Effects of Surfactants on the Aggregation of 6,6'-Disubstituted Thiacarbocyanine Dyes in Aqueous Solutions

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Благодаря набору уникальных физико-химических свойств цианиновые красители нашли свое применение в различных областях науки и технологии. В частности, цианиновые красители широко используются в качестве зондов для обнаружения и визуализации биомакромолекул [1, 2]. Исследования спектрально-флуоресцентных свойств цианиновых красителей в присутствии биомолекул продолжаются и в настоящее время [3–8].

При разработке спектрально-флуоресцентных зондов, помимо показателей чувствительности и селективности, важен также комплекс других характеристик, одной из которых является агрегация в водных растворах. Вследствие того, что красители-зонды, реагируя на биомолекулы, функционируют обычно в виде мономеров, агрегация как побочный процесс, уменьшающий концентрацию мономеров, может сильно затруднять их практическое использование [2]. Это обуславливает важность изучения агрегации цианинов в водных растворах и поиска возможностей ее ослабления.

В настоящей работе спектрально-флуоресцентными методами выполнено подробное исследование агрегационных свойств в водных буферных растворах ряда триметинцианинов, синтезированных и предложенных ранее в качестве потенциальных флуоресцентных зондов для ДНК [9]. Это 6,6'-дизамещенные красители 3,3'-диэтил-6,6'-ди(бензоиламино)тиакарбоцианин-иодид (Т-304), 3,3'-диэтил-6,6'-ди(бензоиламино)-9-метилтиакарбоцианин-иодид (Т-306), 3,3'-диэтил-6,6'-ди(бензоиламино)-9-метокситиакарбоцианин-иодид (Т-307), 3,3'-диэтил-6,6'-ди(метиламино)-9-метокситиакарбоцианин-иодид (Т-336), а также, для сравнения, 3,3',9-триметилтиакарбоцианин-иодид (Cyan 2), не имеющий заместителей в 6,6'-положениях (рис. 1).

 

Рис. 1. Структуры исследованных цианиновых красителей.

 

Поскольку известно, что введение поверхностно-активных веществ (ПАВ) обычно подавляет агрегацию красителей [10, 11], в работе изучено влияние ПАВ различных типов (использовались анионный SDS, катионный CTAB, неионогенные Triton X-100, Brij 35, Tween-20) на агрегацию вышеуказанных красителей в водных растворах. Для сравнения были также изучены спектрально-флуоресцентные свойства красителей в органических растворителях – этаноле и диметилсульфоксиде (ДМСО).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Красители Т304–Т336 и Cyan 2 предоставлены проф. С.М. Ярмолюком (Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины). В качестве ПАВ использовали SDS с критической концентрацией мицеллообразования ПАВ (ККМ) ~ 8.2 ‧ 10^–3 моль ‧ л^–1 [12], CTAB (ККМ ~ 9.1 ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1; [13]), Triton X-100 (ККМ ~ 2.4 ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1; [12]), Brij 35 (ККМ ~ 1 ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1; [12]), Tween-20 (ККМ ~ 0.9 ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1; [12]) – все производства компании Sigma-Aldrich (USA). Растворы готовили в буфере HEPES (0.1 моль ‧ л^–1, pH 7.1). В качестве растворителей использовали также этанол и ДМСО марки “ч.д.а”.

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-2000; спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре “Флюорат-02-Панорама” (Россия). Спектры измеряли с использованием стандартных полистироловых кювет (Sarstedt, Germany) и кварцевых полумикрокювет (Bio-Rad, USA). Для получения рабочих растворов в измерительную кювету вводили микролитровые объемы маточных растворов красителей (растворитель – ДМСО; разведение – 1 : 100 ÷ 1 : 200). После перемешивания спектры красителей регистрировали несколько раз до тех пор, пока они не переставали изменяться во времени. Измерения проводились при комнатной температуре ((22 ± 3)°С). При регистрации спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции корректировались на спектральную характеристику канала возбуждения и на поглощение раствора.

При анализе спектров поглощения красителей для более точного описания изменений в спектрах использовался метод спектральных моментов [14]:

$S_l=\int {\nu }_l\rho \left(\nu \right)d\nu ,$ (1)

$M_l=\frac{1}{S_0}\int {\left(\nu -{\nu }_1\right)}^l\rho \left(\nu \right)d\nu ,$ (2)

где S_l и M_l – начальный и центральный спектральные моменты, l = 0, 1, 2 – порядок момента;  – распределение интенсивности поглощения в спектрах; ε(ν) – поглощение образца, ν – волновое число (с^–1); ν₁= S₁/S₀ – первый момент нормированного распределения фотонов. Показатель M^–1 = 10⁷/ν₁ – среднее положение полосы в шкале длин волн (2) в нм.

