном уровне во ВНИИСПК были получены ряд тетраплоидных форм (Седов и др., 2020).

В лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК был изучен и по настоящее время изучается ход мейоза при микроспорогенезе и формирование микроспор у тетраплоидных форм яблони (Седов и др., 2008; Горбачева, 2011; Седов и др., 2015; Горбачева, 2019). Отмечается, что процент аномальных картин деления может варьировать в широких пределах в зависимости от стадии мейоза и формы: от 1,7 % [стадия тетрад у формы Папировка (2-4-4-4х)] до 96,7 % [(стадия тетрад у формы Мекинтош (4х)]. Наиболее правильным ходом микроспорогенеза характеризуются формы 25-37-45 (4х) и 20-9-27 (4х). Наиболее нарушенным – тетраплоидная форма сорта Мекинтош (4х). Данные по выходу триплоидных растений в разных комбинациях скрещивания, в основном, согласуются с данными характера аномалий в ходе микроспорогенеза. Формы, характеризующиеся сравнительно правильным ходом микроспорогенеза, формируют большую часть нормальных гамет и обеспечивают и более высокий выход триплоидных растений при скрещивании 2х × 4х. Приводятся данные, что тетраплоидные формы с наиболее правильным ходом мейоза, среднее число нарушений у которых составляет от 10,7 до 20,0 %, при опылении ими диплоидных сортов дают выход триплоидных гибридных сеянцев от 63,3 до 84,6 %, а тетраплоидная форма сорта Мекинтош с высоким количеством аномальных картин деления на завершающих стадиях мейоза (телофаза-I – 72,0 %, стадия тетрад – 96,2 %) дает невысокий выход триплоидов 31,3 % (Седов и др., 2015).

Изучение особенностей генеративных структур у тетраплоидных форм дает возможность оценить их в качестве доноров диплоидных гамет для использования в селекции на полиплоидном уровне, а селекционеру – подбирать наиболее рациональные комбинации скрещивания (Горбачева, Клименко, 2019).

Цель работы – изучить процесс образования микроспор в микроспорангиях пыльников (микроспорогенез) у тетраплоида яблони 34-21-39 для определения качества формируемых гамет и использования его в селекции.

Материалы и методики исследований

Биологическим объектом исследования служила тетраплоидная форма 34-21-39, полученная в отделе селекции яблони ВНИИСПК в 2007 от скрещивания тетраплоида 30-47-88 (4х) и диплоидного сорта Краса Свердловска (2х). Объектом изучения являлся процесс образования микроспор в микроспорангиях пыльников (микроспорогенез) у тетраплоида яблони.

Для изучения хода мейоза при микроспорогенезе генеративные почки фиксировали в уксусном алкоголе. Фиксацию почек проводили в саду с момента появления стадии зеленого конуса до окончания мейоза в пыльниках. Из фиксированного материала готовили временные давленые препараты ацетогематоксилиновым методом. Для определения соматического числа хромосом окраску объектов проводили смесью из лакмоида и 50 % пропионовой кислоты, делали временные препараты (Седышева, Соловьева, 1999).

Визуализацию мейоза проводили методом световой микроскопии на микроскопе Nikon ECLIPSE при увеличении 10 х 1,5 х 40, 10 х 1,5 х 100.

Результаты и их обсуждение

Проанализировав данные, характеризующие последовательные стадии мейоза у тетраплоида 34-21-39 (4х), следует отметить, что мейоз протекает достаточно правильно.

На разных стадиях деления при формировании микроспор отмечено от 11,3 % (метафаза-I) до 22,5 % (анафаза-II) нарушений (таблица 1). Спектр отклонений небольшой, количество отклонений составило от одного до трех.

 

Таблица 1 – Стадии мейоза

Стадия мейоза	Всего изучено микроспоцитов шт.	в том числе:				± m
		нормальных		с нарушениями
		шт.	%	шт.	%
метафаза-I	100	78	78,0	22	22,0	± 4,2
анафаза-I	167	140	83,8	27	16,2	± 2,9
телофаза-I	157	133	84,7	24	15,3	± 2,9
метафаза-II	169	131	77,5	38	22,5	± 3,2
анафаза-II	177	157	88,7	20	11,3	± 2,4
телофаза-II	418	363	86,8	55	13,2	± 1,7
тетрады	658	511	77,7	147	22,3	± 1,6

 

Морфологические типы мейотических аномалий у гибрида 34-21-39 характерны, как и для других 4х форм яблони, ранее проанализированных (Седов и др., 2008; Горбачева, Клименко, 2019; Горбачева, 2019). Типы отклонений тетраплоида 34-21-39 представлены в таблице 2 и на рисунке 1.

