Rapid adaptive regulation of systemic circulation is suppressed in pulmonary

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Состояние, сопровождающееся значительно увеличенным средним давлением в легочных артериях, повышенным правожелудочковым систолическим давлением, гипертрофией правого желудочка, обструктивными изменениями сосудов в легких, а также снижением перфузии в малом круге кровообращения, определяется как легочная артериальная гипертензия (ЛАГ) [1]. Исследованию ЛАГ посвящено значительное количество работ [2], большинство из которых направлено на изучение функциональных и структурных перестроек в малом круге кровообращения. Тем не менее ремоделирование и дисфункция малого круга кровообращения при ЛАГ приводит к изменению системной гемодинамики. При ЛАГ наблюдается ослабление способности сосудов большого круга развивать и поддерживать тонус [3], ЛАГ приводит к нарушению регионального кровотока, микроциркуляции в целом ряде сосудистых бассейнов организма [4–7] за счет перестройки локальных механизмов стабилизации давления [4, 8]. Известно, что ЛАГ сопровождается увеличением активности ренин-альдостерон-ангиотензиновой системы (РААС), повышением тонуса симпатического отдела (СНС) вегетативной нервной системы (ВНС) [9, 10], ростом уровня циркулирующего адреналина, ангиотензина-II (АТII) [11]. Также при ЛАГ наблюдается повышение уровня вазопрессина, что синергично с альдостероном способствует реабсорбции ионов натрия, увеличению объема циркулирующей жидкости [12] и оказывает влияние на долгосрочную регуляцию системной гемодинамики.

Накапливаются данные, указывающие на перестройку механизмов немедленной регуляции гемодинамики в большом круге при ЛАГ. Барорецепторная реакция (БРР), обусловленная сдвигом баланса активности парасимпатического и симпатического отделов ВНС, является центральным элементом системы, отвечающей за немедленную, рефлекторную координацию сердечного выброса и артериального давления (АД).

Установлено, что у пациентов с ЛАГ наблюдается существенное снижение вариабельности сердечного ритма (ВСР), проявляющееся в уменьшении кумулятивной спектральной мощности (КСМ). Уменьшение ВРС связывают с ослаблением вегетативного контроля ЧСС и рассматривают как один из прогностических признаков ЛАГ [10, 13, 14].

Более того, в клинических исследованиях показано, что степень нарушения вегетативной регуляции ЧСС у пациентов пропорциональна тяжести ЛАГ [10, 13]. Ослабленная связь флуктуаций ЧСС и АД наблюдается у пациентов с ЛАГ при спонтанных и вызванных отклонениях АД. Для пациентов с ЛАГ также характерно увеличение длительности периода восстановления ЧСС покоя после физической нагрузки [15, 16]. Проба Вальсальвы при ЛАГ вызывает обмороки, увеличивает риск внезапной сердечной смерти [17], что также указывает на ослабленную способность к стабилизации ЧСС со стороны ВНС. Подавленный быстрый контроль ЧСС, вероятно, является причиной увеличенной подверженности аритмиям пациентов с ЛАГ [18]. Совокупность имеющихся сведений позволяет предположить, что ЛАГ затрагивает БРР и сопровождается т. н. барорефлекторной дисфункцией [19].

Однако остается неизвестным, в какой степени и какой именно компонент барорецепторной регуляции системной гемодинамики и ЧСС изменен или подавлен, а также каково соотношение активности симпатического и парасимпатического отделов ВНС при ЛАГ.

В данной работе впервые прямо исследуется функционирование барорецепторного рефлекса, диапазон колебаний ЧСС, возникающих в ответ на вазоконстрикторные либо вазодилятаторные стимулы, в экспериментальной in vivo модели ЛАГ. Так как активность симпатического отдела ВНС, чувствительность тканей к адренергическим воздействиям подвержены модуляции РААС, в данной работе изучено влияние АТII на барорецепторный контроль ЧСС в условиях легочной гипертензии.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные

Работа выполнена с использованием крыс (самцы стока Wistar, 2–4 месяца, 290 ± 30 г, 25 животных), полученных из питомника «Столбовая» (Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России). В ходе экспериментов были соблюдены все актуальные требования этических норм работы с лабораторными животными. Перед экспериментами животных содержали в виварии течение 2 недель в стандартных условиях при световом режиме 12 : 12 с доступом к воде и пище ad libitum. В течение 5 недель после вживления катетеров и индукции ЛАГ животных содержали в тех же условиях, но в индивидуальных клетках.

Катетеризация

Для хронической регистрации АД, ЧСС и инфузии вазоактивных соединений крысам контрольной и экспериментальной групп вживляли один внутриартериальный и два внутривенных комбинированных полиуретановых катетера (Instechlabs, США), подключенных к трехканальным устройствам сосудистого доступа (УСД, VABR3B/22, Instechlabs, США). Катетеризацию осуществляли стандартным способом наркотизированным животным (золетил-100, в. б., 0.1 мл на 100 г массы тела) по методике, описанной ранее [3].

Регистрация среднего артериального давления и ЧСС

Среднее артериальное давление (САД) и ЧСС регистрировали в модифицированной установке для работы с бодрствующими животными прямым методом, как описано ранее [3]. В эксперимент животных брали по окончании периода восстановления через 6 суток после вживления катетеров. Для регистрации САД артериальный катетер и УСД подключали к датчику давления (Gould Statham 23PB, США) и мостовому усилителю (Biograph-4, Россия), сигнал от которого поступал на АЦП (National Instruments, США). Запись сигналов осуществляли с помощью ПО (National Instruments, LabView RunTime Engine) с частотой 10 КГц. Для предотвращения тромбообразования в артериальном катетере осуществляли его промывку 10%-ным раствором гепарина (5000 Ед) в физиологическом растворе (1–1.5 мкл/мин).