Ширину спектральных кривых (σ, см^–1) красителей определяли по величине второго момента:

$\sigma = M_2^{1/2}.$ (3)

Асимметрия спектральных кривых и их форма характеризуются безразмерными коэффициентами γ_1,2:

${\gamma }_1=\frac{M_3}{{\sigma }^3},$ (4)

${\gamma }_2=\frac{M_4}{{\sigma }^3}.$ (5)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спектрально-флуоресцентные свойства красителей в растворах

Спектры поглощения красителей Cyan 2, Т-304–Т-336 в полярных органических растворителях (этанол, ДМСО) представляют собой одиночные узкие полосы и имеют типичное для большинства цианиновых красителей коротковолновое плечо, соответствующее вибронному переходу [15]. По сравнению с Cyan 2 максимумы полос поглощения (λ_abs) 6,6'-дизамещенных красителей Т-304–Т-336 имеют значительные батохромные сдвиги (в этаноле – 30–44 нм). Анализ спектров поглощения красителей в этаноле по методу моментов также выявил батохромные смещения центров тяжести спектров поглощения 6,6'-дизамещенных красителей (ÄМ ^–1 = 20–31 нм) и ощутимо большую ширину спектральных полос (σ_abs, см^–1). В частности, для T-306 и T-307 σ_abs ~ ~ 1010 и 1002 см^–1, соответственно, тогда как для Cyan 2 σ_abs ~ 888 см^–1. Для раствора Т-304 в этаноле сдвиг М ^–1 составляет 17 нм, относительное увеличение σ_abs (Äó_abs) – 48%; для Т-306 и Т-307 ÄМ ^–1 ~ 26–28 нм и Äó_abs ~ 40–45%. Все эти эффекты объясняются влиянием заместителей в 6- и 6'-положениях красителей [9].

За счет влияния мезозаместителей, для Т-306, Т-307, T-336 характерна более слабая флуоресценция в органических растворителях (примерно в 13–20 раз), чем для их незамещенного аналога Т-304 [9]. Известно, что мезозаместители определяют возможность полярно-зависимого (динамического) равновесия между цис- и транс-изомерными формами триметинцианинов [16, 17]. В полярных средах это равновесие смещается в сторону коротковолновых нефлуоресцирующих цис-изомеров красителей. В растворах этанола и ДМСО максимумы спектров возбуждения флуоресценции красителей (соответствуют по положению флуоресцирующим транс-изомерам) Т-306, Т-307, T-336 батохромно смещены относительно спектров поглощения (Äλ = λ_ex – λ_abs ~ ~ 8–10 нм), что объясняется одновременным присутствием цис- и транс-изомеров красителей с различными флуоресцентными свойствами. Конфигурация мезонезамещенного T-304 как в полярных, так и в неполярных растворителях соответствует транс-изомеру как энергетически более выгодной форме (при этом Äλ = 0 нм [18]).

Способность образовывать агрегаты различного типа в водных растворах – одна из особенностей цианиновых красителей [10, 19]. Димеризация Cyan 2 заметна при концентрациях красителя порядка c_{Cyan 2} = (5.0–9.0) ‧ 10^–6 моль ‧ л^–1; при c_{Cyan 2} < 1.0 ‧ 10^–6 моль ‧ л^–1 ее эффекты минимальны. В спектрах поглощения полосе димеров соответствует λ_abs ~ 490 нм (вблизи вибронного плеча основной полосы) [20]. Центр тяжести спектра поглощения смещается гипсохромно: ÄМ ^–1 ~ –17 нм (по сравнению со спектрами в этаноле), полосы уширены на ~50% (σ_abs = 1303 см^–1 в буфере HEPES), вершины спектров сглажены (γ₂ = 1.34 и 3.36 в HEPES и в этаноле соответственно). При дальнейшем увеличении концентрации (а также с течением времени) краситель может образовывать Н-агрегаты более высоких порядков, имеющие еще более коротковолновое поглощение [21].

В отличие от Cyan 2, образующего в основном только димеры, спектры поглощения 6,6'-дизамещенных красителей в водных растворах, приведенные на рис. 2а, представляют собой широкие полосы, не похожие на спектры в органических растворителях, что свидетельствует о значительно более выраженной агрегации, которая проявляется даже при очень малых концентрациях красителей: ~10^–7 моль ‧ л^–1. На рис. 2а приведены также спектры поглощения красителя T-336 при различных концентрациях: при разбавлении раствора красителя T-336 до с ~ 4.18 ‧ 10^–7 моль ‧ л^–1 в спектре все еще наблюдаются эффекты агрегации (образование димеров), что приводит к уширению и изменению формы спектральной кривой. Это отражается в росте s и немонотонном изменении М ^–1 при разбавлении раствора (рис. 2б). В целом, в спектрах 6,6'-дизамещенных красителей максимумы полос поглощения сдвинуты гипсохромно по сравнению со спектрами в этаноле. В частности, полоса спектра поглощения Т-304 имеет λ_abs = 518 нм, для T-306 и Т-307 λ_abs = 513–514 нм, а в спектрах поглощения T-336 наблюдается коротковолновое поглощение димерных агрегатов c λ_abs = 536 нм (основной максимум имеет λ_abs = 571 нм). По сравнению с Cyan 2 усиливаются гипсохромные сдвиги М ^–1: ÄМ ^–1 ~ 23–30 нм, ширина полос поглощения составляет 145–168% от ширины спектров в этаноле (см. выше), вершины спектров сильнее сглажены (γ₂ ~ ~ 0.14–0.38). В водных растворах красители характеризуются слабой флуоресценцией (для T-304 наблюдается снижение флуоресценции в ~200 раз по сравнению с этанолом) из-за влияния агрегации.

 

Рис. 2. а – Спектры поглощения красителей T-304 (кривая 1; c_T-304 = 1 ‧ 10^–6 моль ‧ л^–1) и T-336, полученные при различных концентрациях красителя: c_T-336 = = 1.92 ‧ 10^–6 (кривая 2), 1.2 ‧ 10^–6 (3), 9.72 ‧ 10^–7 (4), 6.47 ‧ 10^–7 (5) и 4.18 ‧ 10^–7 моль ‧ л^–1 (6) в буферном растворе HEPES; б – зависимости М^–1 (1) и ó_abs от концентрации T-336 в буферном растворе; в – спектры флуоресценции (1 – Т-304, λ_ex = 490 нм и 4 – Т-336, λ_ex = 550 нм) и возбуждения флуоресценции (2 – Т-304, λ_reg = 550 нм; 3 – Т-304, λ_reg = 700 нм; 5 – Т-336, λ_reg = 640 нм).

 

В водном буферном растворе в спектрах флуоресценции Т-304 наблюдаются две полосы испускания с максимумами λ_fl = 535 и 685 нм (при возбуждении λ_ex = 490 нм). Спектры возбуждения флуоресценции (рис. 2в) имеют максимумы при λ_ex= 512 и 526 нм (при регистрации λ_reg = 550 и 700 нм соответственно). Такой вид спектров можно объяснить образованием красителем флуоресцирующих агрегатов различного строения (например, Н-димеров и агрегатов более высокого порядка) [13]. В спектрах флуоресценции красителей T-306, T-307 и T-336 наблюдается по одной полосе испускания агрегатов красителей с λ_fl = 678, 676 и 616 нм (максимумы в спектрах возбуждения флуоресценции λ_ex = 519, 485, 577 нм соответственно). Отметим, что для всех исследованных красителей не наблюдались полосы, соответствующие длинноволновым J-агрегатам.

Агрегация красителей в водных растворах определяется рядом факторов, главнейшим из которых является баланс липофильных/гидрофильных свойств молекул красителей. Оценка этих свойств проводилась на базе расчетных коэффициентов распределения в системе октанол–вода (logP) [22]. Величины logP являются положительными и увеличиваются в ряду Cyan 2 < T-336 < T-307 < T-304 < < T-306 (logP = 2.31, 2.73, 3.25, 4.25, 4.8 соответственно). Наличие 6,6'-ди(бензоиламино)-заместителей увеличивает logP почти в 2 раза, что показывает высокую гидрофобность молекул красителей и определяет их склонность к агрегации в водных растворах. В то же время площадь полярной поверхности (TPSA, Ų) молекул красителей Т-304, Т-306, Т-307 составляет ~67.02–76.25 Ų (для T-336 TPSA = 32.87 Ų), что значительно больше, чем у Cyan 2 (TPSA = 8.82 Ų) за счет полярных амидных групп в заместителях.

Влияние поверхностно-активных веществ на агрегацию и спектрально-флуоресцентные свойства красителей

Известно, что нековалентные взаимодействия с мицеллами и отдельными молекулами ПАВ способны оказывать существенное влияние на процессы агрегации/дезагрегации цианиновых красителей [10, 11]. Влияние ПАВ различных типов (катионного CTAB, анионного SDS, неионогенных Triton Х-100, Brij 35, Tween-20) на агрегацию и изомерное равновесие красителей Cyan 2, Т-304, Т-306, Т-307, T-336 было исследовано спектрально-флуоресцентными методами.

В случае катионных ПАВ (в данном случае – CTAB) кулоновское отталкивание, очевидно, должно препятствовать образованию премицеллярных агрегатов краситель–ПАВ (при c_CTAB < < ККМ). Однако уже в присутствии низких концентраций CTAB (c_CTAB ~ (0.18 ÷ 7.35) ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1, (0.02 ÷ 0.81) ККМ) в спектрах поглощения красителя Cyan 2 наблюдается рост поглощения на ~43–45%, при этом вклад полосы агрегатов (димеров) не изменялся и практически не наблюдалось сдвигов основного максимума (рис. 3а). Параметры спектров поглощения, полученные методом моментов, были более чувствительными к добавлению CTAB. Так, в области низких концентраций CTAB (c_CTAB ~ (0.18 ÷ 7.35) ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1, (0.02 ÷ 0.81) ККМ) положение M^–1 претерпевало батохромный сдвиг (ÄM^–1 = 1 нм), ó_abs уменьшалась на 3%, коэффициент симметрии ã₁ при этом практически не изменялся. Изменения в спектрах поглощения при низких концентрациях ПАВ (< ККМ), вероятно, обусловлены гидрофобными взаимодействиями красителя с отдельными молекулами и премицеллярными ассоциатами CTAB. Рост полосы поглощения может быть вызван распадом неупорядоченных агрегатов со слабым поглощением, присутствующих в системе. Увеличение концентрации CTAB до ККМ и выше приводит к продолжению роста поглощения (дополнительно еще на 9%) и батохромному сдвигу максимума полосы Cyan 2 (Äë_abs = 2–3 нм). Только при достаточно высоком содержании CTAB (c_CTAB = = 3.64 ‧ 10^–3 моль ‧ л^–1, 4 ККМ) вклад коротковолнового плеча H-димеров начинает уменьшаться, очевидно, вследствие распада димеров на мономеры (рис. 3а). В этих условиях продолжает увеличиваться батохромный сдвиг положения M^–1 (наблюдается линейная зависимость ÄM^–1 от концентрации ПАВ). При c_CTAB ~ 9.1 ‧ 10^–3 моль ‧ л^–1, (10 ККМ) ΔM^–1 ~ 9 нм. В области c_CTAB = 4 ККМ и выше продолжается уменьшение σ_abs : σ_abs = 1067 см^–1 при 4 ККМ и 1015 см^–1 при 10 ККМ (рис. 3б).

 

Рис. 3. а – Спектры поглощения красителя Cyan 2 (c_{Cyan 2} = 1 ‧ 10^–5 моль ‧л^–1) при различных концентрациях CTAB: c_CTAB = 0 (кривая 1), 0.10 ККМ (2), 0.20 ККМ (3), 1.01 ККМ (4), 2.01 ККМ (5), 4.0 ККМ (6), 6.0 ККМ (7), 8.01 ККМ (8) и 10.0 ККМ (9) в буферном растворе HEPES; на врезке – спектры поглощения Т-307 (c_Т-307 ~ 1.5 ‧ 10^–6 моль ‧ л^–1) в отсутствие ПАВ (кривая 1), в присутствии ≥ 20 ККМ CTAB (2), Triton Х-100 (3), Brij 35 (4), Tween-20 (5) и SDS (6); б – зависимости ÄМ^–1 (1) и ó_abs, полученные из спектров поглощения Cyan 2, от концентрации CTAB; в – спектры флуоресценции (1, 3, 5) и возбуждения флуоресценции (2, 4, 6) Cyan 2 при ≥ 20 ККМ CTAB (1, λ_ex = 520 нм; 2, λ_reg = 600 нм) и Т-307 при ≥20 ККМ CTAB (3, λ_ex = 550 нм; 4, λ_reg = 630 нм) и при ≥20 ККМ SDS (5, λ_ex = 550 нм; 6, λ_reg = 620 нм). На врезке – зависимость интенсивности флуоресценции красителя Т-307 (c_T-307 ~ 1.5 ‧ 10^–6 моль ‧ л^–1) от концентрации SDS ((2.2÷20) ККМ; λ_ex = 550 нм, λ_reg = 596 нм).

 

Рис. 3. Окончание.

 

В случае красителей Т-304, Т-306, Т-307, T-336 при содержании CTAB > 2–3 ККМ спектры поглощения состоят в основном из полос мономеров. В спектрах флуоресценции 6,6'-дизамещенных красителей наблюдаются полосы, соответствующие испусканию мономеров (см. табл. 1). Тем не менее при содержании CTAB > (2 ÷ 3) ККМ в спектрах все еще присутствует вклад агрегатов красителей. Увеличение концентрации CTAB до 20 ККМ приводит к значительному дополнительному росту (46–75%) и сужению (σ_abs ~ 890–910 см^–1) полос поглощения красителей (для Т-307 см. врезку на рис. 3а) и сопровождается увеличением квантовых выходов флуоресценции (в 1.7–2.3 раза).

 

Таблица 1. Максимумы спектров поглощения (λ_abs), флуоресценции (λ_fl) и возбуждения флуоресценции (λ_ex) красителей Cyan 2, Т-304, Т-306, Т-307, T-336 при высоких концентрациях ПАВ: SDS (c_SDS = 0.164 моль ⋅ л^–1), CTAB (c_CTAB = 2.0 ⋅ 10^–2 моль ⋅ л^–1) Triton Х-100 (c_{Triton X-100} = 4.8 ⋅ 10^–3 моль ⋅ л^–1), Brij 35 (c_{Brij 35} = 1.8 ⋅ 10^–3 моль ⋅ л^–1), Tween-20 (c_Tween-20 = 8.4 ⋅ 10^–4 моль ⋅ л^–1)

ПАВ/ККМ, 10–3 моль ‧ л–1 [12, 13]	λabs, нм					λfl, нм					λex, нм
	а	б	в	г	д	а	б	в	г	д	а	б	в	г	д
SDS/8.0	588	585	573	574	585 (506)	573	602	595	597	637	558	596	583	582	603
CTAB/0.91	541	596	591	592	600 (506)	575	612	607	606	642	562	596	593	592	618
Triton X-100/0.24	543	590	581	582	606 (506)	573	609	602	602	643	559	592	587	586	611
Brij 35/0.10	543	592	584	585	607 (509)	569	611	604	604	643	552	594	589	588	615
Tween-20/0.09	541	592	585	586	612	572	609	605	605	640	557	593	590	588	610

Примечание: а – Cyan 2, б – T-304, в – T-306, г – T-307, д – T-336; для красителя T-336 в скобках указано положение плеча димеров в спектрах поглощения.

 

Взаимодействие катионных цианиновых красителей с противоположно заряженными молекулами SDS приводит к связыванию агрегатов красителей с молекулами и/или премицеллярными ассоциатами ПАВ при концентрациях ПАВ ниже ККМ. В этом случае кулоновские и гидрофобные взаимодействия между молекулами SDS и красителя приводят к переходу молекул красителя в микрофазу ПАВ с образованием премицеллярных ассоциатов краситель–ПАВ. Увеличение концентрации ПАВ (c_SDS ~ 1.8 ‧ 10^–2 моль ‧ л^–1, ~2.2 ККМ) не приводит к серьезному сдвигу мономерно-агрегатного равновесия изучаемых катионных 6,6'-дизамещенных цианиновых красителей. Спектры поглощения Т-304, Т-306, Т-307 в присутствии SDS (2.2 ККМ) уширены (σ_abs = = 1511, 1426 и 1470 см^–1 соответственно) и слабо структурированы. Центры спектральных полос М ^–1 батохромно смещены относительно максимумов (ÄМ ^–1 = 15–31 нм); спектры поглощения представляют собой суперпозицию полос поглощения Н-димеров и агрегатов более высокого порядка. Увеличение содержания SDS (до с_SDS ~ ~ (3.3÷4.5) ‧ 10^–2 моль ‧ л^–1; (4.1÷5.6) ККМ) приводит к постепенному появлению длинноволновой полосы, соответствующей поглощению мономеров (для T-307 с λ_abs = 571–573 нм). Для существенного разрушения образовавшихся премицеллярных агрегатов краситель–ПАВ требуются еще более высокие концентрации ПАВ. При с_SDS ~ ~ 0.164 моль ‧ л^–1 (20 ККМ) спектры поглощения красителей T-304, T-306, T-307 становятся узкими (σ_abs = 1057, 1135 и 1082 см^–1 соответственно), центры спектральных полос М^–1 испытывают гипсохромный сдвиг относительно максимумов спектров (ÄM^–1 = 18–22 нм). Это есть следствие распада агрегатов красителей и их перехода в виде мономеров в мицеллярную фазу ПАВ. В случае T-336 интенсивное коротковолновое поглощение Н-агрегатов красителя наблюдается даже при с_SDS ~ 0.164 моль ‧ л^–1 (20 ККМ); при этом спектральные кривые остаются широкими (σ_abs ~ 1173 см^–1). В спектрах поглощения красителя Cyan 2 при содержании SDS 20 ККМ наблюдается рост интенсивности полосы поглощения в 2.9 раза, вклад коротковолнового поглощения агрегатов уменьшается, спектры сдвигаются батохромно (Äλ_abs = = 14 нм, ÄМ ^–1 ~ 17 нм). По сравнению с исходными спектрами в буфере ширина полос ó_abs уменьшается (на 17% содержании SDS при 20 ККМ), вершины спектров “сглажены”.

В присутствии SDS (2.2 ККМ) в спектрах флуоресценции 6,6'-дизамещенных красителей наряду с М-полосой мономера (λ_fl = 598, 594, 596 и 637 нм для Т-304, Т-306, Т-307 и Т-336 соответственно) наблюдаются вклады полос флуоресценции агрегатов (в частности, в спектрах T-304 и Т-306 имеются дополнительные длинноволновые компоненты с λ_fl = 675–678 и 630–640 нм соответственно). Спектры возбуждения красителей значительно уширены, в случае Т-306 получены двухкомпонентные спектры возбуждения флуоресценции с максимумами при 525 и 582 нм (λ_reg = = 700 нм). Аналогичные эффекты наблюдаются для цианинового красителя Cyan 2, (см. табл. 1). При с_SDS ~ 0.164 моль ‧ л^–1 (20 ККМ) в спектрах флуоресценции красителей исчезают полосы эмиссии агрегатов, а интенсивность флуоресценции мономеров красителей увеличивается (рис. 3в).

В присутствии неионогенных ПАВ в спектрах поглощения исследуемых красителей также наблюдаются изменения, связанные с образованием неструктурированных агрегатов. В области c_ПАВ < < ККМ взаимодействие с молекулами и/или премицеллярными ассоциатами неионогенных ПАВ влияет на мономерно-агрегатное равновесие. Спектральные данные указывают на то, что присутствие неионогенных ПАВ, по-видимому, приводит к перестройке H-агрегатов и способно усиливать образование неструктурированных агрегатов красителей.

В частности, при низких концентрациях Tween 20 (c_Tween-20 ~ (0.45 ÷ 6.9) ‧ 10^–5 моль ‧ л^–1, (0.05 ÷ ÷ 0.77) ККМ) в спектрах поглощения Cyan 2 наблюдается уменьшение поглощения на ~29%, сопровождающееся уменьшением вклада коротковолнового плеча H-димеров; при этом не наблюдалось сдвигов максимума и среднего положения полосы поглощения мономера (Äë_abs =0, ÄM^–1 < 0.5–0.7 нм). Ширина спектральной кривой σ_abs в этих условиях возрастает на 6% от исходной, коэффициент ã₂ несколько повышается, коэффициент симметрии ã₁ при этом практически не изменялся (ã₁~ 0.6–0.8). В спектрах поглощения Т-304 при c_Tween-20 ~ (0.89 ÷ 7.7) ‧ 10^–5 моль ‧ л^–1 ((0.10 ÷ 0.85) ККМ) наблюдается небольшое падение интенсивности поглощения (18% от исходной), не сопровождающееся уменьшением вклада агрегатов и появлением поглощения мономера красителя. Падение интенсивности спектра поглощения может быть вызвано образованием неструктурированных агрегатов цианинов, которые имеют низкий коэффициент молярной экстинкции по сравнению с мономерной и димерной формами красителей. В случае T-336 при c_Tween-20 = = 7.2 ‧ 10^–5 моль ‧ л^–1 (0.8 ККМ) наблюдается падение поглощения с λ_abs ~ 560 нм (разрушение/перестройка агрегатов), сопровождающееся увеличением поглощения в длинноволновой области (λ_abs = 606 нм, что соответсвует поглощению мономера красителя). При взаимодействии T-304 с Brij 35 c_{Brij 35} = 7.6 ‧ 10^–5 моль ‧ л^–1 (0.76 ККМ) в спектрах наблюдается батохромный сдвиг центра полосы поглощения: ÄM^–1 > 10 нм; при этом ширина спектральной кривой несколько уменьшается (Äó_abs составляет ~7% от исходного спектра).

Дальнейшее увеличение содержания ПАВ до 2–10 ККМ) приводит к нарастанию и углублению наблюдаемых эффектов. При умеренных и высоких концентрациях Tween-20 продолжается падение интенсивности полосы поглощения Cyan 2 (падение в 2 раза при 10 ККМ), при этом вклад плеча H-димеров уменьшается. Максимумы и среднее положение полосы поглощения Cyan 2 сдвигаются батохромно, ширина полос ó_abs растет: Äë_abs =5 нм, ÄM^–1 ~ 3 нм, Äσ_abs = 20% при содержании Tween-20 10 ККМ). Коэффициент ã₂ уменьшается (ã₂ = 0.5 при 10 ККМ), коэффициент симметрии ã₁ при этом практически постоянен. При c_{Triton X-100} ~ (3.8 ÷ ÷ 7.3) ‧ 10^–4 моль ‧ л^–1 ((1.6 ÷ 3) ККМ) также наблюдается падение интенсивности спектра Cyan 2 (достигающее 30% от исходного значения при содержании Cyan 2 3 ККМ), сопровождающееся его некоторым уширением.

Рост концентрации Tween-20 приводит к уменьшению интенсивности поглощения T-304 (на ~30% при содержании Tween-20 1 ККМ), нарастают батохромия максимума (Äë_abs > 30 нм) и уширение спектров (Äó_abs ~ 10%). Положение центров спектральных кривых красителя меняется слабее: ÄM ^–1 ~ 1–1.5 нм. Это связанно с перестройкой/накоплением агрегатов красителей при связывании красителя с мицеллами ПАВ.

Хорошо разрешeнные и интенсивные полосы мономеров 6,6'-дизамещенных цианиновых красителей появляются в их спектрах только при высоких концентрациях неионогенных ПАВ. Увеличение концентрации ПАВ до 20 ККМ приводит к увеличению интенсивности поглощения Cyan 2 почти в 2 раза. При содержании Tween-20 и Brij 35 20 ККМ в спектрах Т-304 наблюдаются достаточно узкие полосы (ó_abs = 1105 и 982 см^–1 соответственно) с λ_abs = 592 нм. В спектрах поглощения мезо-замещенного цианина Т-306, имеющего наибольшее значение logP и, следовательно, наиболее склонного к агрегации, в присутствии высокой концентрации Tween 20 (>20 ККМ) полоса мономера появляется и увеличивается со временем (λ_abs = 585 нм). Рост этой полосы сопровождается уменьшением поглощения агрегатов красителя с λ_abs = 480–485 нм (рис. 4). Однако, поскольку σ_abs(ПАВ) > > σ_abs(EtOH), можно сделать вывод о наличии остатков агрегатов красителя даже при высоких концентрациях ПАВ (σ_abs(ПАВ) ~ 1105 и 1299 см^–1 для Т-304 и Т-306 соответственно). На наличие агрегатов указывает также гипсохромия положений центров спектральных кривых (в присутствии Tween 20 М ^–1 = 564 нм для Т-304, М ^–1 = 553 нм для Т-306). На врезке к рис. 3а приведены спектры поглощения красителя Т-307 при высоких концентрациях ПАВ.

 

Рис. 4. Спектры поглощения (1–5), флуоресценции (6, λ_ex = 570 нм) и возбуждения флуоресценции (7, λ_reg = 620 нм) красителя Т-306 в буферном растворе HEPES в присутствии высокой концентрации Tween-20 (≥ 20 ККМ). Спектры поглощения 1–5 регистрировали через 0 (кривая 1), 2 (2), 4 (3), 6 (4), 16 мин (5) после приготовления образцов.

 

Переход цианиновых красителей в мономерную форму под действием ПАВ лучше всего прослеживается в спектрах флуоресценции. В буферном растворе для Т-304 характерен двухфазный спектр флуоресценции, компоненты которого принадлежат различным агрегатам красителя. В присутствии неионогенных ПАВ появляется и растет третий компонент – мономер T-304 с λ_fl = = 594–608 нм. При высоких концентрациях ПАВ эта полоса возрастает (~18 раз при содержании Tween-20, равном 1.5 ККМ) и испытывает гипсохромный сдвиг. В спектрах возбуждения флуоресценции этой форме красителя соответствует полоса с максимумом в области 586–593 нм (более коротковолновые максимумы характерны для c_{Tween 20} >> ККМ). Отметим, что полосы флуоресценции коротковолновых агрегатов (Н-димеров) Т-304 наблюдаются в спектрах даже при концентрациях неионогенных ПАВ порядка (1 ÷ 2) ККМ. В случае T-306 при c_Tween-20 = 7.2 ‧ 10^–5 моль ‧ л^–1 (0.8 ККМ) в спектрах флуоресценции наблюдается испускание мономера (λ_fl ~ 643 нм), максимум спектра возбуждения флуоресценции λ_ex = 613 нм.

В спектрах флуоресценции Т-304 при высоких концентрациях ПАВ наблюдается одна полоса, соответствующая флуоресценции мономера (см. табл. 1). Спектры возбуждения флуоресценции красителя имеют максимумы при λ_ex = 593 и 585 нм соответственно. Аналогичные эффекты наблюдаются в спектрах флуоресценции красителей T-306, T-307, T-336, например, при содержании Tween-20, равном 20 ККМ, в спектрах флуоресценции T-306 наблюдается одна полоса с λ_fl = = 605 нм, что соответствует флуоресценции мономерного красителя (вероятно, в виде транс-изомера) в мицеллах ПАВ (максимум спектра возбуждения флуоресценции λ_ех = 590 нм). В случае T-306 при его содержании 20 ККМ в спектрах флуоресценции наблюдается только испускание мономера (λ_fl ~ 640–643 нм), максимумы спектров возбуждения флуоресценции составляют λ_ex = 610, 611, 615 нм в случае Tween-20, Triton X-100 и Brij 35 соответственно.

Таким образом, ПАВ сложным образом влияют на спектрально-флуоресцентные характеристики изученных красителей, что обусловлено сложным характером равновесий между мономерами и агрегатами различного строения (включающими и молекулы ПАВ при их наличии). При этом влияние ПАВ проявляется даже при сравнительно малых концентрациях (< ККМ), а распад агрегатов (димеров) 6,6'-замещенных красителей на мономеры наблюдается лишь при высоких концентрациях ПАВ (~20 ККМ и выше). Важно отметить, что при концентрациях ПАВ выше ККМ спектрально-флуоресцентные свойства изученных красителей существенно не изменяются. Это, очевидно, обусловлено достаточно сильными взаимодействиями красителей с отдельными молекулами и/или премицеллярными ассоциатами ПАВ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе спектрально-флуоресцентными методами (с использованием метода моментов для анализа спектров поглощения) изучено влияние ПАВ различного типа на агрегационные свойства ряда 6,6'-замещенных тиакарбоцианиновых красителей: Т-304, Т-306, Т-307, T-336 и, для сравнения, тиакарбоцианина Cyan 2, не имеющего заместителей в 6,6'-положениях, в водных буферных растворах. По сравнению с Cyan 2, агрегирующего главным образом в виде димеров, красители с заместителями в 6,6'-положениях обладают существенно большей способностью к агрегации (димеризации, а также к образованию неупорядоченных агрегатов, обладающих широкими малоинтенсивными спектрами поглощения). Введение ПАВ приводит к перестройке спектров, связанной с уменьшением вклада неупорядоченных агрегатов, что отражается на положении и форме полос поглощения. В то же время распад димерных агрегатов 6,6'-замещенных красителей наблюдается только при очень высоких концентрациях ПАВ (~20 ККМ и выше). При этом рост концентраций ПАВ выше ККМ существенно не отражается на спектрально-флуоресцентных свойствах изученных красителей, что, очевидно, обусловлено достаточно сильными взаимодействиями красителей с отдельными молекулами и/или премицеллярными ассоциатами ПАВ, сравнимыми с мицеллярными взаимодействиями.

Потенциал тиакарбоцианинов в их использовании в качестве спектрально-флуоресцентных зондов, а также в тераностике активно исследуется [1–8, 23]. Исследования эффектов агрегации важны не только для разработки спектрально-флуоресцентных зондов, но потенциально способны привнести новое в методологию супрамолекулярной нанофотоники [24]. Следует отметить, что при разработке и синтезе красителей-зондов для биомолекул нужно соблюдать баланс их гидрофильных/гидрофобных свойств: рост гидрофобности молекул красителей, с одной стороны, повышает их сродство к биомолекулам, а с другой – повышает склонность к агрегации. Образующиеся агрегаты могут быть достаточно устойчивыми (как в случае 6,6'-замещенных тиакарбоцианинов), что может существенно затруднить использование красителей в качестве зондов [23].

Авторы выражают благодарность проф. С.М. Ярмолюку (Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины) за предоставление цианиновых красителей.

Работа выполнена в рамках госзадания ИБХФ РАН № 001201253314.

About the authors

P. G. Pronkin

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: pronkinp@gmail.com
Russian Federation, Moscow

L. A. Shvedova

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

Email: pronkinp@gmail.com
Russian Federation, Moscow

A. S. Tatikolov

Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences

Email: pronkinp@gmail.com
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files