 

Таблица 2 – Количество и морфология отклонений в мейозе

Стадия мейоза	Число типов нарушений	Тип отклонения	Количество отклонений, шт.	% от общего числа отклонений
метафаза-I	2	забегание 1-2	20	90,9
		выброс	2	9,1
анафаза-I	3	отставание 1-3	25	92,6
		выброс	1	3,7
		мост	1	3,7
телофаза-I	1	микроядра 1-3	24	100,0
метафаза-II	3	забегание 1-4	22	57,9
		выброс	15	39,5
		забегание + выброс	1	2,6
анафаза-II	3	отставание 1-3	14	70,0
		выброс	4	20,0
		мост	2	10,0
телофаза-II	2	микроядра, сверхчисленные ядра 1-3	54	98,2
		3 ядра + микроядрышко	1	1,8
тетрады	3	пентада	85	57,8
		гексада	59	40,2
		гептада	3	2,0

 

На стадии метафаза-I и II преобладает преждевременное отхождение хромосом к полюсам веретена деления и составляет в первом гетеротипическом делении от общего числа нарушений 90,9 %, во втором гомеотипическом – 57,9 %. В значительно меньшем количестве клеток наблюдали выброс хромосом за пределы ахроматинового веретена (9,1 и 39,5 %) и два типа нарушений в одном микроспороците (рисунок 1б). Ассоциации хромосом на стадии метафазы размещались очень плотно в результате этого детальный анализ провести не удалось.

На стадии анафаза-I и анафаза-II число нарушений по сравнению с предыдущей стадией снижается. В большинстве случаев здесь наблюдается запоздалое деление бивалентов или хромосом в центре веретена (92,6 % – анафаза-I, 70,0 % – анафаза-II от общего числа нарушений) (рисунок 1а), реже встречались выбросы хромосом или хроматид в цитоплазму за пределы ахроматинового веретена, мосты.

 

Рисунок 1 – Нарушения в микроспорогенезе: а – анафаза-I отставание; б – метафаза-II выбросы; в – телофаза-II три ядра; г – телофаза-II сверхчисленные ядра; д – пентада

 

Наименьшее разнообразие типов нарушений отмечено на стадии телофаза-I (15,3 %) и телофаза-II (13,2 %). В основном на этих стадиях наблюдается микроядра и сверхчисленные ядра в цитоплазме микроспороцита (рисунок 1г). Единичный случай отмечен в телофазе-II, когда в клетке было три ядра, по размеру крупнее обычных и одно микроядрышко (рисунок 1в).

На заключительной стадии деления 22,0 % клеток образуют полиады. От общего количества полиад пентады составляют – 57,8 %, гексады – 40,2 %, изредка встречаются гептады – 2,0 % (рисунок 1д). В полиадах формируются микроспоры разной величины, соответственно такие гаметы будут не сбалансированные по количеству хромосом. Тетракенез у 34-21-39 (4х) заканчивается образованием правильных тетрад в 77,7 % случаев. Одномерная пыльца составляет 89,0 %, доля разнокалиберной (мелкой и крупной) пыльцы составила 11,0 %.

Таким образом, несмотря на наличие аномальных картин деления в ходе микроспорогенеза, форма яблони 34-21-39 (4х) имеет высокий процент визуально нормальной жизнеспособной пыльцы. Это подтверждается и результатами скрининга плоидности гибридных растений, полученных с участием тетраплоида 34-21-39 (4х) в качестве опылителя (таблица 3).

 

Таблица 3 – Плоидность гибридного потомства

Материнская форма	Отцовская форма	Число изученных растений, шт.	диплоиды, шт./%		триплоиды, шт./%
Гирлянда (2х)	34-21-39 (4х)	160	128/80,0		32/20,0

 

В комбинации скрещивания Гирлянда (2х) × 34-21-39 (4х) 80 % гибридного потомства оказалось с триплоидным набором хромосом.

Выводы

Установлено, что тетраплоидная форма яблони 34-21-39(4х) имеет незначительное число отклонений на последовательных этапах мейоза при микроспорогенезе, формирует более 80,0 % полноценной пыльцы и рекомендуется для применения в селекции на полиплоидном уровне в качестве опылителя.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в публикации, принадлежат исключительно авторам и соавторам. ФГБНУ ВНИИСПК и редакция журнала снимают с себя ответственность за любой ущерб людям и/или имуществу в результате использования любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в публикации.

Об авторах

Наталья Геннадьевна Лаврусевич

ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrusevich@orel.vniispk.ru
ORCID iD: 0000-0001-8985-8967
SPIN-код: 3205-4188

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник лаборатории цитоэмбриологии

Россия, 302530, Орловская область, Орловский район, д. Жилина, ВНИИСПК

Анастасия Геннадьевна Бородкина

ФГБНУ ВНИИ селекции плодовых культур

Email: borodkina@orel.vniispk.ru
SPIN-код: 6335-4964

младший научный сотрудник лаборатории цитоэмбриологии

Россия, 302530, Орловская область, Орловский район, д. Жилина, ВНИИСПК

Список литературы

Дополнительные файлы