Suppression of hepatitis b virus by a combined activity of CRISPR/Cas9 and HBx proteins

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Chronic hepatitis B is a severe liver disease associated with persistent infection with hepatitis B virus. According to recent estimations, 250 million people in the world are chronically infected, including 3 million chronically infected people in Russia. Antiviral therapeutics (nucleos(t)ide analogues and PEGylated interferon) suppress viral transcription and replication, but do not eliminate the virus from infected cells. The key reason for HBV persistency is a stable form of the viral genome (covalently closed circular DNA, cccDNA) that exists as a minichromosome protected from novel cccDNA-targeting therapeutics. Novel therapeutic approaches aimed at elimination or inactivation of cccDNA are urgently needed. CRISPR/Cas9 systems induce double strand breaks in target sites of DNA sequences. Experiments with CRISPR/Cas9 demonstrated high antiviral activity and efficient cleavage of cccDNA, but a small part of cccDNA pool remains intact. One of the main reasons of incomplete cccDNA elimination might be the structural organization of cccDNA, which persists in a heterochromatinized, very compacted form and is not be accessible to CRISPR/Cas9 systems. Viral protein HBx unwinds cccDNA and regulates cccDNA epigenetically by recruiting transcription-remodeling factors. In this work, we analyzed effects of CRISPR/Cas9 in combination with an HBxencoding plasmid or plasmids encoding mutant forms of HBx (HBxMut, which does not interact with pro-apoptotic factors Bcl-2 и Bcl-xL, and HBxNesm is localized exclusively in the nucleus and does not generate reactive oxygen species and double strand breaks in the genome). We showed that HBx improves CRISPR/Cas9 efficiency, decreasing pregenomic RNA transcription level over 98%. Moreover, we analyzed optimal ratios of plasmids encoding CRISPR/ Cas9 and HBx proteins for better antiviral efficacy. Furthermore, we discovered that HBx proteins do not have an effect on proliferation and viability of the transfected cells. In conclusion, CRISPR/Cas9 with HBx proteins exhibit high antiviral effect.

About the authors

S. A. Brezgin

Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor;
Institute of Immunology FMBA

Email: sb@rcvh.ru

Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis;

PhD Student, Laboratory of Clinical Pharmacology No. 73,

Moscow

Russian Federation

A. P. Kostyusheva

Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor

Author for correspondence.
Email: ak@rcvh.ru

Junior Researcher, Laboratory of Viral Hepatitis,

111123, Moscow, Novogireevskaya str., 3A

Russian Federation

V. N. Simirsky

Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Email: simir@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher,

Moscow

E. V. Volchkova

I.M. Sechenov Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru

PhD, MD (Medicine), Professor, Professor of the Department of Infectious Diseases, Head of the Department of Infectious Diseases on Faculty of Preventive Medicine,

Moscow

Russian Federation

D. S. Chistyakov

I.M. Sechenov Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru

Laboratory Technician, 

Moscow

D. S. Kostyushev

Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor

Email: dchistakoff@gmail.com

Researcher, 

Moscow

V. P. Chulanov

Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor;
I.M. Sechenov Moscow State Medical University

Email: vladimir.chulanov@rcvh.ru

PhD, MD (Medicine), Head of the Laboratory of Viral Hepatitis;

Professor of the Department of Infectious Diseases, Faculty of Preventive Medicine,

Moscow

References

  1. Allweiss L., Dandri M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses, 2017, vol. 9, no. 6: 156. doi: 10.3390/v9060156
  2. Belloni L., Pollicino T., De Nicola F., Guerrieri F., Raffa G., Fanciulli M., Levrero M. Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, vol. 106, no. 47, pp. 19975– 19979. doi: 10.1073/pnas.0908365106
  3. Bock C.T., Schwinn S., Locarnini S., Fyfe J., Manns M.P., Trautwein C., Zentgraf H. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome. J. Mol. Biol., 2001, vol. 307, no. 1, pp. 183–196. doi: 10.1006/jmbi.2000.4481
  4. Cha M.-Y., Kim C.-M., Park Y.-M., Ryu W.-S. Hepatitis B virus X protein is essential for the activation of Wnt/beta-catenin signaling in hepatoma cells. Hepatology, 2004, vol. 39, no. 6, pp. 1683–1693. doi: 10.1002/hep.20245
  5. Dong C., Qu L., Wang H., Wei L., Dong Y., Xiong S. Targeting hepatitis B virus cccDNA by CRISPR/Cas9 nuclease efficiently inhibits viral replication. Antiviral Res., 2015, vol. 118, pp. 110–117. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015
  6. Forgues M., Marrogi A.J., Spillare E.A., Wu C.G., Yang Q., Yoshida M., Wang X.W. Interaction of the hepatitis B virus X protein with the Crm1-dependent nuclear export pathway. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, no. 25, pp. 22797–22803. doi: 10.1074/jbc.M101259200
  7. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences. N. Engl. J. Med., 2004, vol. 350, no. 11, pp. 1118–1129. doi: 10.1056/NEJMra031087
  8. Geng X., Huang C., Qin Y., McCombs J.E., Yuan Q., Harry B.L., Xue D. Hepatitis B virus X protein targets Bcl-2 proteins to increase intracellular calcium, required for virus replication and cell death induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012, vol. 109, no. 45, pp. 18471–18476. doi: 10.1073/pnas.1204668109
  9. Kim S., Lee H.-S., Ji J.-H., Cho M.-Y., Yoo Y.-S., Park Y.-Y., Cho H. Nuclear expression of hepatitis B virus X protein is associated with recurrence of early-stage hepatocellular carcinomas: role of viral protein in tumor recurrence. J. Pathol. Transl. Med., 2016, vol. 50, no. 3, pp. 181–189. doi: 10.4132/jptm.2016.03.18
  10. Konerman M.A., Lok A.S. Interferon treatment for hepatitis B. Clin. Liver Dis., 2016, vol. 20, no. 4, pp. 645–665. doi: 10.1016/j.cld.2016.06.002
  11. Liu Y., Zhao M., Gong M., Xu Y., Xie C., Deng H., Wang Z. Inhibition of hepatitis B virus replication via HBV DNA cleavage by Cas9 from Staphylococcus aureus. Antiviral Res., 2018, vol. 152, pp. 58–67. doi: 10.1016/j.antiviral.2018.02.011
  12. Lucifora J., Xia Y., Reisinger F., Zhang K., Stadler D., Cheng X., Volz T. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus cccDNA. Science, 2014, vol. 343, no. 6176, pp. 1221–1228.
  13. Nassal M. HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. Gut, 2015, vol. 64, no. 12, pp. 1972–1984. doi: 10.1136/gutjnl-2015-309809
  14. Ramanan V., Shlomai A., Cox D.B.T., Schwartz R.E., Michailidis E., Bhatta A., Bhatia S.N. CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus. Sci. Rep., 2015, vol. 5: 10833. doi: 10.1038/srep10833
  15. Seeger C., Sohn J.A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Mol. Ther. Nucleic Acids, 2014, vol. 3: e216. doi: 10.1038/mtna.2014.68
  16. Seeger C., Sohn J.A. Complete spectrum of CRISPR/Cas9-induced mutations on HBV cccDNA. Mol. Ther., 2016, vol. 24, no. 7, pp. 1258–1266. doi: 10.1038/mt.2016.94
  17. Shi H., Lu L., Zhang N.-P., Zhang S.-C., Shen X.-Z. Effect of interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha on hepatitis B virus following lamivudine treatment. World J. Gastroenterol., 2012, vol. 18, no. 27, pp. 3617–3622. doi: 10.3748/wjg.v18.i27.3617
  18. Uusi-Mäkelä M.I.E., Barker H.R., Bäuerlein C.A., Häkkinen T., Nykter M., Rämet M. Chromatin accessibility is associated with CRISPR-Cas9 efficiency in the zebrafish (Danio rerio). PLoS One, 2018, vol. 13, no. 4: e0196238–e0196238. doi: 10.1371/journal. pone.0196238
  19. Verkuijl S.A., Rots M.G. The influence of eukaryotic chromatin state on CRISPR-Cas9 editing efficiencies. Curr. Opin. Biotechnol., 2018, vol. 55, pp. 68–73. doi: 10.1016/j.copbio.2018.07.005
  20. WHO. Global hepatitis report 2017. World Health Organization, 2017.
  21. Yue D., Zhang Y., Cheng L., Ma J., Xi Y., Yang L., Xiang R. Hepatitis B virus X protein (HBx)-induced abnormalities of nucleic acid metabolism revealed by 1 H-NMR-based metabonomics. Sci. Rep., 2016, vol. 6: 24430. doi: 10.1038/srep24430

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2019 Brezgin S.A., Kostyusheva A.P., Simirsky V.N., Volchkova E.V., Chistyakov D.S., Kostyushev D.S., Chulanov V.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».