Определение активности полимеразы холодоадаптированного вируса гриппа (Orthomyxoviridae: Alphainfluenzavirus) методом минигенома с флуоресцентным белком

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Ранее было показано, что полимеразные белки PB1 и PB2 определяют холодоадаптированный фенотип вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (H2N2).

Цель работы. Создать репортерные конструкции и определить активность вирусной полимеразы при 33 и 37 °С методом минигенома.

Материалы и методы. Совместная трансфекция клеток Cos-1 плазмидами pHW2000, экспрессирующими белки вирусной полимеразы PB1, PB2, PA, NP (минигеном) и репортерную конструкцию.

Результаты. На основе сегмента 8 созданы две репортерные конструкции, которые содержат прямую или инвертированную последовательность NS1-GFP-NS2 для экспрессии белков NS2 и NS1, трансляционно слитных с зелёным флуоресцентным белком (GFP), которые позволили оценить транскрипционную и/или репликативную функции вирусной полимеразы.

Заключение. Полимераза вируса А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) обладает более высокой репликативной и транскрипционной активностью при 33 ºС, чем при 37 °С. Её транскрипционная активность в большей степени зависит от температуры, чем репликативная. Репликативная и транскрипционная активности полимеразы вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1, вариант Mount Sinai) не имеют существенных различий и не зависят от температуры.

Об авторах

Павел Александрович Иванов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: ivanovpa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7105-7579

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва

Александр Викторович Ляшко

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: lyaalex@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-5714-9461

младший научный сотрудник лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Россия, 123098, г. Москва

Владимир Юрьевич Кост

ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН

Email: goron.dekar@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1703-2685

научный сотрудник лаборатории молекулярной токсинологии, Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Россия, 117997, г. Москва

Наталья Федоровна Ломакина

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: nflomakina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2638-4244

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва

Артём Андреевич Ртищев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Email: rtishchevartyom@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4212-5093

научный сотрудник лаборатория генетики РНК-содержащих вирусов, ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, Россия

Россия, 105064, г. Москва

Наталья Ивановна Бунькова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: nbounkova@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-8846-4633

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунобиотехнологии, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва

Татьяна Анатольевна Тимофеева

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: timofeeva.tatyana@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-8991-8525

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник, заведующий лабораторией физиологии вирусов, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва

Марина Анатольевна Баланова

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Email: mbalanova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2727-7221

научный сотрудник лаборатории физиологии вирусов, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва

Степан Александрович Ионов

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева»

Email: stephan.ionov@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0005-3393-0399

лаборант-исследователь лаборатории физиологии вирусов, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия; студент, ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва; 125047, г. Москва

Дмитрий Вячеславович Гориков

ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева»

Email: gorikov.dmitry@mail.ru
ORCID iD: 0009-0002-5159-8738

лаборант-исследователь лаборатории физиологии вирусов, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Россия; студент, ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева», Москва, Россия

Россия, 123098, г. Москва; 125047, г. Москва

Станислав Георгиевич Маркушин

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова»

Email: s.g.markushin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0994-5337

д-р мед. наук, заведующий лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, Россия

Россия, 105064, г. Москва

Список литературы

  1. Krammer F., Smith G.J.D., Fouchier R.A.M., Peiris M., Kedzierska K., Doherty P.C., et al. Influenza. Nat. Rev. Dis. Primers. 2018; 4(1): 3. https://doi.org/10.1038/s41572-018-0002-y
  2. Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophilic influenza strain. Rev. Roum. Inframicrobiol. 1965; 2(3): 179–86.
  3. Maassab H.F. Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C. Nature. 1967; 213(76): 612–4. https://doi.org/10.1038/213612a0
  4. Maassab H.F., Bryant M.L. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999; 9(4): 237–44. https://doi.org/10.1002/(sici)1099-1654(199910/12)9:4%3C237::aid-rmv252%3E3.0.co;2-g
  5. Ambrose C.S., Luke C., Coelingh K. Current status of live attenuated influenza vaccine in the United States for seasonal and pandemic influenza. Influenza Other Respir. Viruses. 2008; 2(6): 193–202. https://doi.org/10.1111/j.1750-2659.2008.00056.x
  6. Rudenko L., Yeolekar L., Kiseleva I., Isakova-Sivak I. Development and approval of live attenuated influenza vaccines based on Russian master donor viruses: Process challenges and success stories. Vaccine. 2016; 34(45): 5436–41. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2016.08.018
  7. Caspard H., Mallory R.M., Yu J., Ambrose C.S. Live-attenuated influenza vaccine effectiveness in children from 2009 to 2015-2016: a systematic review and meta-analysis. Open Forum Infect. Dis. 2017; 4(3): ofx111. https://doi.org/10.1093/ofid/ofx111
  8. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y., Hobom G., Webster R.G. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2000; 97(11): 6108–13. https://doi.org/10.1073/pnas.100133697
  9. Hoffmann E., Krauss S., Perez D., Webby R., Webster R.G. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine. 2002; 20(25-26): 3165–70. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(02)00268-2
  10. Neumann G., Horimoto T., Kawaoka Y. Reverse genetics of influenza viruses – applications in research and vaccine design. In: Klenk H.D., Matrosovich M.N., Stech J., eds. Avian Influenza. Volume 27. Basel: Karger; 2008: 118–33.
  11. Horimoto T., Takada A., Fujii K., Goto H., Hatta M., Watanabe S., et al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate. Vaccine. 2006; 24(17): 3669–76. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2005.07.005
  12. Kittel C., Sereinig S., Ferko B., Stasakova J., Romanova J., Wolkerstorfer A., et al. Rescue of influenza virus expressing GFP from the NS1 reading frame. Virology. 2004; 324(1): 67–73. https://doi.org/10.1016/j.virol.2004.03.035
  13. Te Velthuis AJW, Long JS, Barclay WS. Assays to measure the activity of influenza virus polymerase. In: Yamauchi Y., eds. Influenza Virus. Methods in Molecular Biology, Volume 1836. New York: Humana Press; 2018. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8678-1_17
  14. Cox N.J., Kitame F., Kendal A.P., Maassab H.F., Naeve C. Identification of sequence changes in the cold-adapted, live attenuated influenza vaccine strain, A/Ann Arbor/6/60 (H2N2). Virology. 1988; 167(2): 554–67.
  15. Rodriguez L., Blanco-Lobo P., Reilly E.C., Maehigashi T., Nogales A., Smith A., et al. Comparative study of the temperature sensitive, cold adapted and attenuated mutations present in the master donor viruses of the two commercial human live attenuated influenza vaccines. Viruses. 2019; 11(10): 928. https://doi.org/10.3390/v11100928
  16. Isakova-Sivak I., Chen L.M., Matsuoka Y., Voeten J.T., Kiseleva I., Heldens J.G., et al. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Virology. 2011; 412(2): 297–305. https://doi.org/10.1016/j.virol.2011.01.004
  17. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М., Акопова Н.К., Ахматова Н.К., Коптяева И.Б. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013; 58(1): 11–7. https://elibrary.ru/pwjuoj
  18. Маркушин С.Г., Цфасман Т.М., Терехов А.В., Лисовская К.В., Акопова И.И. Холодоадаптированный штамм А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) – перспективный штамм-донор аттенуации для получения живых гриппозных вакцин. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2015; (5): 27–32. https://elibrary.ru/zqjycx
  19. Маркушин С.Г., Кост В.Ю., Акопова И.И., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Переверзев А.Д. и др. Исследование возможности использования сайт-специфического мутагенеза в конструировании живых гриппозных вакцин. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2014; (6): 100–3. https://elibrary.ru/tenlph
  20. Kost V., Tsfasman T., Terekhov A., Koptiaeva I., Lisovskaja K., Markushin S. Attenuation of the cold-adapted (ca) A/Krasnodar/101/35/1959 (H2N2) influenza strain: Role of the Ile147Thr mutation in the PB1 gene. IJSRM.Human. 2017; 6(2): 96–114.
  21. Кост В.Ю., Ртищев А.А., Минтаев Р.Р., Акопова И.И., Лисовская К.В., Маркушин С.Г. Изучение биологических свойств аттенуированных вариантов штамма А/WSN/33, полученных с помощью сайт-специфического мутагенеза РВ2-гена. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; (2): 68–76. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-2-68-76 https://elibrary.ru/wrchzu
  22. Stech J., Stech O., Herwig A., Altmeppen H., Hundt J., Gohrbandt S., et al. Rapid and reliable universal cloning of influenza A virus genes by target-primed plasmid amplification. Nucleic Acids Res. 2008; 36(21): e139. https://doi.org/10.1093/nar/gkn646
  23. Jeong J.Y., Yim H.S., Ryu J.Y., Lee H.S., Lee J.H., Seen D.S., et al. One-step sequence- and ligation-independent cloning as a rapid and versatile cloning method for functional genomics studies. Appl. Environ. Microbiol. 2012; 78(15): 5440–3. https://doi.org/10.1128/aem.00844-12
  24. Терехов А.В., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г., Коптяева И.Б., Лисовская К.В., Кост В.Ю. Изучение att-фенотипа реассортантов между вирулентным штаммом вируса гриппа А(H1N1)/WSN/33 и вакцинным холодоадаптированным штаммом вируса гриппа А(H2N2)/ Краснодар/101/35/59. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2013; (5): 41–7. https://elibrary.ru/refcoh
  25. Perez J.T., García-Sastre A., Manicassamy B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Curr. Protoc. Microbiol. 2013; Chapter 15: 15G4. https://doi.org/10.1002/9780471729259.mc15g04s29

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Репортерная конструкция NS1GFPNS2 (контроль). а – встроенный в плазмиду модифицированный сегмент 8 вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) включает ген NS1 (с удаленным сайтом сплайсинга для NS2), ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP), сплайсированный ген NS2. Клеточная РНК-полимераза II с промотора CMV синтезирует мPHK (mRNA) конструкции NS1GFPNS2, с которой транслируются белки NS2 и NS1, трансляционно слитный с GFP; б – экспрессия слитного белка NS1-GFP в трансфецированных клетках Cos-1, культивируемых при 33 °C (слева) и 37 °C (справа). Масштабная линейка – 10 мкм.

Скачать (88KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Репортерная конструкция dCMV для оценки транскрипционной активности вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). В плазмиде с встроенной последовательностью NS1GFPNS2 удален промотор CMV. На одной цепи встроенного двухцепочечного фрагмента ДНК клеточная РНК-полимераза I (PolI) с промотора PolI синтезирует вирионную РНК (vRNA), с которой вирусная РНК-полимераза RdRp, экспрессируемая минигеномом, в результате транскрипции синтезирует mRNA для трансляции белков NS1-GFP и NS2.

Скачать (50KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Репортерная конструкция dCMVrev для оценки репликативной и транскрипционной активности вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). В плазмиду встроен инвертированный двухцепочечный ДНК-фрагмент NS1GFPNS2 и удален промотор CMV. Клеточная РНК-полимераза I (PolI) синтезирует комплементарную цепь NS1GFPNS2 встроенной конструкции (cRNA). Вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) реплицирует с нее вирусную РНК (vRNA), на которой затем синтезирует mRNA для трансляции белков NS1-GFP и NS2.

Скачать (64KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Экспрессия NS1-GFP в клетках Cos-1 после трансфекции репортерной конструкции без промотора CMV (dCMV) совместно с минигеномом вируса А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) (нижний ряд) либо A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (верхний ряд) при 33 °С (левая колонка) и 37 °С (правая колонка). Масштабная линейка – 10 мкм.

Скачать (84KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Экспрессия NS1-GFP в клетках Cos-1 после трансфекции репортерной конструкции с инвертированной последовательностью NS1GFPNS2 и без промотора CMV (dCMVrev) совместно с минигеномом вируса А/Краснодар/101/35/59 (H2N2) (нижний ряд) либо A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (верхний ряд) при 33 °С (левая колонка) и 37 °С (правая колонка). Масштабная линейка – 10 мкм.

Скачать (88KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Флуоресценция NS1-GFP в условных единицах (Arbitrary Units – A.U., вертикальная шкала) при температуре 33 °С (черный столбец) и 37 °С (серый столбец) в клетках Cos-1, трансфецированных репортерными конструкциями совместно с минигеномом вирусов A/Puerto Rico/8/34 (PR8) или А/Краснодар/101/35/59 (Krasnodar). В каждом столбце приведено среднее арифметическое значение по результатам трех независимых экспериментов со среднеквадратичным отклонением. Конструкция dCMV характеризует активность полимеразы преимущественно при транскрипции, а dCMVrev – активность полимеразы при репликации и транскрипции. * – достоверное различие при p < 0,008. Обозначения: CMV/NS1GFPNS2 – репортерная конструкция NS1GFPNS2 с CMV промотором (контроль); dCMV – репортерная конструкция NS1GFPNS2 без промотора CMV; dCMVrev – репортерная конструкция без промотора CMV c инвертированной последовательностью NS1GFPNS2.

Скачать (62KB)
Метаданные

© Иванов П.А., Ляшко А.В., Кост В.Ю., Ломакина Н.Ф., Ртищев А.А., Бунькова Н.И., Тимофеева Т.А., Баланова М.А., Ионов С.А., Гориков Д.В., Маркушин С.Г., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».