Индукция и верификация ЛАГ

Для индукции ЛАГ использовали стандартный подход [20], основанный на однократном введении монокроталина (МКТ, Sigma Aldrich, подкожно, 60 мг/кг, 0.3 мл). Индивидуальную навеску МКТ готовили непосредственно перед введением и растворяли в физиологическом растворе с титрованием 0.1 нормальной HCl до полного растворения осадка (pH раствора МКТ доводили до 7 титрованием 0.2 Н NaOH). Животным контрольной группы вводили физиологический раствор (0.3 мл). ЛАГ индуцировали только у тех животных, которые через 6 суток после вживления катетеров демонстрировали нормальный уровень САД (100 ± 10 мм рт. ст.), ЧСС покоя (360 ± 30 уд/мин), ректальную температуру 37 ± 0.5 ^оС, а также суточный объем потребляемой жидкости (30 ± 10 мл). Формирование ЛАГ подтверждали, выявляя структурные и функциональные признаки гипертрофии правого желудочка методом эхокардиографии с помощью УЗИ-аппарата Visual Sonics VEVO 1100 с линейным датчиком MS250 (диапазон частот 12–24 МГц), как описано ранее [3].

Инфузия вазоактивных соединений и протоколы экспериментов

Инфузию вазоактивных соединений осуществляли через внутривенные катетеры, подключенные к УСД при помощи шприцевых программируемых инфузионных помп (Harvard Apparatus Pump 11 Elite Infusion/Withdrawal, США) со шприцами Hamilton 1002 TLL (2.5 мл, байонетный затвор), воспроизводя протокол повышения концентраций фенилэфрина (ФЭ) и нитропруссида натрия (НП) из [21] c изменениями, перечисленными ниже.

По окончании постоперационного периода восстановления, а также на 28-й (рис. 1a) день после инъекции МКТ после 30-минутного периода адаптации и контрольной записи САД / ЧСС животным вводили раствор нитропруссида натрия (1 мкг/кг/мкл, в физиологическом растворе, Sigma Aldrich) с линейно нарастающей скоростью инфузии («рамповое» введение) от 7 до 40 мкг/кг/мин за 3.5 мин (суммарный объем – 82.25 мкл, рис. 1b). Затем дожидались возвращения САД и ЧСС (20–25 мин) к контрольному уровню и осуществляли введение агониста α1-адренорецепторов (α1-АР) фенилэфрина (1 мкг/кг/мкл в физиологическом растворе, Sigma Aldrich) с линейно нарастающей скоростью инфузии от 5 до 35 мкг/кг/мин за то же время, что и НП (суммарный объем – 70 мкл, рис. 1b). Через час животным вводили раствор атропина (1 мг/кг, в/в, 0.3 мл) для блокады парасимпатической компоненты барорецепторного рефлекса. Инфузию ФЭ и НП осуществляли повторно, но на фоне атропина (рис. 1с).

 

Рис. 1. (a) – схема экспериментальных воздействий в группах при моделировании ЛАГ. Светло-синий – формирующаяся ЛАГ (2 недели), синий – сформированная ЛАГ (4 недели). Красная штриховка – инфузия ангиотензина II. Фиолетовая штриховка – инфузия атропина. МКТ – монокроталин. (b) – схематическое представление вазомоторных ответов в сосудистом русле большого круга кровообращения при оценке барорецепторной реакции (БРР). (c) – схема, демонстрирующая последовательность применения вазомоторных соединений при оценке БРР. САД – среднее артериальное давление, НП – нитропруссид натрия, ФЭ – фенилэфрин.

 

В части экспериментов на следующие сутки повторяли эксперимент, но введение вазоактивных соединений и атропина осуществляли на фоне непрерывной инфузии ангиотензина II, который добавляли в промывочную смесь для артериального катетера (АТII, 1.5 нг/кг/мин, в/в, в 1%-ном растворе БСА в физиологическом растворе, 2.5%-ный раствор гепарина 5000 Ед, суммарный объем ~ 400–500 мкл). Инфузию ATII начинали за 60 мин до введения НП (рис. 1). Для инфузии НП / ФЭ использовали два отдельных внутривенных катетера.

Оценка диапазона и чувствительности барорефлекторной реакции

В ходе периода «рампового» введения НП или ФЭ вычисляли пары значений САД и ЧСС для каждого кардиоцикла (рис. 2a). Последовательные пары значений САД и ЧСС использовали для построения регрессионной кривой барорецепторной реакции (кривой «САД-ЧСС», рис. 2b). Для получения регрессионной кривой использовали специализированное ПО («Data Processing», Лукошкова), реализованное в среде LabView и основанное на ранее описанных численных методах аппроксимации [22, 23] и алгоритмах Левенберга – Марквардта. Четырехпараметрическая логистическая регрессионная кривая имеет уравнение вида:

$y\left(x\right)=c+\frac{d-c}{1+\exp \left(b\left(x-\tilde{e}\right)\right)},$

где $\tilde{e}$ – значение по оси абсцисс для точки перегиба кривой, b – коэффициент крутизны кривой, c – наименьшее асимптотическое значение, интерпретируемое как наименьшее достижимое (минимальное) значение ЧСС (ЧСС_min), d – наибольшее асимптотическое значение, интерпретируемое как наибольшее достижимое (максимальное) значение ЧСС (ЧСС_max), наблюдаемое при индукции барорецепторной реакции ФЭ и НП [21]. Асимптотические значения регрессионной кривой использовали для минимизации межиндивидуальной вариабельности широты диапазона отклонений САД и ЧСС при действии вазоактивных соединений.

 

Рис. 2. (a) – репрезентативные записи, получаемые при последовательном анализе кардиоциклов и демонстрирующие синхронные отклонения САД и ЧСС при рамповом внутривенном введении животным нитропруссида (НП, голубой) или фенилэфрина (ФЭ, красный). (b) – репрезентативный пример кривой барорецепторной реакции (БРР), получаемой при логистической аппроксимации рефлекторного изменения ЧСС, вызванного введением нитропруссида и фенилэфрина. Показаны рассчитываемые характеристические параметры БРР. Горизонтальными линиями показаны наибольшее (сверху) и наименьшее (снизу) асимптотические значения, интерпретируемые как максимальное и минимальное значения ЧСС.

 

В качестве индекса чувствительности барорецепторной реакции (ИЧ_БРР) использовали максимальное значение производной регрессионной кривой БРР. Используя регрессионную кривую, также рассчитывали диапазон барорефлекторной реакции (А_БРР) как разницу между ЧСС_max и ЧСС_min. Определяли ЧСС покоя как среднее значение ЧСС за 1 мин, наблюдаемое за 1 мин до введения вазоактивных соединений. Также рассчитывали величину рефлекторной тахикардии (ТК_БРР) и брадикардии (БК_БРР) как разность между ЧСС_max или ЧСС_min и ЧСС покоя.

