Изучение влияния производного оксима пиридина (ГИЖ-298) и вальпроата натрия на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в структурах мозга мышей в тесте максимального электрошока

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени накоплен большой объем данных об участии различных нейромедиаторных систем мозга в развитии судорожных состояний. Установлено, что ведущая роль в патогенезе судорожных расстройств принадлежит системам аминацидергической нейропередачи: возбуждающей, нейромедиаторами которой являются глутамат и аспартат, и тормозной, использующей в качестве нейропередатчиков гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК) и глицин [1—4]. Нарушения баланса тормозной и возбуждающей систем приводят к чрезмерной активации ионотропных глутаматных рецепторов NMDA- и AMPA-подтипов. Показано значительное увеличение количества ионотропных NMDA-рецепторов методом ПЭТ в мозге больных эпилепсией, а также у животных в ряде экспериментальных моделей эпилепсии. Данное возрастание сопровождается изменением субъединичного состава рецептора, в основном за счет увеличения кальций-проницаемых субъединиц [5, 6]. Одновременно с этим изменяются характеристики метаботропных глутаматных рецепторов II типа (mGluRII), расположенных на пресинаптической мембране и контролирующих активность глутаматергических синапсов [7, 8]. Подобные количественные и качественные перестройки ионотропных и метаботропных глутаматных рецепторов приводят к повышению интенсивности глутаматергической сигнализации, делая ткани мозга более возбудимыми. При развитии некоторых форм эпилепсии происходит избирательная гибель ГАМКергических тормозных нейронов, что ведет к повышению возбудимости контролируемых ими нервных тканей [9]. Таким образом, снижение или полная утрата ГАМКергического ингибирования при нарушенном балансе регулирующих возбудимость глутаматергических рецепторов увеличивает вероятность генерации возбуждающих постсинаптических потенциалов и синхронизации разрядов и, следовательно, индуцирует эпилептогенез.

В предыдущих исследованиях было установлено, что соединение ГИЖ-298 (оксалат О-2-морфолинэтилоксим 4-бензоилпиридина), синтезированное в Отделе химии ФГБНУ “НИИ фармакологии имени В.В. Закусова”, проявляет противоэпилептическое действие на моделях хронической фокальной эпилепсии и эпилептического статуса, вызванного нейротоксином гомоцистеина тиолактоном, у крыс с кобальт-индуцированным эпилептогенным очагом [10, 11]. Установлен механизм его противосудорожного действия, основанный на способности восстанавливать количество рецепторов D₂ на мембранах стриатума мышей, сниженное в результате нанесения МЭШ. При этом ГИЖ-298 не оказывает влияния на нарушенный судорогами баланс NMDA- и mGluRII-рецепторов в мозге животных [12].

Целью данного исследования явилось изучение участия возбуждающих и тормозных нейротрансмиттерных аминокислот в структурах мозга мышей в механизме антиконвульсивного действия ГИЖ-298 и вальпроата натрия в условиях судорог, вызванных МЭШ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В эксперименте были использованы белые беспородные мыши-самцы, массой 20—26 г, полученные из питомника “Столбовая” ФГБУН НЦБМТ (Московская область) ФМБА России. Животные содержались в соответствии с межгосударственными стандартами ГОСТ 33215—2014 “Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур” (переиздание) и ГОСТ 33216—2014 “Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами” (переиздание).

В эксперименте использован ГИЖ-298 в дозе 60 мг/кг; контрольные животные получали физиологический раствор; в качестве препарата сравнения использовали вальпроат натрия (ВН) в дозе 200 мг/кг. Исследуемые соединения вводили внутрижелудочно, однократно, за 40 мин до проведения максимального электросудорожного шока (МЭШ). Тест МЭШ проводили с помощью установки Rodent Shocker RS 221 (Harvard Apparatus, GmbH), согласно методическим рекомендациям [13]. Электростимуляцию осуществляли разрядом тока с заданными параметрами (50 H, 250 V, 11—12 мА, продолжительность 0.3 с) с помощью специальных корнеальных электродов, смоченных физиологическим раствором и наложенных на глазные яблоки мышей, в результате которой у животных развивались генерализованные судорожные приступы. Использовали балльную систему оценки выраженности судорог: 0 — отсутствие реакций; 1 — клонус без потери рефлекса переворачивания; 2 — клонус с потерей рефлекса переворачивания; 3 — клонико/тонические судороги; 4 — клонико/тонические судороги с гибелью.

Животные были разделены на шесть групп (количество животных в группе указано в скобках): 1 — контроль (n = 9); 2 — контроль МЭШ (n = 9); — ВН (n = 9); 4 — ВН + МЭШ (n = 9); 5 — ГИЖ-298 (n = 9); 6 — ГИЖ-298 + МЭШ (n = 9).

Мышей через 5 мин после нанесения МЭШ декапитировали и на льду извлекали структуры мозга: фронтальная кора (ФК), гипоталамус (ГПТ), стриатум, гиппокамп (ГПК).

Определение содержания тормозных (ГАМК, глицин, таурин) и возбуждающих (аспартат, глутамат) нейромедиаторных аминокислот проводили методом ВЭЖХ/ФД согласно модифицированной методике [14]. Перед анализом ткань гомогенизировали в 1 мл 0.1 н HClO₄ замороженные в жидком азоте и взвешенные биологические пробы в 5 мл гомогенизаторе тефлон-стекло. Затем образцы центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин. К 0.025 мл супернатанта добавляли 0.05 мл 0.1 н NaОН и 0.025 мл ортофталевого реагента для запуска реакцию дериватизации. Через 20 мин 20 мкл полученного деривата подвергали хроматографическому разделению. ГАМК, аспартат, глутамат, таурин, глицин в начальной концентрации 1.0 мкМ/мл в 0.1 н НClО₄ использовали в качестве стандартной смеси для калибровки. Регистрацию продуктов разделения проводили на хроматографе с флуоресцентным детектором Agilent 1100 (США) с аналитической колонкой HYPERSIL ODS (4.6 × 250 мм, 5 мкм) (длина волны возбуждения — 230 нм, длина волны испускания — 392 нм). Подвижная фаза для определения нейромедиаторных аминокислот состояла из 0.06 M NaH₂PO₄ ∙ H₂O, 0.0032 M Na₂HPO₄, 0.025 mМ ЭДТА и 1.24 mM CH₃OH, pH = 5.6 [14]. Скорость подвижной фазы составляла 1.5 мл/мин. Регистрация образцов проводилась с применением аппаратно-программного комплекса Agilent ChemStation v.B.04.02

Статистическую обработку полученных данных проводили после проверки на нормальность распределения по критерию Шапиро—Уилка, используя Excel Stat 2014, Statistica 10. Достоверность отличий между группами определяли методом двухфакторного дисперсионного анализа (АNOVA) с последующим post-hoc-тестом Ньюмана—Кейлса. Данные, измеренные в бинарных шкалах, обрабатывали с помощью критерия точной вероятности Фишера с учетом множественности сравнений. Во всех случаях результаты считали статистически значимыми при p < 0.05. Полученные результаты представляли в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Данные по противосудорожному эффекту веществ обрабатывали с помощью непараметрического аналога дисперсионного анализа по Краскелу—Уоллису с дальнейшей обработкой методом множественных сравнений по Данну.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Максимальный электрошок (МЭШ) вызывал развитие клонико-тонических судорог у 89% мышей в контрольной группе, получивших физиологический раствор. ГИЖ-298 в дозе 60 мг/кг при пероральном введении препятствовал развитию тонических судорог, уменьшая количество животных с тонической экстензией конечностей до 11% и снижая средний балл интенсивности судорог до 1.56 (в контроле — 3.17). ВН (200 мг/кг) при пероральном введении предотвращал развитие тонической фазы судорог у 78% мышей, снижая выраженность судорожных проявлений до 2.3 балла (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние ГИЖ-298 (60 мг/кг) на интенсивность судорог, вызванных МЭШ, в сравнении с вальпроатом натрия (ВН, 200 мг/кг)

Группа животных	Доза, мг/кг /внутрь	Выраженность судорожных реакций в баллах	% животных с тонической экстензией конечностей
Контроль МЭШ	—	3.17 ± 0.16	89 (8/9)
ВН + МЭШ	200	2.33 ± 0.27*	22 (2/9)*
ГИЖ-298 + МЭШ	60	1.56 ± 0.28**	11 (1/9)**

Примечание: *При р < 0.05. **При р < 0.01 — достоверность отличий относительно группы контроля с МЭШ.

 

Исследование нейрохимических изменений в мозге контрольных животных, получавших физиологический раствор, проведено через 5 мин после проведения МЭШ и развития тонико-клонических судорог. Установлено, что в ФК и стриатуме процедура МЭШ не вызвала каких-либо изменений содержания нейротрансмиттерных аминокислот (табл. 2—4). В гипоталамусе отмечалось снижение уровней аспартата (на 20.8%), глицина (на 16.8%), ГАМК (на 20.3%) и соотношения ГАМК/глутамат (на 15.5%), а также наблюдалась тенденция к уменьшению содержания таурина (см. табл. 3). В гиппокампе процедура МЭШ вызывала уменьшение концентрации глутамата (на 16.7%), глицина (на 16.1%) и таурина (на 20.1%) (табл. 5).

 

Таблица 2. Эффекты ГИЖ-298 на содержание нейротрансмиттерных аминокислот во фронтальной коре в сравнении с вальпроатом натрия (ВН, 200 мг/кг) в тесте МЭШ (мкмоль/г ткани)

Препарат	Аспартат	Глутамат	Глицин	Таурин	ГАМК	ГАМК/ Глутамат
Контроль	16.681 ± 1.615	20.544 ± 1.526	0.986 ± 0.067	4.924 ± 0.181	0.821 ± 0.078	0.042 ± 0.005
ВН	18.396 ± 2.683	24.793 ± 2.028	1.939 ± 1.00	5.597 ± 0.956	1.724 ± 0.912	0.056 ± 0.021
ГИЖ-298	13.291 ± 1.65	17.075 ± 1.23	0.780 ± 0.05*	4.170 ± 0.17*	0.623 ± 0.05	0.041 ± 0.00
МЭШ	14.292 ± 1.347	17.35 ± 1.367	0.877 ± 0.128	4.569 ± 0.349	0.925 ± 0.128	0.052 ± 0.004
ВН + МЭШ	17.071 ± 1.978	21.801 ± 1.869	0.868 ± 0.053	5.019 ± 0.395	1.064 ± 0.109	0.051 ± 0.006
ГИЖ-298+ МЭШ	15.871 ± 1.09	17.374 ± 1.08	0.733 ± 0.02	4.180 ± 0.27	0.854 ± 0.06	0.052 ± 0.01

Примечание: *Достоверность различий по сравнению с контролем при р < 0.05.

 

Таблица 3. Эффекты ГИЖ-298 на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в гипоталамусе в сравнении с вальпроатом натрия (ВН, 200 мг/кг) в тесте МЭШ (мкмоль/г ткани)

Препарат	Аспартат	Глутамат	Глицин	Таурин	ГАМК	ГАМК/ Глутамат
Контроль	12.026 ± 0.469	14.476 ± 0.583	1.469 ± 0.046	2.829 ± 0.164	2.331 ± 0.128	0.161 ± 0.006
ВН	9.757 ± 0.335*	15.445 ±0.492	1.568 ± 0.076	2.991 ± 0.200	2.664 ± 0.187	0.172 ± 0.009
ГИЖ-298	12.600 ± 0.48	15.911 ± 0.50	1.492 ± 0.08	3.130 ± 0.18	2.349 ± 0.15	0.152 ± 0.01
МЭШ	9.529 ± 0.281*	13.632 ± 0.343	1.251 ± 0.049*	2.421 ± 0.139	1.858 ± 0.082*	0.136 ± 0.004*
ВН + МЭШ	8.932 ± 0.847	14.935 ± 0.346	1.472 ± 0.122	2.755 ± 0.216	2.437 ± 0.222#	0.162 ± 0.008#
ГИЖ-298 + МЭШ	11.834 ± 0.46#	15.375 ± 0.69	1.634 ± 0.11#	3.359 ± 0.25#, *	2.590 ± 0.19#, *	0.167 ± 0.01#

Примечание: *Достоверность различий по сравнению с контролем при р < 0.05. ^#Достоверность различий по сравнению с группой мышей, получавшей МЭШ, при р < 0.05.

 

Таблица 4. Эффекты ГИЖ-298 на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в стриатуме в сравнении с вальпроатом натрия (ВН, 200 мг/кг) в тесте МЭШ (мкмоль/г ткани)

Препарат	Аспартат	Глутамат	Глицин	Таурин	ГАМК	ГАМК/ Глутамат
Контроль	11.350 ± 0.630	17.202 ± 0.977	1.084 ± 0.064	7.495 ± 0.394	1.504 ± 0.009	0.088 ± 0.004
ВН	8.360 ± 0.680*	17.062 ± 1.011	1.158 ± 0.101	7.404 ± 0.681	1.459 ± 0.104	0.087 ± 0.005
ГИЖ-298	10.160 ± 0.64	16.943 ± 0.61	1.158 ± 0.09	8.887 ± 0.73	1.801 ± 0.16	0.111 ± 0.01
МЭШ	11.348 ± 0.377	15.702 ± 0.449	1.082 ± 0.046	7.191 ± 0.331	1.505 ± 0.049	0.097 ± 0.005
ВН + МЭШ	8.529 ± 0.346#	15.295 ± 0.448	1.072 ± 0.062	6.771 ± 0.394	1.565 ± 0.098	0.103 ± 0.007
ГИЖ-298 + МЭШ	10.578 ± 0.56	15.178 ± 0.39	1.055 ± 0.04	6.956 ± 0.32	1.677 ± 0.15	0.110 ± 0.01

Примечание: *Достоверность различий по сравнению с контролем при р < 0.05. ^#Достоверность различий по сравнению с группой мышей, получавшей МЭШ, при р < 0.05.

 

Таблица 5. Эффекты ГИЖ-298 (60 мг/кг) на содержание нейротрансмиттерных аминокислот в гиппокампе в сравнении с вальпроатом натрия (ВН, 200 мг/кг) в тесте МЭШ (мкмоль/г ткани)

Препарат	Аспартат	Глутамат	Глицин	Таурин	ГАМК	ГАМК/ Глутамат
Контроль	10.313 ± 0.379	18.402 ± 0.400	1.152 ± 0.039	5.848 ± 0.142	1.197 ± 0.064	0.065 ± 0.004
ВН	6.675 ± 0.638*	15.225 ± 1.376	0.949 ± 0.109	4.704 ± 0.530	1.092 ± 0.117	0.071 ± 0.003
ГИЖ-298	9.394 ± 0.59	17.693 ± 0.80	1.060 ± 0.04	5.602 ± 0.17	1.265 ± 0.04	0.072 ± 0.00
МЭШ	9.071 ± 0.560	15.322 ± 0.922*	0.966 ± 0.057*	4.637 ± 0.301*	1.095 ± 0.060	0.072 ± 0.003
ВН + МЭШ	6.344 ± 0.652#	14.370 ± 1.568	0.858 ± 0.103	4.649 ± 0.565	1.123 ± 0.131	0.077 ± 0.003
ГИЖ-298 + МЭШ	9.244 ± 0.43	15.467 ± 0.86	0.972 ± 0.06	4.934 ± 0.36	1.156 ± 0.08	0.078 ± 0.00

Примечание: *Достоверность различий по сравнению с контролем при р < 0.05. ^#Достоверность различий по сравнению с группой мышей, получавшей МЭШ, при р < 0.05.

 

В ФК мышей, предварительно получавших ВН, как подвергавшихся МЭШ, так и тех, которым не наносилось электрошоковое воздействие, не отмечалось статистически достоверных изменений уровней аминокислот (см. табл. 2). ВН вызывала снижение содержания аспартата в трех структурах мозга: в стриатуме (на 26.3%), гипоталамусе (на 18.9%) и гиппокампе (на 35.3%) (см. табл. 3—5). Предварительное введение ВН перед МЭШ препятствовало снижению уровней ГАМК и соотношения ГАМК/глутамат в гипоталамусе (см. табл. 3).

ГИЖ-298 в ФК снижал содержание глицина и таурина у интактных мышей (см. табл. 2). В гипоталамусе ГИЖ-298 препятствовал вызванному МЭШ снижению содержания аспартата, глицина, таурина и ГАМК, восстанавливая баланс ГАМК/глутамат (см. табл. 3). При этом уровни ГАМК и таурина были значимо выше значений контрольной группы животных без МЭШ. В стриатуме и гиппокампе эффектов ГИЖ-298 ни на один из исследуемых показателей не наблюдалось (см. табл. 4 и 5).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время механизмы действия многих антиконвульсантов связывают с их воздействием на содержание тормозных аминокислот, в первую очередь ГАМК. В частности, было показано, что вальпроевая кислота вызывает увеличение содержания ГАМК в структурах мозга [15] и высказано предположение, что наблюдавшийся эффект реализуется путем увеличения активности глутаматдекарбоксилазы — основного фермента, лимитирующего синтез ГАМК [16]. Согласно другой гипотезе вальпроевая кислота усиливает нейрональную чувствительность к ГАМК [17]. Современными методами молекулярной генетики было выявлено, что основными мишенями вальпроевой кислоты являются субъединицы рецептора ГАМК-А, в частности β2- субъединица. Показано, что клонированный вариант рецептора β2L51M при нанесении судорожного разряда снижает величину стимулированных ГАМК электрических потоков, а введение вальпроевой кислоты на этом фоне усиливает амплитуду и частоту токов [18]. Существуют убедительные доказательства вовлеченности глутаматергической системы в механизме действия антиконвульсантов. К числу антиконвульсантов, способных подавлять высвобождение глутамата и аспартата, вызванное МЭШ, относится ламотриджин, широко используемый в клинике судорожных расстройств [19].

Известно, что нанесение МЭШ вызывает высвобождение возбуждающих аминокислот (в частности, глутамата) в структурах мозга на пике судорожных реакций [3]. В наших исследованиях через 5 мин после МЭШ наблюдается снижение уровней возбуждающих аминокислот — аспартата (на 20.8%) в гипоталамусе и глутамата (на 16.7%) в гиппокампе и снижение тормозных аминокислот — глицина, ГАМК, таурина в среднем на 16—20%, что свидетельствует об истощении аминацидергической нейропередачи в данных структурах.

Противосудорожное действие ГИЖ-298 при однократном введении в дозе 60 мг/кг сопровождается полным восстановлением содержания тормозных аминокислот глицина, таурина и ГАМК в гипоталамусе и баланса соотношения ГАМК/глутамат. ГИЖ-298 также препятствует вызванному судорогами истощению аспартата в гипоталамусе и глутамата в гиппокампе. Действие вальпроата натрия при однократном введении в дозе 200 мг/кг в условиях теста МЭШ было направлено на восстановление содержания ГАМК и соотношение ГАМК/глутамат в гипоталамусе, что согласуется с данными литературы [16]. Кроме того, вальпроат натрия снижает возбудимость нервной системы у интактных животных за счет уменьшения уровней аспартата в гипоталамусе, стриатуме и гиппокампе. Это согласуется с данными Morland и соавт., наблюдавшими значительное снижение содержания аспартата (на 63—68%) в окончаниях возбуждающих нервов через 30 мин после введения вальпроевой кислоты [21].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, установлено, что после судорожного припадка, вызванного МЭШ, наблюдается снижение уровней тормозных аминокислот ГАМК и глицина в гипоталамусе, таурина и глицина в гиппокампе и нарушается баланс ГАМК/глутамат в гипоталамусе. ГИЖ-298 оказывает выраженное противосудорожное действие и восстанавливает нарушенный баланс ГАМК/глутамат, а также содержание тормозных аминокислот ГАМК, таурина и глицина в гипоталамусе. Противосудорожный эффект вальпроата натрия сопровождается восстановлением содержания в тканях гипоталамуса ГАМК и соотношения ГАМК/глутамат, при этом наблюдается снижение синтеза возбуждающей аминокислоты аспартата в стриатуме, гиппокампе и гипоталамусе.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках бюджетной тематики ФГБНУ “НИИ Фармакологии имени В.В. Закусова” (тема FGFG-2022-0004 “Поиск и разработка новых фармакологических средств лечения эпилепсии, расстройств аутистического спектра и болезни Паркинсона”).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Этическое одобрение. Организация и проведение работ осуществлялись в соответствии с протоколом Совета Евразийской экономической комиссии от 3 ноября 2016 г. № 81 “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств”. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБНУ “НИИ фармакологии имени В.В. Закусова” (протокол № 7 от 7 июня 2022 г.).

Об авторах

В. Б. Наркевич

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”

Автор, ответственный за переписку.
Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва

С. А. Литвинова

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”

Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва

К. А. Касабов

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”; ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва; Москва

А. А. Яковлева

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”

Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва

В. С. Кудрин

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”

Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва

Т. А. Воронина

ФГБНУ “ФИЦ оригинальных и перспективных биомедицинских и фармацевтических технологий”

Email: narvik@yandex.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы