Analysis of the Phospholipid Transport Nanosystem Structure using Small Angle X-Ray Scattering

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени известен ряд способов доставки лекарственных соединений в организм человека, в частности в органы и определенные клетки-мишени [1, 2]. Исследуют различные транспортные системы на основе разнообразных природных и синтетических полимеров — носителей, имеющих как преимущества, так и недостатки. Наиболее перспективными представляются системы транспорта на основе растительных липидов [3–6]. В Институте биомедицинской химии (ИМБХ, Москва, Россия) разработана и получена фосфолипидная транспортная наносистема (ФТНС) [7, 8]. На основе фосфолипидов сои методом микрофлюидизации получают гомогенную ультрадисперсную эмульсию с ее последующей лиофилизацией. Сухой лиофилизированный порошок при растворении образует тонкодисперсный раствор наночастиц (везикул) [9]. Преимуществами такой системы являются биодеградируемость, комплементарность по отношению к мембранам клеток, сверхмалый размер частиц в эмульсии ФТНС. Поверхность этих наночастиц легко модифицировать для придания тех или иных свойств, в том числе для повышения биодоступности лекарств. В ряде работ было продемонстрировано, что встраивание лекарственных соединений в ФТНС увеличивает терапевтическую эффективность препаратов [10–13]. Поэтому для понимания закономерностей действия ФТНС необходимо выяснить механизмы ее формирования и особенности строения.

Методы малоуглового рассеяния нейтронов и рентгеновских лучей эффективны для исследования структуры ФТНС, что подтверждает ряд экспериментов [14–18], фокус внимания в которых был направлен на определение основных структурных характеристик и диверсификацию способов анализа данных. Ранее были изучены структурные параметры ФТНС при разных концентрациях [17]. Для анализа использовали модель разделенных формфакторов, которая позволила сделать вывод о гидратации липидного бислоя. Был рассчитан гидрофобный объем везикулярного переносчика лекарства, который может служить для размещения водонерастворимых лекарств. Максимальный гидрофобный объем одной везикулы составлял 14.55 × 10⁶ ų при концентрации ФТНС в воде 25% и уменьшался до 6.16 × 10⁶ ų при увеличении концентрации до 37.5%.

Также была замечена корреляция между концентрацией раствора и неравномерным растворением добавляемой мальтозы при гидратации липидов, поэтому необходимы дополнительные исследования с расширением экспериментальных возможностей в опытах на одном и том же образце на разных установках.

В моделях, которые используют для анализа ФТНС, обычно подразумевают одинаковые плотности длин рассеяния внутри везикулы и в окружающем растворе, что не очевидно. В экспериментах с ФТНС возможно неравномерное растворение мальтозы, и концентрация мальтозы снаружи и внутри везикулы может быть разной, что приведет к различию плотностей длин рассеяния в этих областях. Чтобы разрешить эти вопросы, в настоящей работе проведены серии экспериментов с подробным анализом кривых малоуглового рассеяния на везикулах ФТНС и представлены структурные параметры, полученные в ходе обработки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД

Водные дисперсии ФТНС получали в ИМБХ согласно методике [9]. Липоид S100 (5.0 г) суспендировали в водном растворе мальтозы (20 г/100 мл) с получением первичной (грубой) эмульсии в соотношении фосфолипид: сахар 1:4. Грубую эмульсию заливали в приемную емкость микрофлюидизатора M110EH30K (Microfluidics, Westwood, MA, USA) и гомогенизировали в циклическом режиме (семь циклов, 1000 атм., температура эмульсии 45°C). Полученную ультратонкую эмульсию фильтровали с использованием фильтрующей установки YY30 090 00 (Millipore Corporation, Burlington, MA, USA), пропуская через предварительный фильтр из стекловолокна с размером пор 1 мкм и мембранный фильтр с размером пор 0.22 нм.

Концентрации исследуемых растворов ФТНС составляли 20 и 25% (P12, PETRA III, DESY, Гамбург, Германия), а также 25, 31.25 и 37.5% (ДИКСИ, КИСИ, Москва, Россия). Буферный раствор — H₂O. Образцы растворов исследуемых концентраций заливали в разные капилляры (толщиной 2 мм), после чего помещали в специальные держатели. Температура образцов составляла 20°C.

Эксперименты проводили на двух установках. Первая — P12, немецкий электронный синхротрон PETRA III, DESY, Научный центр Гельмгольца, Гамбург, Германия (эксперимент № 1). Расстояние образец–детектор L_sd = 300 см, данные были получены c помощью пиксельного детектора смешанного типа Pilatus, длина волны фотона λ = 0.124405 нм, время экспозиции составляло 0.045 с. Калибровку проводили на воде автоматически. Вторая — экспериментальная станция ДИКСИ Курчатовского источника синхротронного излучения (КИСИ) в Национальном исследовательском центре “Курчатовский институт”, г. Москва (эксперимент № 2). Измерения были выполнены при расстояниях образец–детектор L_sd = 30, 56 и 241.5 см, данные были получены с использованием двумерного детектора MarCCD, длина волны λ = 0.1625 нм, время экспозиции — 300 с. Данные были откалиброваны путем измерений капилляров с водой.

Экспериментальные данные обрабатывали с помощью программы SasView [19]. Расчеты проводили по модели вложенных сфер (core multi shell model), схематично изображенной на рис. 1, где R₀ — внутренний радиус, (R₂ — R₁) — область гидрофобных хвостов D_CH, а (R₁ — R₀) и (R₃ — R₂) — размеры области полярных голов D_PH1 и D_PH2 соответственно, R₀ — внутренний радиус, R₁ — радиус первого слоя, R₂ — радиус второго слоя, R₃ — радиус третьего слоя. Макроскопическое сечение рассеяния в этой модели описывается выражением:

$\begin{array}{c}\frac{d\Sigma }{d\Omega }\left(q, R_0,R_1,R_2,R_3\right)=\\ =\frac{\text{Scale}}{V}{F}^2\left(q, R_0,R_1,R_2,R_3\right)+\text{Bg},\end{array}$ (1)

здесь Scale = nV, n — количество везикул в 1 см³, V — объем, приходящийся на одну везикулу, Bg — уровень некогерентного фона, q — модуль вектора рассеяния:

$q=\frac{4\pi \sin \left(\frac{\theta }{2}\right)}{\lambda }$, (2)

где θ — угол рассеяния падающего пучка,

$\left|q\right|=\left|k-k_0\right|$, (3)

здесь q — вектор рассеяния, k и k₀ — волновые векторы рассеянной и падающей волн соответственно:

$k=\frac{2\pi }{\lambda }$, (4)

где λ — длина волны фотона.

Формфактор F задается следующим уравнением:

V_в

$\begin{array}{c}F\left(q\right)=\frac{3}{V_{в}}\left[V_0\left({\rho }_0- {\rho }_1\right)\right]P\left(q,R_0\right)+V_1\left({\rho }_1- {\rho }_2\right)\times \\ \times \left[V_{1}P\left(q,R_1\right)-V_{0}P\left(q,R_0\right)\right]+V_2\left({\rho }_2- {\rho }_3\right)\times \\ \times \left[V_{2}P\left(q,R_2\right)-V_{1}P\left(q,R_1\right)\right]+V_3\left({\rho }_3- {\rho }_p\right)\times \\ \times \left[V_{3}P\left(q,R_3\right)-V_{2}P\left(q,R_2\right)\right],\end{array}$ (5)

где V_в — объем везикулы, V₀, V₁, V₂ и V₃ — объемы ядра, первого, второго и третьего слоев соответственно, P — формфактор для сферы:

$P\left(q,R_i\right)=\frac{\left[\sin \left(q{R}_i\right) - q{R}_i\text{cos}\left(q{R}_i\right)\right]}{{\left(q{R}_i\right)}^3}$. (6)

Среднеквадратичное отклонение σ от среднего радиуса <R> везикул рассчитывали при помощи распределения Шульца:

$\begin{array}{c}f\left(R\right)=\frac{1}{\text{Norm}}{\left(z+1\right)}^{z+1}\times \\ \times {\left(R\text{/}〈R〉\right)}^z\frac{\text{exp}\left[-\left(z+1\right)R\text{/}〈R〉\right]}{〈R〉\left(z+1\right)},\end{array}$ (7)

Norm — нормировочный коэффициент, который находят при численном расчете, а z — мера ширины распределения:

$z=\left(1-p^2\right)\text{/}{p}^2$, (8)

где p — полидисперсность в программе SasView, заданная выражением:

$PD=p=$ σ/. (9)

 

Рис. 1. Профиль плотности длины рассеяния липидного бислоя в модели “вложенных сфер”: ρcore и ρsolv — плотности длин рассеяния растворов внутри везикулы и снаружи; ρPH1, ρPH2 и ρCH — плотности длин рассеяния областей полярных голов и углеводородных хвостов соответственно; DPH1 и DPH2 — толщины областей полярных голов; DCH и d — толщины области углеводородных цепей и бислоя соответственно.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбранные для изучения везикулярных частиц наиболее подходящие методы малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) и рентгеновских лучей (МУРР) [20–22] позволяют получить точные данные о структуре, прежде всего благодаря изотопному замещению с целью вариации контраста между элементами структуры, когда используют рассеяние нейтронов. Также при частичном дейтерировании есть возможность “подсветить” определенные части образцов. Однако в случае изучения ФТНС у этого метода есть ограничения. Так как в образцах присутствует мальтоза в большом количестве, рассеяние на ней значительно повышает некогерентный фон, следовательно, при использовании МУРН есть ограничения по концентрациям (до 25%).

Рассеяние рентгеновских лучей, в свою очередь, также имеет ряд преимуществ и недостатков. Эксперимент дает возможность более детально определить структуру липидного бислоя, таким образом, можно различить области полярных голов и углеводородных хвостов. К недостаткам же можно отнести те же ограничения по концентрациям, но в данном случае ситуация прямо противоположная. При низких концентрациях образца плотности длин рассеяния ФТНС и воды практически совпадают. Повышение концентрации образца приводит, соответственно, к повышению концентрации мальтозы, которая в свою очередь начинает играть роль “контраста” в данной системе. Концентрации ФТНС, подходящие для изучения этим методом, начинаются с 25% и выше. Таким образом, используя оба этих метода, можно получить структурные параметры транспортных наночастиц при всех концентрациях. Но чаще всего рассматривают фармацевтические концентрации (20–25%), так что остановимся именно на них.

Спектры малоуглового рассеяния рентгеновских лучей были описаны моделью “вложенных сфер”. В табл. 1 представлено содержание мальтозы в ФТНС при различных концентрациях. Учет полидисперсности везикулярной системы с помощью распределения Гаусса показал, что полидисперсность толщины бислоя пренебрежимо мала (сходится к нулю), поэтому в дальнейшем полидисперсность задавали только для внутреннего радиуса везикулы с помощью распределения Шульца.

 

Таблица 1. Содержание мальтозы в ФТНС

Концентрация ФТНС, %	Концентрация мальтозы, %
20	16
25	20
31.25	25
37.5	30

 

Эксперимент на установке P12, DESY

На рис. 2 представлены экспериментальные спектры (точки) и расчетные кривые (линия), полученные в эксперименте № 1. Показано, что выбранная модель может описать экспериментальный спектр, но не идеально: пик в конце кривой плохо поддается обработке (q > 0.3 Å^–1). В табл. 2 и 3 представлены структурные характеристики ФТНС. Радиус везикул ФТНС уменьшается с увеличением концентрации, в то время как толщина липидного бислоя и его составляющих практически не изменяется. Полидисперсность системы также не увеличивается с изменением концентрации (табл. 2).

 

Рис. 2. Экспериментальные кривые малоуглового рассеяния (установка P12, PETRA III) везикул ФТНС при концентрации 20 (а) и 25% (б). Точки — эксперимент, сплошная линия — расчетная кривая.

 

Завышенное значение параметра χ² можно объяснить тем, что используемая модель не учитывает межвезикулярные взаимодействия и поэтому не может хорошо описать начальную часть экспериментальных данных, однако это не влияет существенным образом на характер зависимостей структурных параметров везикул от концентрации ФТНС.

Эксперимент на установке ДИКСИ, КИСИ

Рис. 3 демонстрирует кривые малоуглового рассеяния, полученные в ходе эксперимента № 2. Параметры, полученные в результате анализа, указаны в табл. 4 и 5. На графиках видно, что выбранная модель хорошо описывает экспериментальные спектры. В случае концентраций 25 и 31.25% данные хорошо согласуются. Толщина липидного бислоя изменяется лишь незначительно. В случае концентрации 37.5% наблюдается увеличение толщины области полярных голов D_PH2 на 1.4 Å. Можно предположить, что с ростом концентрации (37.5%) становится существенным взаимодействие везикул, при котором необходимо учитывать структурный фактор (рис. 3в). Также в случае самой высокой концентрации повышается полидисперсность до 0.27, а плотности длин рассеяния везикулы внутри ρ_core и снаружи ρ_solv одинаковые.

 

Рис. 3. Экспериментальные кривые малоуглового рассеяния (установка ДИКСИ) везикул ФТНС при концентрации 25% (а), 31.25% (б) и 37.5% (в). Точки — эксперимент, сплошная линия — расчетная кривая.

 

Из анализа расчета плотности длины рассеяния внутри везикулы можно сделать вывод, что при гидратации системы мальтоза растворяется неравномерно. Разница плотностей длин рассеяния снаружи и внутри везикулы Δρ сокращается при увеличении концентрации от 0.20 × 10^–6 до 0.12 × 10^–6 Å^–2 (P12) и от 0.15 × 10^–6 Å^–2 до нуля (ДИКСИ). Грубый расчет показал, что в эксперименте № 1 внутреннее содержание мальтозы составляет 66 и 50% (при концентрациях ФТНС 20 и 25% соответственно), в эксперименте № 2–58, 43 и 30% (при концентрациях ФТНС 25, 31.25 и 37.5% соответственно). В обоих экспериментах наблюдалось стремление системы к равновесию при увеличении концентрации: разница Δρ = ρ_core — ρ_solv уменьшалась. Это скорее всего связано с возрастающим осмотическим давлением.

Получены большие размеры области полярных голов (D_PH ≈ 13–14 Å), которые превосходят область полярной головы одного чистого фосфолипида (D_PH ≈ 9 Å) примерно в 1.4–1.6 раза [23]. Для уточнения конфигураций и точного расположения молекул требуются дополнительные исследования.

Если сравнивать данные эксперимента № 2 с результатами [17], то можно отметить существенное различие полученных оценок средних размеров везикул (например, для ФТНС 25% в [17] R = 207 ± 2 Å, а для ФТНС 25% в настоящей работе R = 140.7 ± 1.3 Å). Это различие связано с тем, что при анализе данных МУРР были использованы разные модели и разные алгоритмы поиска (анализ проводили с использованием разных программ). Модель, представленная в настоящей работе, позволяет учитывать различие плотностей длин рассеяния раствора внутри и вне везикулы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследована структура везикул ФТНС в области фармацевтических концентраций методом малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Кривые рассеяния обрабатывали с использованием программы SasView в приближении модели “вложенных сфер”. Установлено, что оно достаточно хорошо описывает экспериментальный спектр. Радиус везикул R составил 151 ± 0.02 и 135.70 ± 0.02 Å в эксперименте № 1 (концентрация ФТНС 20 и 25% соответственно) и 140.7 ± 1.3, 134.9 ± 1.1 и 127.9 ± 1.1 Å в эксперименте № 2 (концентрация 25, 31.25 и 37.5% соответственно). При увеличении концентрации ФТНС радиус везикулы уменьшается: 151.01 ± 0.02 Å при концентрации 20% и 127.9 ± 1.1 Å при концентрации 37.5%. Увеличение концентрации ФТНС не сопровождается увеличением толщины липидного бислоя. Важным выводом является, то, что разница плотностей длин рассеяния снаружи и внутри везикулы Δρ (и в процентном содержании мальтозы) сокращается при увеличении концентрации ФТНС. Наблюдаемое уменьшение радиуса и разницы плотностей длин рассеяния можно объяснить возрастающим осмотическим давлением в системе.

Был оценен максимальный гидрофобный объем везикулы, в котором могут размещаться водонерастворимые лекарства. В первом эксперименте он уменьшился от 7.45 × 10⁶ до 6.31 × 10⁶ ų при увеличении концентрации. Максимальный гидрофобный объем одной везикулы в эксперименте № 2 составил 7.19 × 10⁶ ų при концентрации ФТНС в воде 25% и уменьшился до 5.85 × 10⁶ ų при увеличении концентрации до 37.5%.

Следующим шагом усложнения модели может быть учет гидратирования бислоя, т.е. молекулы воды проникают внутрь бислоя.

 

Таблица 2. Результаты расчетов малоугловых спектров везикул ФТНС, полученных на станции P12, PETRA III

ФТНС, %	R, Å	DPH1, Å	DPH2, Å	DCH, Å	d, Å	V, 106 Å3	PD	χ2
20	151.01 ± 0.02	13.76 ± 0.01	13.34 ± 0.01	19.46 ± 0.01	46.56 ± 0.03	7.45	0.24 ± 0.01	7.63
25	135.70 ± 0.02	13.28 ± 0.01	13.00 ± 0.01	19.86 ± 0.01	46.14 ± 0.03	6.31	0.24 ± 0.01	112.92

Примечание. R — внутренний радиус, d — общая толщина липидного бислоя, V — гидрофобный объем везикулы, PD — полидисперсность радиуса.

 

Таблица 3. Плотности длин рассеяния, полученные при анализе данных на станции P12, PETRA III

ФТНС, %	ρsolv, 10–6 Å–2	ρcore, 10–6 Å–2	ρPH1, 10–6 Å–2	ρPH2, 10–6 Å–2
20	9.96 ± 0.01	10.16 ± 0.01	10.95 ± 0.01	10.60 ± 0.01
25	10.08 ± 0.01	10.20 ± 0.01	11.2 ± 0.01	10.3 ± 0.01

Примечание. Плотность длины рассеяния углеводородных хвостов была фиксирована: ρ_CH = 7.8 × 10^–6 Å^–2.

 

Таблица 4. Результаты расчетов малоугловых спектров везикул ФТНС, полученных на станции ДИКСИ

ФТНС, %	R, Å	DPH1, Å	DPH2, Å	DCH, Å	d, Å	V, 106 Å3	PD	χ2
25	140.7 ± 1.3	14.0 ± 0.4	14.0 ± 0.2	20.95 ± 0.07	48.95 ± 0.13	7.19	0.24 ± 0.01	0.27
31.25	134.9 ± 1.1	14.0 ± 0.9	14.0 ± 0.5	20.53 ± 0.06	48.53 ± 0.20	6.54	0.26 ± 0.01	0.41
37.5	127.9 ± 1.1	14.0 ± 1.1	15.4 ± 0.5	20.13 ± 0.06	49.53 ± 1.66	5.85	0.26 ± 0.01	1.36

Примечание. R — внутренний радиус, d — общая толщина липидного бислоя, V — гидрофобный объем везикулы, PD — полидисперсность радиуса.

 

Таблица 5. Плотности длин рассеяния, полученные при анализе данных на станции ДИКСИ

ФТНС, %	ρsolv, 10–6 Å–2	ρcore, 10–6 Å–2	ρPH1, 10–6 Å–2	ρPH2, 10–6 Å–2
25	10.08	10.23 ± 0.05	10.80 ± 0.10	10.70 ± 0.10
31.25	10.27	10.34 ± 0.05	10.84 ± 0.01	10.82 ± 0.01
37.5	10.46	10.46 ± 0.01	10.85 ± 0.16	15.40 ± 0.50

Примечание. Плотности длин рассеяния для раствора и области углеводородных хвостов рассчитаны вручную и были зафиксированы: ρ_CH = 7.8 × 10^–6 Å^–2.

 

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Авторский коллектив выражает благодарность А.Ю. Грузинову за большой вклад в проведение экспериментов. Наработка образцов для анализа выполнена в ИБМХ в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 гг.) (№ 122030100170-5).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

V. А. Maslova

Joint Institute for Nuclear Research

Author for correspondence.
Email: varvara@jinr.ru
Russian Federation, Dubna, 141980

М. А. Kiselev

Joint Institute for Nuclear Research

Email: kiselev@jinr.ru
Russian Federation, Dubna, 141980

P. V. Zhuchkov

Joint Institute for Nuclear Research

Email: varvara@jinr.ru
Russian Federation, Dubna, 141980

Y. A. Tereshkina

Institute of Biomedical Chemistry

Email: varvara@jinr.ru
Russian Federation, Moscow, 119121

E. G. Tikhonova

Institute of Biomedical Chemistry

Email: varvara@jinr.ru
Russian Federation, Moscow, 119121

References

Supplementary files