Статистический анализ

Для статистической обработки данных использовали программную среду R [24]. В тех случаях, когда в индивидуальных кривых БРР после аппроксимации параметры (ЧСС_{min, max} и др.) принимали аномальные значения, использовали соответствующие значения параметров из нелинейной модели со смешанными эффектами. В данном случае подготовка результатов осуществлялась средствами пакета tidyverse [25]. Построение нелинейной модели логистических кривых со смешанными эффектами [26] производили средствами пакета nlme [27] с использованием уравнения убывающей логистической функции SSdlf из пакета nlraa [28] в 3 этапа: предварительная аппроксимация отдельных кривых (функции nlsLMlist, пакет nlraa), построение на их основе усредненной кривой (функция nlme); построение смешанной модели, включающей в себя кривые для каждой группы, с использованием параметров усредненной кривой [29].

Для статистического анализа характеристических показателей БРР строили линейные модели со смешанными эффектами с помощью пакета lme4 [30], что позволяло оценивать значимость различий в связанных и несвязанных группах. Проверка статистических гипотез для коэффициентов модели выполнялась с применением тестов Вальда и t-тестов, степени свободы для которых рассчитывались по методу Саттеруайта, средствами пакета emmeans [31]. Различия между группами принимали значимыми при p < 0.05. Для ИЧ_БРР проверка статистических гипотез и расчет доверительных интервалов производили на основе логарифмически трансформированных данных (на рисунках для ИЧ_БРР доверительные интервалы показаны без обратной трансформации). Для расчета стандартных ошибок и доверительных интервалов в линейных моделях использовался пакет clubSandwicth [32] c поправкой для малых выборок «CR1» [33]. Поправку на множественные сравнения производили по методу Холма средствами пакета multcomp [34].

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего [нпДИ; впДИ], где нпДИ и впДИ – нижний и верхний пределы доверительного интервала. Для графического представления результатов анализа использовали пакеты ggplot2 [35], gghalves [36], ggdist [37] и patchwork [38] среды R.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние ЛАГ на рефлекторную тахикардию, брадикардию, диапазон и чувствительность барорецепторного рефлекса

В наших экспериментах введение вазоконстриктора (ФЭ) с постепенно нарастающей скоростью приводило к немедленному, градуальному повышению САД, а также снижению ЧСС за счет индукции барорецепторного рефлекса. В свою очередь, рамповое введение вазодилятатора (НП) приводило к немедленному снижению САД и росту ЧСС. Дозозависимое рефлекторное изменение ЧСС, вызванное введением вазоактивных соединений, имело типичный сигмоидальный характер (рис. 3a). Наибольшая достижимая ЧСС у крыс контрольной группы в начале эксперимента составляла 512.17 ± 16.7 [478.9; 545.5], а наименьшая – 289.5 ± 13.7 [262.6; 316.4] уд/мин (рис. 3a, панель «исходно»). Диапазон барорефлекторной реакции у крыс контрольной группы составлял 204.0 ± 16.7 [170.9; 237.1] уд/мин (рис. 3b, табл. 1).

 

Рис. 3. Влияние ЛАГ на барорефлекторное изменение ЧСС и характеристики барорецепторной реакции. (a) – кривые барорецепторной реакции (БРР), полученные с использованием нелинейной модели со смешанными эффектами. Зеленым цветом обозначены кривые для контрольной («контроль») группы животных (для момента начала – «исходно», через 4 недели после начала эксперимента – «4-я нед»), а оранжевым – для группы «ЛАГ», т.е. животных до введения и через 4 недели после введения МКТ. Тонкими линиями показаны аппроксимированные кривые для отдельных экспериментов (животных); полупрозрачными лентами обозначены доверительные интервалы. На графиках указаны аппроксимированные значения ЧСС покоя и максимально достижимые пределы ЧСС. ЧСС покоя, пределы ЧСС, а также стандартная ошибка среднего значения для этих величин отмечены цветными горизонтальными отрезками на оси ординат. Панели представлены в одинаковом масштабе по обеим осям. (b) – диапазон барорецепторной реакции. (c) – рефлекторная тахикардия. (d) – рефлекторная брадикардия. (e) – индекс чувствительности БРР. На панелях (b – e) приведены точные значения р (t-тест); доверительный интервал (CI) и стандартная ошибка среднего (SE) показаны интенсивностью цвета. Кумулятивные плотности распределения для групп показаны слева в виде оранжевых (ЛАГ) и зеленых (контроль) огибающих контуров. Описательные характеристики выборок (верхний и нижний квартиль, медиана) показаны горизонтальными линиями на контуре. Индивидуальные значения показаны серыми точками. На панелях приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего для каждой группы.

 

Таблица 1. Характеристические значения ЧСС и параметров барорецепторной реакции в группе контрольных животных (контроль), получавших в начале эксперимента физиологический раствор, а также в группе животных, получавших в начале эксперимента раствор МКТ (ЛАГ) и сформировавших к 4-й неделе признаки ЛАГ (правая колонка)

период эксперимента	исходно		4-я неделя
группа / параметр БРР	контроль (перед введением ф. р-ра)	ЛАГ (перед введением МКТ)	контроль (4 нед после введения ф. р-ра)	ЛАГ (4 нед после введения МКТ)
ЧССmax	512.2 ± 17.0 [478.9; 545.5]	515.2 ± 18.5 [478.9; 551.6]	627.1 ± 28.5 [571.2; 682.9]	440.1 ± 18.5 [403.9; 476.3]
ЧССmax: ATII	512.0 ± 16.3 [480.1; 544.0]	525.1 ±1 8.7 [488.5; 561.7]	491.0 ± 22.7 [446.5; 535.5]	403.9 ± 21.1 [362.5; 445.3]
ЧСС покоя	353.1 ± 8.0 [337.2; 369.0]	352.5 ± 6.9 [338.8; 366.2]	309.1 ± 6.9 [295.3; 322.9]	344.7 ± 15.1 [314.6; 374.8]
ЧСС покоя: ATII	355.5 ± 11.1 [333.4; 377.7]	357.5 ± 10.7 [336.1; 378.8]	334.3 ± 10.8 [312.8; 355.9]	343.0 ± 15.0 [313.2; 372.8]
ЧССmin	289.5 ± 13.7 [262.6; 316.4]	301.8 ± 14.7 [273.0; 330.7]	207.8 ± 17.7 [173.1; 242.5]	258.7 ± 14.9 [229.4; 288.0]
ЧССmin: ATII	277.8 ± 13.1 [252.2; 303.4]	262.7 ± 15.0 [233.3; 292.0]	162.9 ± 20.7 [122.3; 203.4]	292.4 ± 17.3 [258.5; 326.3]
АБРР	204.0 ± 16.7 [170.9; 237.1]	211.1 ± 7.2 [196.9; 225.4]	241.3 ± 20.3 [201.0; 281.7]	166.6 ± 14.7 [137.4; 195.8]
АБРР: ATII	198.2 ± 21.2 [156.1; 240.3]	209.6 ± 18.5 [172.9; 246.4]	166.7 ± 13.1 [140.8; 192.7]	117.8 ± 16.3 [85.3; 150.3]
ТКБРР	141.4 ± 19.2 [103.1; 179.6]	138.0 ± 11.8 [114.5; 161.5]	180.0 ± 15.7 [148.7; 211.3]	90.3 ± 12.0 [66.4; 114.2]
ТКБРР: ATII	131.5 ± 17.1 [97.4; 165.6]	151.2 ± 21.5 [108.3; 194.1]	106.9 ± 8.9 [89.2; 124.7]	62.2 ± 9.2 [44.0; 80.4]
БКБРР	62.5 ± 5.2 [52.0; 72.9]	73.1 ± 12.9 [47.4; 98.8]	61.5 ± 6.4 [48.7; 74.2]	76.2 ± 9.3 [57.8; 94.7]
БКБРР: ATII	66.8 ± 10.5 [45.9; 87.7]	58.4 ± 7.4 [43.7; 73.1]	59.9 ± 7.5 [45.0; 74.9]	55.9 ± 14.1 [27.7; 84.0]
ИЧБРР	5.2 ± 1.1 [3.4; 7.9]	3.6 ± 0.4 [2.9; 4.4]	3.5 ± 0.3 [3.0; 4.2]	2.0 ± 0.3 [1.5; 2.7]
ИЧБРР: ATII	4.0 ± 0.8 [2.8; 5.9]	5.3±1.1 [3.5; 8.0]	2.4 ± 0.3 [1.9; 2.9]	2.7 ± 0.6 [1.8; 4.2]
n/nATII	8/9	7/7	5/5	7/5

Примечание. Значения параметров приведены на момент начала эксперимента («исходно», левые колонки) и к моменту окончания 4-й недели эксперимента («4-я неделя», правые колонки). В нижней части каждой графы для каждой группы приведены значения ЧСС и параметры барорецепторной реакции, получаемые на фоне инфузии ангиотензина II (АТII). n_ATII – количество животных, получавших АТII.

МКТ – монокроталин; ЧСС_max – наибольшее асимптотическое (максимальное достижимое) значение ЧСС; ЧСС покоя – значение ЧСС, наблюдаемое до введения вазоактивных соединений; ЧСС_min – наименьшее асимптотическое (минимальное достижимое) значение ЧСС; А_БРР – диапазон (амплитуда) барорецепторной реакции; ТК_БРР – величина рефлекторной тахикардии; БК_БРР – величина рефлекторной брадикардии; ИЧ_БРР – индекс чувствительности барорецепторной реакции.

 

У крыс с ЛАГ (4 недели после введения МКТ) наибольшая достижимая ЧСС значимо меньше (p = 0.001) по сравнению с исходным уровнем и составляет 440.1 ± 18.49 [403.9; 476.3] уд/мин; наименьшая достижимая ЧСС значимо не меняется и составляет 258.7 ± 14.9 [229.4; 288.0] уд/мин (рис. 3a, панель «4-я нед»). Таким образом, ЛАГ приводит к значимому уменьшению рефлекторной тахикардии (от 138.0 ± 11.9 [114.5; 161.5] до 90.3 ± 12.0 [66.4; 114.2] уд/мин, p = 0.0029, рис.3c), а также диапазона барорефлекторной реакции (от 211.1 ± 7.4 [196.9; 225.4] до 166.6 ± 14.6 [137.4; 195.8], p = 0.0031, рис. 3b), но не влияет на рефлекторную брадикардию (рис. 3d). Также у крыс с ЛАГ значимо (р = 0.0005) уменьшается индекс чувствительности барорецепторной реакции (рис. 3e), (3.58 ± 0.38 [2.89; 4.43] и 2.02 ± 0.29 [1.52; 2.68], табл.1).

У контрольных крыс к 4-й неделе после начала эксперимента, в противоположность животным с ЛАГ, наблюдалось значимое увеличение ЧСС_max (p < 0.001), большее, чем у животных с ЛАГ, изменение ЧСС_min (p = 0.0052, рис. 3a), что приводит к увеличению А_БРР и ТК_БРР; у контрольных животных ИЧ_БРР падает незначительно. Величины ЧСС_max, ЧСС_min, А_БРР , ТК_БРР , ИЧ_БРР значимо превышают таковые, наблюдаемые у крыс с ЛАГ (рис. 3b, c, d, p ≤ 0.0011, табл. 1).

Влияние ангиотензина II на диапазон и чувствительность барорецепторного рефлекса при ЛАГ

Ангиотензин II не вызывал немедленного значимого изменения ЧСС покоя, а также не менял наибольшую и наименьшую достижимую ЧСС (рис. 4a, панели «исходно»). Таким образом, в наших экспериментах при действии АТII не наблюдалось изменения А_БРР, БК_БРР, ТК_БРР, а также ИЧ_БРР (рис. 4b–d, панель «Исходно») у животных в начале эксперимента.

 

Рис. 4. Влияние ангиотензина II (ATII) на характеристики барорецепторной реакции при ЛАГ. (a) – кривые барорецепторной реакции (БРР), полученные с использованием нелинейной модели со смешанными эффектами. Кривые БРР показаны для контрольной группы крыс («контроль») на момент начала и через 4 недели после начала экспериментов; для группы животных до введения («исходно/ЛАГ») и через 4 недели после введения МКТ («4-я нед/ЛАГ»). Голубым цветом обозначены кривые БРР до введения, а красным – кривые, полученные на фоне инфузии ATII. Обозначения доверительных интервалов, аппроксимированных кривых для отдельных экспериментов, отметки на оси ординат и масштаб осей, а также приведенные на панелях аппроксимированные значения такие же, как на рис. 3а. На панелях (b – e) представлены отдельные характеристики БРР у контрольных животных (зеленый цвет) и животных с ЛАГ (оранжевый цвет), определяемые до и в ходе инфузии АТII. Характеристики БРР приведены для начала («исходно») и через 4 недели («4-я нед») после начала эксперимента. Панели «Исходно» и «4-я неделя» даны в одинаковом масштабе по оси ординат. (b) – диапазон БРР. (c) – рефлекторная тахикардия. (d) – рефлекторная брадикардия. (e) – индекс чувствительности БРР. Обозначения значений р, доверительных интервалов, ошибок среднего, плотностей распределения и описательных статистик такие же, как на рис. 3. На панелях приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего для каждой группы.

 

Тем не менее при повторном введении через 4 недели после начала эксперимента инфузия АТII приводила к заметным изменениям барорецепторной реакции. Эффекты, индуцируемые ATII, различаются у крыс с ЛАГ (4 недели после введения МКТ) и животных контрольной группы. В обеих группах при действии АТII наблюдается снижение максимальной ЧСС и уменьшение рефлекторной тахикардии. Однако у крыс с ЛАГ в результате действия АТII максимальная ЧСС и ТК_БРР изменяются менее значимо, чем у животных контрольной группы (рис. 4с, панель «4-я нед»). Также ЧСС_min у крыс с ЛАГ на фоне АТII значимо отличается от этого параметра у контрольных животных (p < 0.001, рис 4a, панель «4-я нед/ЛАГ»). Крысы с ЛАГ при действии АТII демонстрируют тенденцию к уменьшению БК_БРР (рис. 4d, «4-я нед»), однако, различия между группами оказываются незначимыми, поскольку у контрольных животных АТII на 4-й неделе эксперимента вызывал значительное повышение ЧСС покоя (табл. 1).

И в контрольной группе животных (на 4-ю неделю), и у животных с ЛАГ введение АТII приводило к значимому снижению А_БРР (рис. 4b, панель «4-я нед»). Однако у контрольных животных этот эффект АТII преимущественно реализуется за счет снижения наибольшей достижимой ЧСС (при повышенной ЧСС покоя) и ослабления рефлекторной тахикардии, а у животных с ЛАГ – как за счет снижения рефлекторной тахикардии, так и брадикардии (рис. 4b–d).

Изменение парасимпатического компонента барорецепторного рефлекса при ЛАГ

Во всех экспериментальных группах атропин вызывает увеличение ЧСС покоя, уменьшение рефлекторной брадикардии; также, наименьшая достижимая ЧСС на фоне атропина во всех группах выше, чем в контрольных условиях. Атропин не вызывает значимого изменения наибольшей достижимой ЧСС как в контрольной группе, так и у животных с ЛАГ (рис. 5a, верхние панели). Атропин уменьшает А_БРР в контрольной группе животных и у животных с ЛАГ за счет изменения ЧСС_min и БК_БРР . Атропин также вызывает уменьшение ИЧ_БРР как у животных контрольной группы, так и у животных с ЛАГ (табл. 2).

 

Рис. 5. Влияние ЛАГ на холинергическую составляющую барорецепторного контроля ЧСС. Кривые барорецепторной реакции показаны для контрольной группы крыс («контроль») на момент начала и через 4 недели поcле начала экспериментов; для группы животных до введения («исходно/ЛАГ») и через 4 недели после введения МКТ («4-я нед/ЛАГ»). Для каждой группы и временной точки показаны кривые БРР, полученные в стандартных условиях (зеленый цвет), а также после введения атропина (розовый цвет). На рисунке представлены только минимально достижимая ЧСС и ЧСС покоя. Обозначения групповых средних, доверительных интервалов, индивидуальных предсказаний, а также отметки на краях панелей для параметров, ЧСС покоя и масштаб панелей такие же, как на предыдущих рисунках.

 

Таблица 2. Характеристические значения ЧСС и параметров барорецепторной реакции в группе контрольных животных (контроль), а также в группе животных, сформировавших к 4-й неделе признаки ЛАГ (правая колонка) на фоне атропина

период эксперимента	исходно		4-я неделя
группа / параметр БРР	контроль (атропин)	ЛАГ (перед введением МКТ) (атропин)	контроль (атропин)	ЛАГ (4-я нед. после введения МКТ) (атропин)
ЧСС покоя	353.1 ± 8.0 [337.2; 369.0] 385.3 ± 12.1 [361.2; 409.4])	352.5 ± 6.9 [338.8; 366.2] 404.2 ± 11.0 [382.4; 426.0])	309.1 ± 6.9 [295.3; 322.9] 394.9 ± 12.0 [371.0; 418.8])	344.7 ± 15.1 [314.6; 374.8] 390.3 ± 13.1 [364.3; 416.3])
ЧСС покоя: АТII	355.5 ± 11.1 [333.4; 377.7] 390.7 ± 7.3 [376.2; 405.3])	357.5 ± 10.7 [336.1; 378.8] 391.8 ± 10.1 [371.8; 411.9])	334.3 ± 10.8 [312.8; 355.9] 362.0 ± 15.2 [331.8; 392.2])	343.0 ± 15.0 [313.2; 372.8] 388.2 ± 9.7 [368.9; 407.5])
ЧССmin	289.5 ± 13.7 [262.6; 316.4] 339.3 ± 14.0 [311.8; 366.8])	301.8 ± 14.7 [273.0; 330.7] 373.8 ± 14.8 [344.7; 402.8])	207.8 ± 17.7 [173.1; 242.5] 333.0 ± 17.6 [298.5; 367.4])	258.7 ± 14.9 [229.4; 288.0] 359.1 ± 15.9 [327.9; 390.2])
ЧССmin: АТII	277.8 ± 13.1 [252.2; 303.4] 367.0 ± 13.0 [341.5; 392.5])	262.7 ± 15.0 [233.3; 292.0] 371.7 ± 15.9 [340.6; 402.7])	162.9 ± 20.7 [122.3; 203.4] 183.9 ± 26.6 [131.7; 236.1])	292.4 ± 17.3 [258.5; 326.3] 379.5 ± 19.2 [342.0; 417.1])
ИЧБРР	5.2 ± 1.1 [3.4; 7.9] 1.7 ± 0.3 [1.2; 2.4])	3.6 ± 0.4 [2.9; 4.4] 2.4 ± 0.4 [1.7; 3.2])	3.5 ± 0.3 [3.0; 4.2] 1.8 ± 0.1 [1.6; 2.0])	2.0 ± 0.3 [1.5; 2.7] 1.4 ± 0.1 [1.2; 1.7])
ИЧБРР: АТII	4.0 ± 0.8 [2.8; 5.9] 1.7 ± 0.3 [1.2; 2.5])	5.3 ± 1.1 [3.5; 8.0] 2.3 ± 0.4 [1.7; 3.2])	2.4 ± 0.3 [1.9; 2.9] 1.9 ± 0.1 [1.7; 2.1])	2.7 ± 0.6 [1.8; 4.2] 0.7 ± 0.1 [0.5; 1.0])
ΔАБРР	64.0 ± 14.0 [35.7; 92.3]	67.5 ± 17.0 [33.3; 101.8]	102.8 ± 21.2 [59.9; 145.7]	73.5 ± 18.3 [36.5; 110.4]
ΔАБРР: АТII	94.2 ± 22.1 [49.7; 138.7]	110. 7± 17.7 [75.0; 146.4]	16.4 ± 20.9 [-25.7; 58.5]	76.1 ± 29.0 [17.6; 134.6]
n(nатр)	8(8)	7(7)	5(5)	7(6)
nATII (nATII+атр)	9(9)	7(6)	5(5)	5(4)

Примечание. Значения параметров приведены на момент начала эксперимента («исходно», левые колонки) и к моменту окончания 4-й недели эксперимента («4-я неделя», правые колонки). В нижней части каждой графы для каждой группы приведены значения ЧСС и параметры барорецепторной реакции, получаемые на фоне атропина и инфузии ангиотензина II (АТII). Обозначения такие же, как и в табл. 1, за исключением ΔА_БРР, обозначающей разницу между диапазонами БРР до и после атропина.

Для возможности сопоставления в верхней строке каждой ячейки приведены значения параметра, определяемые до введения животным атропина (выделено курсивом). В нижней строке каждой ячейки в круглых скобках жирным шрифтом приведены значения параметра, определяемые на фоне атропина.

n_атр – количество животных, получавших атропин.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего [нпДИ; впДИ].

 

Наибольшее изменение ЧСС покоя (от 309.1 ± 6.9 [295.3; 322.9] до 394.9 ± 12.0 [371.0; 418.8] уд/мин, 85.7 уд/мин), ЧСС_min (от 207.8 ± 17.7 [173.1; 242.5] до 333.0 ± 17.6 [298.5; 367.4] уд/мин, 125.18 уд/мин), БК_БРР и А_БРР, вызванное действием атропина, обнаруживается у контрольных животных через 4 недели после начала эксперимента (рис. 5a, панель «4-я нед/контроль»); у животных с ЛАГ атропин приводит к значимо меньшему изменению ЧСС_min, БК_БРР и А_БРР (p < 0.05), чем у крыс контрольной группы на 4-ю неделю (рис. 5a, правая верхняя панель, табл. 2, ΔА_БРР).

Влияние ATII на парасимпатический компонент барорецепторного рефлекса при ЛАГ

В контрольных условиях АТII оказывает незначительное влияние на изменения параметров барорецепторной реакции, вызываемые атропином (рис. 6a, панели «исходно»). В контрольной группе через 4 недели после начала эксперимента при действии атропина на фоне инфузии АТII наблюдается незначительное изменение ЧСС покоя (от 334.3 ± 10.8 [312.8; 355.9] до 362.0 ± 15.2 [331.8; 392.2] уд/мин, 27 уд/мин) и ЧСС_min (от 162.9 ± 20.7 [122.3; 203.4] до 183.9 ± 26.6 [131.7; 236.1] уд/мин, 21 уд/мин), а также лишь небольшое ослабление БК_БРР и снижение А_БРР (16.4 ± 28 уд/мин на фоне инфузии АТII и 102.8 ± 21.2 уд/мин без АТII, рис. 6b, панель «контроль»). Таких эффектов не наблюдается у животных с ЛАГ (рис. 6b, панель «ЛАГ») – вызываемое атропином повышение ЧСС_min, ослабление БК_БРР и А_БРР сохраняются (табл. 2).

 

Рис. 6. Влияние ATII на парасимпатический компонент барорецепторного контроля ЧСС при ЛАГ. (a) – кривые барорецепторной реакции показаны для контрольной группы крыс, группы животных до введения («исходно») и через 4 недели после введения монокроталина («ЛАГ»). Розовым цветом показаны кривые БРР, регистрируемые на фоне инфузии АТII. (b) – разница в величине диапазона БРР (ΔАБРР), определяемого до и после введения атропина для контрольных животных (левая панель) и животных, получавших МКТ («ЛАГ», правая панель). Красным цветом показана разница в величине диапазона БРР, регистрируемая на фоне инфузии АТII. Обозначения доверительных интервалов, ошибок среднего, плотностей распределения и описательных статистик такие же, как на рис. 3. На панелях приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего для каждой группы.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Дисфункция барорецепторной регуляции ЧСС при ЛАГ

В наших экспериментах впервые прямо продемонстрировано, что ЛАГ оказывает существенное, комплексное влияние на барорецепторную регуляцию ЧСС. В частности, при ЛАГ у крыс наблюдается уменьшение рефлекторной тахикардии, а наибольшая достижимая ЧСС меньше, чем у контрольных животных. Таким образом, ЛАГ ослабляет способность к рефлекторному увеличению ЧСС в ответ на снижение среднего артериального давления, вызванного вазодилятацией системных сосудов за счет NO-зависимых механизмов.

У крыс с ЛАГ практически не уменьшается способность к рефлекторному снижению ЧСС в ответ на вазоконстрикцию, вызванную стимуляцией α1-адренорецепторов: рефлекторная брадикардия и наименьшая достижимая ЧСС при ЛАГ остается такой же, как и в контрольных условиях (группах). Следует отметить, что при ЛАГ, в условиях монокроталиновой модели заболевания у крыс, не наблюдается существенного изменения амплитуды вазоконстрикторного ответа системных артерий на введение ФЭ и активацию α1-АР, хотя наблюдается заметное снижение способности артерий большого круга поддерживать тонус [3]. Таким образом, ЛАГ вызывает большее нарушение тех механизмов и компонентов барорецепторной реакции, которые способствуют повышению ЧСС (при снижении САД) и меньшее нарушение тех, которые приводят к снижению ЧСС (при росте САД) – ЛАГ вызывает «несимметричное» изменение кривой БРР, «искажая» в большей степени симпатическую компоненту барорефлекса.

Как результат снижения ЧСС_max и ТК_БРР у крыс с ЛАГ наблюдается существенное уменьшение диапазона барорецепторной регуляции. ЛАГ приводит к тому, что животные теряют способность к быстрой, рефлекторной стабилизации ЧСС при снижении САД. Следует отметить, что в наших экспериментах ЧСС покоя у «здоровых» животных и животных с ЛАГ оставалась одинаковой. В предыдущих работах показано, что через 4 недели после введения МКТ и манифестации симптомов ЛАГ у крыс САД остается на прежнем уровне [3]. Ранее показано, что NO-зависимая вазодилятация в большом круге в хронической модели ЛАГ остается неизмененной, несмотря на повреждение и дисфункцию эндотелия в малом круге кровообращения: снижение САД посредством активации NO-зависимых механизмов у контрольных животных и животных с ЛАГ оказывается одинаковым [3]. Тем не менее диапазон компенсаторной регуляции ЧСС и соответственно гемодинамики в большом круге при ЛАГ оказывается ограниченным. При неизменной величине NO-зависимой вазодилятации уменьшение барорефлекторного роста ЧСС может происходить за счет снижения «тонуса» симпатического отдела ВНС или чувствительности к симпатическим факторам.

Центральные механизмы дисфункции БРР могут быть обусловлены изменениями в ростро-вентролатеральных структурах продолговатого мозга (РВЛМ), модулирующих активность симпатических преганглионаров интермедиолатеральных зон спинного мозга, или изменениями возбудимости самих симпатических преганглионарных нейронов. Хорошо известно, что премоторные нейроны РВЛМ вовлечены в пути барорецепторной регуляции [39]. К настоящему времени показано, что вазоактивный пептид адреномедуллин может как усиливать, так и подавлять активность возбуждающих нейронов в РВЛМ и симпатическую афферентацию [40, 41]. Однако установлено, что при действии в РВЛМ адреномедуллин существенно подавлял чувствительность и диапазон БРР, а также уменьшал ЧСС_max при индукции барорецепторного ответа нитропруссидом натрия [42]. В то же время показано, что уровень адреномедуллина в плазме повышен при ЛАГ, и, более того, уровень адреномедуллина коррелирует с тяжестью ЛАГ [43, 44]. Спекулятивно наблюдаемая нами дисфункция БРР у крыс с ЛАГ может быть обусловлена вызванным адреномедуллином нарушением активности СНС.

Как указано выше, ВСР у пациентов с ЛАГ снижена [10, 13, 14]. Снижение КСМ / ВСР связывают с переходом от циклического, залпового характера к тоническому, перманентному режиму активности эфферентных волокон симпатического отдела ВНС [45]. Тип разрядовой активности в симпатическом отделе ВНС может существенно различаться у здоровых животных и у животных с ЛАГ: у последних залповый характер разрядов может отсутствовать [45]. Вызванное ЛАГ ослабление рефлекторной тахикардии может быть связано с утратой паттерна активности симпатическими нервами, что приводит к ослаблению чувствительности пейсмейкерных кардиомиоцитов ритмоводителя сердца (синоатриального узла, САУ) к норадреналину (НА). Так как профиль секреции нейромедиатора влияет на чувствительность ткани к нему, то изменение режима секреции НА с залпового на перманентный приводит к десенситизации адренорецепторов, снижению их экспрессии или представленности в мембране миоцитов ритмоводителя сердца, несмотря на возможное увеличение общего количества секретируемого норадреналина, характерное для ЛАГ [46, 47].

Известно, что ЛАГ сопровождается повышением уровня циркулирующих натрийуретических пептидов (ANP, BNP, CNP) [48], а также повышением экспрессии их рецепторов, являющихся гуанилатциклазами [49]. Симпатическая иннервация, включающая НА и адренорецепторы, а также система натрийуретических пептидов и их рецепторов являются двумя ключевыми и крайне тесно переплетенными элементами нейрогуморальной регуляции функционирования сердца [50]. В настоящее время показано, что повышение уровня циркулирующих ANP и BNP снижает залповую активность симпатических нервов, а также чувствительность барорецепторного рефлекса [51]. Увеличение активности системы натрийуретичеких пептидов может быть одной из причин наблюдаемого нами уменьшения диапазона БРР при ЛАГ.

Периферические причины дисфункции БРР при ЛАГ могут быть связаны с изменением функционирования барорецепторов каротидного синуса [52]. Известно, что системная артериальная гипертензия может сопровождаться снижением трансмурального давления в каротидном синусе, его фиброзом, что ослабляет чувствительность к изменению САД, способствует повышению активности симпатических нервов и дисфункции БРР [53–55]. ЛАГ может способствовать ремоделированию барорецепторов, ослаблению их чувствительности к колебаниям САД, например, влияя на экспрессию пуриновых рецепторов Р2Х-типа в сенсорных окончаниях [56]. Недавно показано, что стимуляция каротидного синуса облегчает симптомы ЛАГ у крыс [57].

В наших экспериментах у крыс с ЛАГ наблюдалось не только уменьшение диапазона БРР, но и снижение ИЧ_БРР. Причиной системной идиопатической гипертензии часто является ослабление чувствительности барорецепторного рефлекса – феномен, иначе называемый «барорецепторной недостаточностью» [58, 59]. Как указано выше, барорецепторная недостаточность при системной гипертензии сопровождается повышенной активностью СНС. В данной работе впервые показано, что ЛАГ, как и системная гипертензия, ассоциирована с нарушением барорецепторной регуляции, которая, однако, обусловлена ослаблением «симпатического» компонента.

Ангиотензин II как фактор барорецепторной дисфункции при ЛАГ

У крыс с ЛАГ при действии ангиотензина II на 4-ю неделю после введения МКТ ЧСС_max и ТК_БРР изменяются (снижаются) крайне слабо по сравнению с контрольными животными. Хорошо известно, что ЛАГ сопровождается активацией РААС, увеличением уровня циркулирующего АТ и его производных. Слабое изменение ЧСС_max и ТК_БРР при действии АТII, вероятно, связано с исходно уменьшенным диапазоном БРР, а также с ослаблением чувствительности к АТII на фоне его хронически повышенного уровня у крыс с ЛАГ.

Ранее показано, что АТII при ЛАГ парадоксально уменьшает величину вазоконстрикторного ответа в большом круге кровообращения, обусловленного стимуляцией α1-АР [3]. Соответственно АТII должен ослаблять величину рефлекторной брадикардии; приводить к тому, что абсолютное значение ЧСС_min будет выше, чем в экспериментах без инфузии ангиотензина. Такой эффект действительно наблюдается у крыс с ЛАГ, но не у контрольных животных (лишенных парадоксального влияния ATII на констрикторные эффекты α1-АР). Вышеописанный эффект, вероятно, не связан с подавлением парасимпатической компоненты БРР ангиотензином. Таким образом, ATII при ЛАГ способствует усугублению дисфункции БРР, которое манифестирует в снижении диапазона барорецепторной реакции.

Парасимпатический компонент барорецепторного контроля ЧСС при ЛАГ

Известно, что артерии малого круга кровообращения помимо симпатической имеют также интенсивную парасимпатическую иннервацию [9, 60]. К настоящему времени установлено, что при ЛАГ активность парасимпатических постганглионарных волокон, иннервирующих артерии малого круга кровообращения, снижается [61]. Стимуляция парасимпатических нервов или потенцирование холинергических эффектов за счет применения ингибиторов холинэстеразы рассматривается как способ нормализации циркуляции в малом круге при ЛАГ [62, 63].

В наших экспериментах атропин, блокируя М-холинорецепторы САУ, подавляет снижение ЧСС в ответ на введение ФЭ, активацию α1-АР и вазоконстрикцию как у контрольных животных, так и у животных с ЛАГ. В наших экспериментах атропин приводил к типичным парасимпатолитичексим эффектам, включающим повышение ЧСС покоя, уменьшение А_БРР за счет ЧСС_min и БК_БРР. Эти типичные эффекты наблюдались как у контрольных животных, так и у животных с ЛАГ. Как указано выше, у крыс с ЛАГ наименьшая достижимая ЧСС и рефлекторная брадикардия остаются неизменными, что позволяет предположить интактность холинергической компоненты БРР у крыс с ЛАГ. Величина снижения А_БРР, ЧСС_min и БК_БРР под действием атропина, регистрируемая до и через 4 недели после введения МКТ, оказывается практически одинаковой. Кроме того, ATII практически не изменял влияния атропина на величину БК_БРР и А_БРР у крыс с ЛАГ. АТII незначительно влияет на парасимпатический компонент барорецепторного рефлекса у крыс с ЛАГ. Эти наблюдения подтверждают предположение о минимальной дисфункции холинергической компоненты БРР при ЛАГ.

Причиной того, что у контрольных животных при регистрации на 4-ю неделю эксперимента атропин приводит к большему изменению ЧСС_min, БК_БРР и А_БРР , чем у крыс с ЛАГ, вероятно, является ремоделирующее действие АТII, способствующее отложенному проконстрикторному действию у «здоровых» животных, потенциации ответа на ФЭ и физиологическому усилению рефлекторного снижения ЧСС.

Наши функциональные эксперименты с использованием МКТ модели патологии позволяют предположить, что парасимпатическая иннервация САУ, в отличие от иннервации легочных артерий, при ЛАГ остается не затронутой. Следует отметить, что парасимпатический тонус и холинергический вклад в регуляцию ЧСС у человека гораздо больше, чем у грызунов. Поэтому дерегуляция ЧСС, обусловленная дисфункцией парасимпатического отдела ВНС у человека при ЛАГ, не может быть исключена полностью.

В итоге в представленной работе впервые в экспериментах in vivo показано, что легочная артериальная гипертензия, вызванная МКТ, приводит к нарушению барорецепторного контроля ЧСС, что соответственно снижает возможность рефлекторной стабилизации АД и обуславливает дерегуляцию кровообращения в системном круге. Результаты работы позволили подтвердить предположение, что ЛАГ оказывает влияние на отдельные компоненты регуляции кровообращения в большом круге, преимущественно нарушая симпатическую компоненту БРР.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Авторы благодарят А. В. Фаворова за доставку полиуретановой трубки необходимого диаметра и УСД от Instechlabs в Москву. Это сделало хронические эксперименты возможными.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (А. А. А., В. И. К., В. С. К.); проведение экспериментов (А. А. А., В. Л. Л., А. В. П.); анализ данных (А. А. А., А. В. П., Е. В. Л.); написание и редактирование манускрипта (А. А. А., В. С. К.)

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета Российского научного фонда (грант РНФ 22-15-00189). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

CОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Эксперименты с животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению биомедицинских исследований с лабораторными животными и были одобрены Комиссией по этике Национального медицинского исследовательского центра кардиологии Министерства здравоохранения РФ, протокол № ЛЭС/01.11.23.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Sobre autores

А. Abramov

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation

Autor responsável pela correspondência
Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow

V. Lakomkin

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow

Е. Lukoshkova

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow

А. Prosvirnin

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow

V. Kapelko

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow

V. Kuzmin

National Medical Research Centre of Cardiology named after Academician E. I. Chazov of the Ministry of Health of the Russian Federation; Lomonosov Moscow State University

Email: ferk_88@list.ru
Rússia, Moscow; Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares