Characteristics of the Fatty Acid Composition of the Vacuolar Membrane Lipids Under the Conditions of Stress Induced by Copper Ions

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В силу прикрепленного образа жизни растения чувствительны к токсическому действию тяжелых металлов (ТМ). Токсическая доза зависит от типа иона, концентрации ионов, вида растения и стадии его роста. Известно, что незаменимые металлы Cu, Fe, Mn, Zn, Mo и Ni поглощаются и накапливаются растениями. Однако чрезмерное накопление этих металлов может быть токсичным для большинства растений [1]. Среди микроэлементов, необходимых растениям, медь (Cu) имеет жизненно важное значение. Cu-ассоциированные белки играют существенную роль в цепи переноса электронов хлоропластов и митохондрий. Ионы меди (Cu²⁺) участвуют в фотосинтетической реакции фотосистемы II (ФС II) независимо от пластоцианина и стимулируют кислород-выделяющую активность ФС II in vitro. Кроме того, Cu²⁺ являются кофактором многих ферментов, таких как полифенолоксидаза, лакказа, цитохром с-оксидаза, супероксиддисмутаза меди/цинка (Cu/Zn-SOD), аминооксидаза. Аминооксидазы, которые связаны с клеточными стенками, катализируют окисление путресцина с образованием перекиси водорода, необходимой для лигнификации, поперечного связывания белка клеточной стенки и запрограмMированной гибели клеток [2]. Cu²⁺ связаны с окислительным фосфорилированием, транспортировкой белков, регуляцией сигналов, а также метаболизмом липидов и железа [3]. Как избыток, так и недостаток меди может привести к аномалиям или дисфункции развития и роста растений, серьезно нарушая критически важные физиологические процессы [4]. Исследования показали, что Cu²⁺ могут изменять скорость пролиферации клеток корневой меристемы, регулируя гормоны, такие как абсцизовая кислота, мелатонин и ауксин [2]. Избыток Cu²⁺ нарушает состав мембран хлоропластов и тилакоидов, что может вызывать окислительный стресс в растительных клетках и уменьшать содержание фотосинтетических пигментов. Следовательно, избыточное количество Cu²⁺ может снижать фотосинтез растений, подавляя биосинтез хлорофилла и ФС II, тем самым отрицательно влияя на растения [5]. Кроме этого, избыточные концентрации Cu²⁺ влияют на функции некоторых ключевых клеточных компонентов, таких как белки, липиды, ДНК и РНК [2].

Толерантность растений к ТМ основана на нескольких механизмах, к которым относятся связывание с клеточной стенкой, активный транспорт ионов в вакуоль и образование комплексов с органическими кислотами или пептидами [1].

Вакуолярная компартментализация является главным механизмом изолирования ТМ, который в свою очередь зависит от работы двух вакуолярных насосов (H⁺-АТР-азы, H⁺-пирофосфатазы) и ряда тонопластных транспортеров. Структура и функции вакуолярной мембраны реагируют на ионы ТМ и во многом зависят от изменений, которые происходят в составе липидов тонопласта [6, 7]. Известно, что действие стрессового фактора приводит к значительным изменениям в составе жирных кислот (ЖК) липидов вакуолярной мембраны [8]. В настоящее время мало изучены изменения в составе ЖК вакуолярной мембраны, происходящие в ответ на токсическое действие Cu²⁺. В связи с этим цель нашего исследования заключалась в анализе изменений жирнокислотного состава тонопласта в условиях стресса, вызванного Cu²⁺.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.). Для оценки влияние Cu²⁺ на ЖК липидов тонопласта, кусочки корнеплодов (1 см³) замачивали в растворе CuSO₄ 5H₂O на 16 ч при комнатной температуре. Для контроля использовали дистиллированную воду. Cu²⁺ вносили в концентрациях 100 и 500 мкМ в пересчете на ионы металла. Вакуолярные мембраны получали описанным ранее методом [9].

Общие липиды экстрагировали модифицированным методом Фолча [10]. Для контроля экстрагируемости липидов использовали 10 мкг нонадекановой кислоты (С19:0). Метиловые эфиры ЖК получали по методу Christie [11]. Анализ метиловых эфиров ЖК тонопласта проводили с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent Technology 5973N/6890N MSD/DS (США). Для идентификации пиков метиловых эфиров ЖК использовали стандарты метиловых эфиров (Sigma, США) и данные библиотеки масс-спектров NIST 05. Дополнительно рассчитывали сумму ненасыщенных жирных кислот (∑ННЖК), сумму насыщенных жирных кислот (∑НЖК). Для характеристики степени ненасыщенности липидов использовали индекс двойной связи (ИДС) [12]:

$\mathrm{ИДС}=\frac{{\mathrm{\Sigma P}}_{\mathrm{j}}{\mathrm{n}}_{\mathrm{j}} }{100}$,

где P_j – содержание кислоты, %; n_j–количество двойных связей в каждой кислоте.

Активность ацил-липидных мембранных ω9-, ω6- и ω3-десатураз, отвечающих за введение двойных связей в углеводородные цепи олеиновой (С18:1(n-9)), линолевой (С18:2(n-6)) и α-линоленовой (С18:3(n-3)) ЖК, рассчитывали как стеароил- (SDR), олеоил- (ODR) и линолеил-(LDR) десатуразные отношения по формулам [12]:

$\mathrm{SDR} =\frac{ \%С18:1}{\%С18:0 +\%С18:1}$,

$\mathrm{ODR} = \frac{\%\mathrm{C}18:2 +\%\mathrm{C}18:3}{\%\mathrm{C}18:1 +\%\mathrm{C}18:2+\%\mathrm{C}18:3}$,

$\mathrm{LDR} = \frac{\%C18:3}{\%C18:2 +\%C18:3}$.

Для статистической обработки данных использовали програмMные пакеты Microsoft Excel и SigmaPlot 12.5. Эксперименты проводили в 3–5 независимых повторностях. Полученные данные представляли в виде средней арифметической (M) или медианы (Me), а разброс значений – в виде стандартной ошибки (± S.E.) или интерквартильной широты [25 процентиль; 75% процентиль]. С помощью критерия Шапиро–Уилка проверяли нормальность распределения (ГОСТ Р ИСО 5479–2002) [13]. Различия между экспериментальными данными считали статистически значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что токсические концентрации ТМ запускают процессы окислительного стресса в клетках растений. В результате чего происходит выход из клетки различных веществ, а также изменения в составе липидов и белков, вызванные перекисным окислением мембранных липидов [14]. Поэтому подбор токсических концентраций Cu²⁺ осуществляли при помощи измерения выхода электролитов и содержания диеновых конъюгатов. Согласно полученным данным, наиболее значимое увеличение выхода электролитов было отмечено при концентрации 500 мкМ Cu²⁺, в то время как увеличение содержания диеновых конъюгатов наблюдали при 100 мкМ. Возможно, такое разное действие Cu²⁺ отразится на составе ЖК липидов тонопласта, поскольку вакуоль и ее мембрана принимает активное участие в ответе клетки на стресс. В связи с этим было интересно выявить участие ЖК липидов тонопласта в условиях стресса, вызванного Cu²⁺.

Проведенные исследования показали, что в липидах тонопласта в условиях токсического действия меди увеличивалась сумма абсолютного содержания ЖК. Отмечено, что при 100 мкМ Cu²⁺ это увеличение было на 57 мкг больше по сравнению с контролем. Интересно, что при 500 мкМ Cu²⁺ сумма ЖК снижалась по сравнению с 100 мкМ (табл. 1). Известно, что абиотические стрессы активируют ферменты, которые участвуют в мобилизации ненасыщенных ЖК для ремоделирования мембранных липидов. Ремоделирование ЖК глицеролипидов – это процесс, при котором одна или обе ЖК заменяются, образуя промежуточный лизофосфолипид. Полученные лизофосфолипиды могут быть реацилированы лизофосфолипид-ацилтрансферазами с образованием фосфолипидов с различными ЖК [15]. Ремоделирование глицеролипид-ацилов играет важную роль в удалении окисленных или поврежденных ацильных цепей и высвобождении сигнальных липидов, а также в реакциях на стресс [15]. Возможно, что используемые нами концентрации Cu²⁺ также приводили к ремоделированию мембранных липидов тонопласта для сохранения физико-химических свойств мембраны.

Предполагается, что мембраносвязанные десатуразы ЖК участвуют в ремоделировании глицеролипидов [15]. В данной работе мы использовали методику оценки активности ацил-липидных мембранных ω9-, ω6- и ω3-десатураз на основании состава ЖК суммарных липидов (табл. 1). Согласно полученным данным, было отмечено существенное снижение SDR при обработке 100 мкМ Cu²⁺, с 0.87 в контроле до 0.77, что говорит о снижении активности ω9-десатуразы. Возможно, такое снижение происходит на фоне увеличения стеариновой кислоты (C18:0) с 2.3% в контроле до 5.9% от общего количества ЖК. Содержание олеиновой кислоты (C18:1(n-9)) оставалось на уровне контроля и составляло 19%. При обработке 100 мкМ Cu²⁺ насыщение стеариновой кислоты (C18:0) снижалось и происходило ее накопление.

В случае 500 мкМ Cu²⁺ активность ω9-десатуразы возрастала до 0.93 по сравнению с 100 мкМ, при этом снижалось содержание стеариновой кислоты (C18:0) до 1.55% (табл. 1). Известно, что ω9-десатуразы катализируют образование двойной связи в положении 9-го углерода в ЖК, которые превращают стеариновую кислоту (C18:0) в олеиновую (C18:1(n-9)) [16]. Можно отметить, что активность ω6- и ω3-десатураз снижалась в присутствии обеих концентрациях Cu²⁺, приводя к уменьшению количества линолевой (С18:2(n-6)) и линоленовой (С18:3(n-3)) ЖК.

Кроме степени десатурации ЖК, длина их ацильной цепи и их позиционное распределение на глицериновом остове влияют на организацию и текучесть мембран [15]. Увеличение или уменьшение текучести мембран может быть триггером, запускающим трансдукцию сигналов, которая будет способствовать адаптации растений к стрессовым условиям. Известно, что индекс двойных связей (ИДС) отражает изменения текучести мембраны. Значение ИДС ЖК липидов больше 1.0 говорит о высокой доле в составе липидов ненасыщенных ЖК [17]. Анализ ИДС ЖК липидов тонопласта в условиях стресса, вызванного Cu²⁺, показал снижение этого показателя с 1.11 в контроле до 0.89 при 100 мкМ (табл. 1). Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что медь индуцировала более высокое насыщение ЖК липидов тонопласта. В связи с этим следует обратить внимание на сумму насыщенных ЖК (ΣНЖК) липидов тонопласта. Полученные данные показали, что ΣНЖК увеличивалась на 8% при воздействии 100 мкМ Cu²⁺.

 

Таблица 1. Содержание жирных кислот липидов тонопласта тканей корнеплодов столовой свеклы после воздействия различных концентраций

ионов меди

Жирные кислоты	Контроль		100 мкМ Cu²⁺		500 мкМ Cu²⁺
	мкг/мг общ. лип.	% от ΣЖК	мкг/мг общ. лип.	% от ΣЖК	мкг/мг общ. лип.	% от ΣЖК
Миристиновая, C14:0	1.3±0.2	0.48 [0.46; 0.6]	3.2±0.4а, б	1.1 [1.0; 1.2]а, б	0.96±0.3б	0.4 [0.3; 0.5]б
Пентадекановая, C15:0	3.3±0.1	1.4 [1.3; 1.5]	4±0.4	1.4 [1.3; 1.5]	3.4±0.7	1.2 [1.2; 1.5]
Пальмитиновая, C16:0	78.2 ±6.9	31.7 [30.8; 34.8]	104.9±13.9а	35.5 [33.3; 37.8]	99.7±18	36.7 [35.8; 43.8]
Пальмитолеиновая, C16:1(n-7)	1.7±0.03	0.73 [0.72; 0.74]	2.2±0.3	0.77 [0.7; 0.8]	2.4±0.8	0.85 [0.71; 1.16]
Маргариновая, C17:0	0.66±0.1	0.24 [0.24; 0.3]	1.1±0.1а, б	0.34 [0.34; 0.38]б	0.5±0.05б	0.23 [0.19; 0.23]б
Стеариновая, C18:0	5.4±0.7	2.3 [2.0; 2.5]	15.7±1а, б	5.9 [5.1; 6.1]а, б	3.6±0.4а, б	1.6 [1.3; 1.7]а, б
Олеиновая, C18:1(n-9)	42.5±3.9	19.3 [17.2; 19.4]	54.5±0.9а, б	19.1 [17.9; 19.7]	43.8±2.7б	15.6 [15.6; 20.1]
Цис-вакценовая, C18:1(n-7)	4.8±0.4	1.9 [1.8; 2.1]	6.2±0.5	2.3 [1.9; 2.4]	4.6±1.4	2.0 [1.4; 2.3]
C18:1(n-5)	2.0±0.2	0.81 [0.78; 0.90]	–	–	–	–
Линолевая, C18:2(n-6)	88.5±6.5	39.5 [35.4; 40.8]	89.4±6.6	30.1 [29.2; 31.7]	74.5±13.6	30.3 [26.8; 34.5]
Линоленовая, C18:3(n-3)	7.8±1.2	3.2 [2.8; 3.7]	9.6±1.4	3.0 [2.8; 3.7]	6.7±1.7	2.3 [2.2; 3.0]
Эйкозеновая, C20:1(n-9)	–	–	1.6±0.3	0.53 [0.47; 0.66]	1.3±0.23	0.48 [0.47; 0.56]
Бегеновая, C22:0	–	–	–	–	0.86±0.08	0.39 [0.34; 0.39]
ΣЖК	235.9±3.8	100 [100; 100]	292.4±18.7а, б	100 [100; 100]	242.1±21.3б	100 [100; 100]
ΣНЖК	88.8±7.8	36.2 [34.9; 39.6]	128.8±13.8а	44.5 [42.2; 45.9]	108.9±19	40.6 [39.4; 47.9]
ΣННЖК	147.1±5.5	63.8 [60.4; 65.1]	163.6±6.8	55.5 [54.2; 57.8]	133.2±14.7	59.4 [52.1; 60.6]
ИДС		1.1 [1.03; 1.1]		0.89 [0.89; 0.96]		0.94 [0.83; 1.01]
SDR		0.87 [0.87; 0,89]		0.77 [0.76; 0.79]а, б		0.93 [0.92; 0.93]б
ODR		0.69 [0.67; 0.72]		0.66 [0.63; 0.66]		0.62 [0.59; 0.67]
LDR		0.09 [0.07; 0.09]		0.09 [0.09; 0,1]		0.08 [0.08; 0.09]

Примечание: n = 3–5. Отличия значимы (p < 0.05.):^а – между вариантами Контроль и 100 мкМ Cu²⁺ и 500 мкМ Cu²⁺, б – между вариантами 100 мкМ Cu²⁺ и 500 мкМ Cu²⁺. Для доказательства наличия значимых различий между средними M±S.E. применяли однофакторный дисперсионный анализ с последующим множественным сравнением средних по методу LSD (Least Significant Difference) Фишера – метод группирования выборок с наименьшей значимой разностью. Для доказательства наличия значимых различий между медианами Ме [25 процентиль; 75 процентиль] использовали H-критерий Краскела–Уоллиса, и последующее множественное сравнение медиан проводили по методу Стьюдента–Ньюмена–Кеулса.

 

Заметные изменения в составе ЖК липидов тонопласта отмечены при анализе абсолютного содержания ЖК (табл. 1). В ответ на действие Cu²⁺ (100 мкМ) происходило увеличение количества насыщенной пальмитиновой кислоты (C16:0) на 34% по сравнению с контролем. Известно, что содержание пальмитиновой кислоты (C16:0) увеличивалось при холодовом и окислительном стрессе [18]. Кроме того, происходило увеличение стеариновой (C18:0) насыщенной ЖК в присутствии 100 мкМ Cu²⁺, в то время как при концентрации 500 мкМ Cu²⁺ содержание этой кислоты снижалось. В присутствии 100 мкМ Cu²⁺ также отмечено значимое увеличение содержания таких насыщенных минорных ЖК, как миристиновая (C14:0) и маргариновая (C17:0), а из ненасыщенных олеиновой ЖК (C18:1(n-9)), что не было обнаружено при воздействии 500 мкМ Cu²⁺. Олеиновая кислота (C18:1(n-9)), как представитель полиненасыщенных ЖК, принимает участие в механизмах защиты клетки от стресса, обеспечивая поддержание текучести мембран, которая играет важную роль во многих мембранозависимых процессах, например передачи Ca²⁺-сигнала, модулирование активности мембраносвязанных белков и т. д. Похожее увеличение содержания олеиновой кислоты (C18:1(n-9)) в присутствии 100 мкМ Cu²⁺ было отмечено и для корней кукурузы [19].

Таким образом, можно сделать вывод, что ЖК липидов тонопласта участвуют в ответных механизмах на стресс, вызванный токсическими концентрациями меди. Мы предполагаем, что при действии 100 мкМ меди в вакуолярных мембранах включался процесс ремоделирования мембранных липидов, который приводил к увеличению суммы ЖК в липидах тонопласта. Однако при 100 мкМ Cu²⁺ десатуразы ЖК не вовлекались в процесс ремоделирования, так как снижалась их активность. В результате этого увеличивалась насыщенность ЖК мембранных липидов тонопласта, что делало мембрану менее жидкой, тем самым снижая ее проницаемость для Cu²⁺ и выступая в роли механизма адаптации. Выявлено, что при 500 мкМ Cu²⁺ увеличивалась активность SDR и снижалась сумма ЖК по сравнению с 100 мкМ. Возможно, данная концентрация Cu²⁺ является более токсичной, в связи с чем происходит удаление избытка Cu²⁺ в вакуоль. В этом процессе задействованы специфические белки тонопласта, для работы которых необходима более жидкая фаза мембраны.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда № 23-26-00208, https://rscf.ru/project/23-26-00208/ на оборудовании Центра коллективного пользования “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (г. Иркутск).

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

I. S. Kapustina

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: nichka.g@bk.ru
Russian Federation, Irkutsk, 664033

V. V. Gurina

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nichka.g@bk.ru
Russian Federation, Irkutsk, 664033

N. V. Ozolina

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: nichka.g@bk.ru
Russian Federation, Irkutsk, 664033

E. V. Spiridonova

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: nichka.g@bk.ru
Russian Federation, Irkutsk, 664033

References

Supplementary files