The adjuvant effect of benzo(a)pyrene on specific IgE production is linked with the accumulation of germinal center B cells within the spleen and extrafollicular b-cells ativation within the lungs

全文:

ВВЕДЕНИЕ

В качестве одной из главных причин повсеместного роста в последние десятилетия частоты встречаемости заболеваний, связанных с продукцией IgE на безвредные антигены, называют рост содержания аэрополлютантов в воздухе мегаполисов и промышленно развитых регионов [1]. Наибольшее внимание при этом уделяют частицам – продуктам неполного сгорания дизельного топлива [2–4]. Данные частицы обычно имеют размер ~0.1–2.5 мкм и состоят из углеродного ядра, на котором адсорбированы различные углеводороды, в том числе полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), их полихлорированные и нитропроизводные, тяжелые металлы и т.д. [2, 5]. Именно ПАУ – один из основных действующих токсических компонентов подобных частиц, обусловливающих их сильный адъювантное действие на формирование 2-го типа иммунного ответа и аллергического воспаления [6–10]. Было установлено, что введение животным прототипного ПАУ бензо(а)пирена способно запускать формирование аллергического воспаления, причем в этих работах было достаточно пикомолярного количества данного поллютанта [11–13].

Для разработки новых методов этиотропной терапии IgE-зависимых патологий, в том числе вызываемых аэрополлютантами, необходимо точное знание о связи формирования продукции специфического IgE с активацией различных субпопуляций В-лимфоцитов. К сожалению, несмотря на достаточно большое количество работ, посвященных этому вопросу, он еще остается дискуссионным. Результаты сильно зависят от дизайна клинического исследования и используемой модели лабораторных животных. Согласно классической точке зрения, формирование В-лимфоцитов и плазматических клеток, экспрессирующих B-клеточный рецептор и(или) секретирующих антитела, отличные от изотипов IgM и IgD, происходит в герминальных центрах [14]. Однако в работах начала 2010-х гг. выяснилось, что IgE⁺ B-лимфоциты, появляющиеся в герминальных центрах на ранних стадиях формирования данных структур, быстро исчезают оттуда по мере их созревания, поскольку происходит быстрая дифференцировка подобных клеток в плазматические клетки [15] либо их апоптоз [16]. Действительно, мастер-регулятором развития герминальных центров и фактором, обеспечивающим выживаемость В-лимфоцитов в этих структурах, является транскрипционный репрессор Bcl6 [17]. Однако этот фактор одновременно подавляет переключение на IgE, в особенности прямое, с изотипа IgM [18]. Вследствие неравного распределения этого фактора между разными дочерними клетками при делении центробластов герминального центра некоторые клетки могут получать меньшее количество этого фактора [19]. Однако они, очевидно, будут также подвержены апоптозу или выходу из реакции герминального центра. Ряд работ показывает, что хотя герминальные центры и нужны для получения высокоаффинных антител в ходе соматического гипермутагенеза, само переключение изотипов может происходить и в клетках-предшественниках герминальных центров или в экстрафолликулярных фокусах [20, 21]. Действительно, большинство последних клинических данных показывает, что локальное переключение изотипов на IgE связано именно с экстрафолликулярным В-клеточным ответом [22–24]. Кроме того, исследование клеточного транскриптома IgE⁺ плазматических клеток показало их сходство в большей степени с не полностью зрелыми короткоживущими плазмабластами экстрафолликулярного ответа [25]. Длительную персистенцию IgE в организме больных объясняют в таких случаях постоянным появлением новых IgE⁺-клеток из IgG₁⁺-клеток (IgG₄ у человека) в ходе последовательного переключения изотипов [26, 27], которое может и не сопровождаться появлением новых герминальных центров.

С другой стороны, имеются и прямо противоположные данные, например, на клетках ex vivo, согласно которым именно клетки герминальных центров склонны к переключению на синтез IgE [28, 29]. Клонирование В-клеточного рецептора изотипа IgE из клеток, выделенных их организма больных пищевой аллергией, показало их высокую аффинность [30], что указывает в пользу их происхождения в реакции герминального центра. Некоторые новые данные на модели с использованием лабораторных животных показали, что формирование высокоаффинных анафилактогенных IgE-антител происходит в ходе реакции герминального центра [31]. Также показана возможность формирования длительно персистирующих плазматических клеток при хроническом попадании антигена в организм через барьерный эпителий [32]. Это может свидетельствовать о роли герминальных центров в процессе, поскольку именно эти структуры связывают с формированием долгоживущих плазматических клеток [30].

Прямое изучение IgE⁺ В-лимфоцитов затруднено как в связи с их малочисленностью, так и с наличием на поверхности большинства IgE⁺ В-лимфоцитов рецептора к растворимому IgE, что затрудняет детекцию “истинных” IgE⁺ B-лимфоцитов [26]. В этой связи важную роль приобретают косвенные методики, например, анализ связи продукции IgE с содержанием разных В-клеточных субпопуляций.

На сегодняшний день в литературе нет информации об исследованиях, в которых анализировалась бы связь продукции IgE, индуцируемой аэрополлютантами, с содержанием разных В-лимфоцитарных субпопуляций локально, в месте попадания аллергена, и системно, во вторичных лимфоидных органах. Целью настоящей работы было по возможности устранить данный пробел и определить связь адъювантного эффекта BaP с содержанием различных В-клеточных субпопуляций в месте попадания аллергена (ткани легких), лимфатических узлах и селезенке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно литературным данным, BaP как основной действующий компонент ЧДТ способен самостоятельно вызывать индукцию локального аллергического воспаления и продукцию аллерген-специфических антител [11–13]. В ходе данной работы нами было произведено многократное, дважды в неделю в течение 9 недель, интраназальное введение модельного антигена OVA в низкой (0.3 мкг) дозе в отсутствие и в присутствии 4 нг BaP. Действительно, согласно представленным на рис. 1 и табл. 1 данным, продукция OVA-специфических антител достоверно усиливалась под воздействием BaP. Продукция аллерген-специфических IgE формировалась только на позднем сроке (63-и сутки) и только при совместном введении антигена и BaP. В отсутствие поллютанта формирование продукции специфического IgE не отмечалось при сравнении с интактной группой (рис. 1а). В то же время продукция специфического IgG₁ под действием BaP на позднем сроке формировалась со схожей интенсивностью в группах, иммунизированных как в присутствии BaP, так и без него. Однако на раннем сроке было отмечено достоверное стимулирующее воздействие BaP на продукцию антител данного субкласса (рис. 1б).

 

Рис. 1. Гуморальный ответ у мышей линии BALB/c на ранний и поздний срок. Титры специфических антител класса IgE (а) и IgG1 (б) у мышей линии BALB/c – интактных (Инт) или иммунизированных интраназально антигеном овальбумином (OVA) без бензо(а)пирена либо овальбумином с бензо(а)пиреном (OVA + BaP) в указанные сроки. * p < 0.05, ** p < 0.01 – достоверности отличий указанной группы от интактной группы; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01 – достоверности отличий между группами, иммунизированными с ВаР и без него.

 

Таблица 1. Титры специфических IgE и IgG1 антител у животных после иммунизации антигеном OVA в отсутствии стимулов и в присутствии бензо(а)пирена

Срок иммунизации, дни	Группа, протокол	Титры IgE	Титры IgG1
0	Интактные	150 ± 15	110 ± 60
21	OVA	180 ± 30	180 ± 110
	OVA + BaP	390 ± 180	1500 ± 700*, #
63	OVA	120 ± 20	1000 ± 500**
	OVA + BaP	800 ± 300**, ##	1400 ± 700**

^*/** p < 0.05/0.01 (достоверности отличий между указанной группой и интактными животными).

^#/## p < 0.05/0.01 (достоверности отличий между указанной группой, иммунизируемой с BaP, и аналогичной группой без BaP).

 

Для выявления связи адъювантного эффекта поллютанта с различными механизмами В-лимфоцитарной активации (герминальные центры или экстрафолликулярный ответ) была проведена проточная цитометрия образцов клеток, взятых из ткани легких, региональных лимфатических узлов и селезенки. Анализ субпопуляций осуществляли по схеме, представленной на рис. 2. Согласно полученным данным, интраназальное введение антигена увеличивало содержание клеток B220⁺CD38⁺CD95⁺ в CD19⁺ В-лимфоцитах легких на позднем сроке (63-и сутки) (рис. 3а). Эти клетки представляли собой предшественников герминальных центров [33]. Несмотря на это, содержание В-лимфоцитов герминальных центров фенотипа B220⁺CD38^–CD95⁺ в В-лимфоцитах легких, напротив, снижалось. BaP не оказывал влияния на процентное соотношение данных субпопуляций В-лимфоцитов в легких. Содержание В-лимфоцитов – предшественников герминальных центров – достоверно возрастало под действием антигена также на раннем сроке (21-е сутки) в региональных лимфатических узлах. При этом BaP достоверно оказывал сильный стимулирующее воздействие на накопление В-лимфоцитов – предшественников герминальных центров в селезенке на раннем и позднем сроках, но не в региональных лимфатических узлах (рис. 3б, 3в). В региональных лимфатических узлах отмечали небольшое, но достоверное, снижение содержания В-лимфоцитов фенотипа герминального центра на раннем сроке в группе, иммунизированной с BaP (рис. 3д). Интраназальное введение антигена без BaP стимулировало небольшое достоверное накопление В-лимфоцитов фенотипа герминальных центров в селезенке. Однако введение BaP с антигеном значительно усиливало это накопление (рис. 3е). Хотя наибольшей интенсивности эффект BaP ⁺ достигал на позднем сроке (содержание В-лимфоцитов фенотипа герминальных центров под действием поллютанта увеличивалось приблизительно на порядок), эффект был достоверен и в образцах, взятых от мышей на раннем сроке. Аналогичная ситуация наблюдалась и в случае В-лимфоцитов – предшественников герминальных центров, отличавшихся сохранявшейся экспрессией CD38 (рис. 3в, 3е). Таким образом, имеется связь между влиянием BaP на продукцию антител и накоплением клеток герминальных центров и их предшественников в региональных лимфоузлах и легких.

 

Рис. 2. Стратегия анализа субпопуляций В-лимфоцитов и плазматических клеток. Цифрами обозначены следующие субпопуляции, упомянутые в статье: I – лимфоидные клетки в целом; II – единичные клетки; III – живые клетки; IV – CD138⁺CD19^–B220⁺ зрелые плазматические клетки; V – CD138⁺CD19^–B220^– зрелые плазматические клетки; VI – CD138⁺CD19⁺B220⁺ плазмабласты; VII – CD138⁺CD19⁺B220^–CD19⁺ незрелые плазматические клетки; VIII – CD38^–CD95⁺B220^–CD19⁺ активированные плазмабласты экстрафолликулярного ответа; IX – CD38⁺CD95⁺B220^–CD19⁺ активированные плазмабласты экстрафолликулярного ответа; X – CD38^–СD95⁺B220⁺CD19⁺ В-лимфоциты герминальных центров; XI – CD38⁺СD95⁺B220⁺CD19⁺ предшественники В-лимфоцитов герминального центра.

 

Рис. 3. Содержание субпопуляций фолликулярно активированных В-лимфоцитов у мышей на разные сроки. Доля В-лимфоцитов – предшественников клеток герминального центра CD38⁺CD95⁺B220⁺CD19⁺ (а–в) и собственно В-лимфоцитов герминального центра CD38^–CD95⁺B220⁺CD19⁺ (г–е) в CD19⁺ В-лимфоцитах ткани легких (а, г), региональных лимфатических узлов (б, д) и селезенки (в, е) у иммунизированных мышей в указанные сроки. * p < 0.05, ** p < 0.01 – достоверности отличий указанной группы от интактной группы; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01 – достоверности отличий между группами, иммунизированными с ВаР и без него.

 

Интраназальное введение антигена в отсутствие дополнительных стимулов не оказывало влияния на изменение субпопуляционного состава и содержания активированных CD38^–CD95⁺B220^– и CD38⁺CD95⁺B220^– плазмабластов [34] в общем пуле В-лимфоцитов легких (рис. 4а, 4г). Введение OVA достоверно повышало содержание этих клеток в региональных лимфатических узлах в образцах, взятых от животных на раннем сроке (рис. 4б, 4д). Кроме того, наблюдали достоверное увеличение содержания CD38^–CD95⁺B220^– плазмабластов на раннем и позднем сроках иммунизации в селезенке под действием антигена. В отношении CD38⁺CD95⁺B220⁺ плазмабластов селезенки подобное наблюдали на раннем сроке (рис. 4в, 4е). Введение BaP достоверно и заметно (в ~2–3 раза) повышало содержание субпопуляций активированных плазмабластов в селезенке, но не региональных лимфатических узлах, на раннем сроке (рис. 4в, 4е). В образцах легких, взятых у мышей на позднем сроке, когда происходило формирование продукции IgE, наблюдали повышение содержания активированных плазмабластов в ткани легких, которое было достоверно для CD38^–CD95⁺B220^– субпопуляции (рис. 4а, 4г). Хотя поллютант не оказал значительного влияния на накопление субпопуляций CD38⁺CD95⁺B220^– плазмабластов в региональных лимфоузлах по сравнению с группами мышей, иммунизированных без него, именно в группах с поллютантом сохранилось их повышенное содержание, наблюдавшееся на всех сроках иммунизации по сравнению с интактными животными (рис. 4б). Полученные данные указывают на связь адъювантного воздействия BaP на продукцию специфического IgE, сформировавшуюся на позднем сроке, с накоплением экстрафолликулярно активированных плазмабластов локально, в ткани легких. Также существовала связь между адъювантным влиянием на продукцию специфического IgG₁ на раннем сроке иммунизации с усилением накопления под влиянием BaP экстрафолликулярно активированных плазмабластов в селезенке на том же сроке.

 

Рис. 4. Содержание субпопуляций экстрафолликулярно активированных В-лимфоцитов у мышей на разные сроки. Доля различных субпопуляций экстрафолликулярно активированных В-лимфоцитов – CD38⁺CD95⁺B220^–CD19+ (а–в) и CD38^–CD95⁺B220^–CD19⁺ (г–е) в CD19⁺ В-лимфоцитах ткани легких (а, г), региональных лимфатических узлов (б, д) и селезенки (в, е) у иммунизированных мышей в указанные сроки. * p < 0.05, ** p < 0.01 – достоверности отличий указанной группы от интактной группы; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01 – достоверности различий между группами, иммунизированными с ВаР и без него.

 

Часть субпопуляции плазматических клеток даже после “созревания” и утраты экспрессии CD19 продолжает экспрессировать маркер B220, отличия плазматических клеток B220⁺ от B220^– пока не полностью понятны [35]. По ряду данных, фракция B220^–CD138⁺ плазматических клеток включает в себя больше долгоживущих плазматических клеток, чем B220⁺ [36]. Под действием антигена происходило снижение содержания CD19^–CD138⁺B220⁺ зрелых плазматических клеток в ткани легких и в региональных лимфатических узлах на позднем сроке (рис. 5а, 5б). Напротив, антиген индуцировал накопление этой субпопуляции зрелых плазматических клеток в селезенке на обоих сроках, причем на позднем сроке процесс стимулировался BaP (рис. 5в). В отношении субпопуляции CD19^–CD138⁺B220^–, которую с осторожностью можно назвать более долгоживущей субпопуляцией зрелых плазматических клеток, чем предыдущая, закономерности были во многом сходны. Антиген уменьшал их содержание на позднем сроке в ткани легких и региональных лимфоузлах. Однако на раннем сроке в этих органах наблюдали рост их содержания (рис. 5г, 5д). Как и в прошлом случае, антиген стимулировал накопление данных субпопуляций в селезенке на раннем сроке, а на позднем сроке BaP усиливал этот процесс (рис. 5е).

 

Рис. 5. Содержание субпопуляций зрелых плазматических клеток у мышей на разные сроки. Доля субпопуляций зрелых CD138⁺CD19^– плазматических клеток, имеющих высокий (а–в) и низкий (г–е) уровень экспрессии B220 в живых лимфоидных клетках ткани легких (а, г), региональных лимфатических узлов (б, д) и селезенки (в, е) у иммунизированных мышей в указанные сроки. * p < 0.05, ** p < 0.01 – достоверности отличий указанной группы от интактной группы; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01 – достоверности отличий между группами, иммунизированными с ВаР и без него.

 

Лимфоциты фенотипа CD138⁺CD19⁺B220⁺ соответствуют по фенотипу терминально дифференцированным, но способным к делению короткоживущим плазмабластам, формируемым в экстрафолликулярных фокусах [37]. Согласно полученным данным, под воздействием антигена происходит увеличение содержания плазмабластов фенотипа CD138⁺CD19⁺B220⁺ в клетках региональных лимфатических узлов и селезенки на раннем сроке, которое при более длительной иммунизации снижается, оставаясь выше уровня у интактных мышей, в случае с селезенкой (рис. 6в), или ниже, в случае с региональными лимфоузлами (рис. 6б). Подобного роста не наблюдается в случае с образцами ткани легких (рис. 6а, 6г). Интересно, что нами была также обнаружена субпопуляция CD138⁺CD19⁺B220^– незрелых плазматических клеток. Введение антигена усиливает их накопление в региональных лимфатических узлах и селезенке в основном на раннем сроке (рис. 6е). Введение ВаР несколько снижало антиген-индуцированное накопление плазмобластов и в селезенке, и в лимфоузлах. При этом на позднем сроке BaP усиливал накопление данной субпопуляции только в региональных лимфатических узлах (рис. 6д, 6е). В ткани легких в группе, иммунизированной антигеном и BaP, наблюдали содержание этих клеток на раннем сроке, а в группе, иммунизированной антигеном без BaP, – на позднем сроке (рис. 6г). Воздействие BaP на продукцию специфического IgE, таким образом, было связано как с влиянием на накопление к позднему сроку субпопуляций зрелых CD19^–CD138⁺ плазматических клеток в селезенке, так и с накоплением незрелых плазматических клеток фенотипа CD19⁺CD138⁺B220^– региональных лимфоузлов.

 

Рис. 6. Содержание субпопуляций незрелых плазматических клеток у мышей на разные сроки. Доля субпопуляций незрелых CD138⁺CD19⁺ плазматических клеток, имеющих высокий (а–в) и низкий (г–е) уровень экспрессии B220 в живых лимфоидных клетках ткани легких (а, г), региональных лимфатических узлов (б, д) и селезенки (в, е) у иммунизированных мышей в указанные сроки. * p < 0.05, ** p < 0.01 – достоверности отличий указанной группы от интактной группы; ^# p < 0.05, ^## p < 0.01 – достоверности отличий между группами, иммунизированными с ВаР и без него.

 

В нашей прошлой работе нами было установлено, что ЧДТ способны индуцировать продукцию специфического IgE при введении как с высокими, так и с низкими дозами антигена [38]. В настоящей работе нами получены данные, согласно которым BaP, прототипный ПАУ, также стимулировал продукцию специфического IgE (на позднем сроке) и IgG1 (на более раннем сроке) при интраназальном введении с антигеном. Это вполне согласуется с работами, согласно которым именно ПАУ – основные действующие компоненты ЧДТ (частиц дизельного топлива) [6–10], и их введение самих по себе способно стимулировать локальное аллергическое воспаление [11–13].

В ряде работ [22–24, 39] была показана важная роль локального переключения изотипов в продукции специфического IgE у больных с астмой и аллергическим ринитом. В данной работе удалось установить, что под действием BaP наблюдается накопление на позднем сроке CD38^–CD95⁺B220^–CD19⁺ экстрафолликулярно активированных В-лимфоцитов в легких, но не во вторичных лимфоидных органах. В нашей прошлой работе [40] было выдвинуто предположение, что эти лимфоциты, напоминающие своим фенотипом клетки герминального центра, представляют собой экстрафолликулярно активированные плазмабласты, взаимодействующие с экстрафолликулярными Т-хелперами. В результате активации CD40рецептора на В-лимфоцитах происходит подъем уровня экспрессии CD95 [41], а снижение уровня экспрессии CD38 может свидетельствовать об их дифференцировке в зрелые плазматические клетки [42]. Сочетание поверхностной экспрессии CD19 с отсутствием поверхностной экспрессии B220 и CD138 указывает тем не менее на природу этих клеток как ранних плазмабластов [33]. Однако в данном случае связь продукции специфического IgE этой субпопуляцией экстрафолликулярно активированных плазмабластов вызывает сомнение, поскольку продукция специфического IgE на позднем сроке не была связана с накоплением в ткани легких зрелых CD138⁺CD19^– плазматических клеток, что может свидетельствовать о неблагоприятных условиях для их формирования в ткани. Несмотря на то что антиген индуцировал накопление в ткани легких CD38⁺CD95⁺B220⁺CD19⁺ B-лимфоцитов, являющихся по фенотипу предшественниками герминальных центров [34], накопление В-клеток собственно герминальных центров (CD38^–CD95⁺ B220⁺CD19⁺) не происходило, и ВаР никак не влиял на этот процесс. Это согласуется с данными нашей прошлой работы, в которой ВаР стимулировал локальное переключение в легких, активируя экстрафолликулярный иммунный ответ, но не формирование герминальных центров [38].

Согласно данным настоящей работы, влияние BaP на субпопуляционный состав В-лимфоцитов проявляется в основном в селезенке. Введение антигена стимулировало накопление В-лимфоцитов фенотипа герминального центра CD38^–CD95⁺B220⁺CD19⁺ в селезенке. Аэрополлютант BaP значительно и достоверно увеличивал их содержание как на раннем, так и на позднем сроке, а также увеличивал содержание предшественников В-лимфоцитов фенотипа герминального центра CD38⁺CD95⁺B220⁺CD19⁺. Именно в селезенке происходило увеличение процентного содержания CD138⁺CD19^– зрелых плазматических клеток, в региональных лимфатических узлах происходило только накопление одной из субпопуляций незрелых плазматических клеток (CD138⁺CD19⁺B220^–). Данные о накоплении зрелых плазматических клеток параллельно с накоплением В-лимфоцитов герминального центра позволяют предположить, что основные события, связанные с адъювантным влиянием поллютанта на продукцию IgE, происходят в селезенке (а не в ткани легких, где усиление накопления плазматических клеток под действием BaP не наблюдалось). Хотя введение антигена приводило к накоплению в региональных лимфоузлах некоторых субпопуляций активированных В-лимфоцитов, этот процесс не был связан с адъювантным эффектом BaP. Полученные данные находятся в противоречии с рядом литературных данных, согласно которым вводимый интраназально антиген сначала транспортируется в лимфатические узлы и лишь затем переносится в селезенку как с помощью дендритных клеток [43, 44], так и В-лимфоцитов [45]. С другой стороны, наши данные согласуются с результатами работы, в которой В-клетки переносили антиген из легких одновременно как в дренирующие легкие лимфатические узлы, так и в селезенку [46]. Это происходит в том случае, если В-лимфоциты переносят антиген на своих В-клеточных рецепторах, имеющих к нему низкое сродство [46]. В таком случае должна иметь место миграция В-лимфоцитов из ткани легких в селезенку. Косвенно это подтверждается уменьшением под действием антигена содержания в легких В-лимфоцитов фенотипа герминального центра. Действительно, можно предположить, что именно В-лимфоциты играют основную роль на ранних стадиях как клетки, первые воспринимающие антиген [47] и иногда переносящие его из легких в другие органы, что было отмечено в ряде работ [45, 46, 48], особенно если использовали низкие дозы антигена [47]. Другое объяснение селективности эффекта поллютанта в отношении накопления зрелых плазматических клеток и клеток фенотипа герминальных центров именно в селезенке может объясняться наличием там особых субпопуляций цитокин-продуцирующих и антиген-презентирующих клеток. Так, в условиях воспалительной реакции в селезенке могут формироваться особые CD11b⁺Gr1⁺ миелоидные клетки, которые стимулируют формирование долгоживущих плазматических клеток [49], в свою очередь, способных стимулировать дифференцировку Т-фолликулярных хелперов [50] и, следовательно, герминальных центров. Однако пока это описано только в условиях аутоиммунной патологии. Имеют ли данные процессы место в настоящей модели, предстоит выяснить в дальнейших работах.

С другой стороны, имеются также данные о том, что антиген из легких в селезенку могут доставлять и дендритные клетки [51]. Роль В-лимфоцитов и дендритных клеток в переносе антигена в селезенку также еще предстоит выяснить в следующих работах.

Исходя из данных нашей работы, эффект BaP мог быть связан как с накоплением В-лимфоцитов фенотипа герминальных центров (селезенка), так и с экстафолликулярной активацией (легкие). Однако, поскольку эффект BaP в первом случае проявлялся как на раннем, так и на позднем сроке и имел место в отношении двух субпопуляций, а не одной, первое предположение более достоверно. Под действием антигена в отсутствие BaP происходило накопление как CD38^–CD95⁺B220^–, так и CD38⁺CD95⁺B220⁺ плазмабластов, а BaP на 21-е сутки усиливал их содержание в селезенке. Все же влияние на их количество на позднем сроке (63-и сутки) в центральных лимфоидных органах, когда непосредственно происходила достоверная продукция IgE, поллютант не оказывал. Поэтому исходя из кинетики продукции антител логичнее предположить, что действие BaP на экстрафолликулярную активацию В-лимфоцитов было скорее связано с его адъювантным воздействием на продукцию специфического IgG₁ на раннем сроке. Такая точка зрения косвенно подтверждалась стимулирующим влиянием BaP преимущественно на накопление зрелых плазматических клеток, формирующихся в герминальном центре [14], но не незрелых плазмабластов экстрафолликулярного ответа. Связь BaP с некоторым накоплением на позднем сроке экстрафолликулярно активированных плазмабластов в легких, но не в других органах, выглядит сомнительно еще и в связи с отсутствием связанного с этим накопления в ткани легких плазматических клеток. Надо полагать, что условия для их формирования и(или) персистенции в легких были неблагоприятны.

Полученные результаты согласуются с рядом литературных данных, согласно которым формирование продукции IgE так или иначе связано с реакцией герминальных центров [28, 29, 31], и вступают в противоречие с рядом клинических работ и с нашими собственными данными, полученными ранее на модели с использованием иммунизации в область холки, подкожная жировая клетчатка которой богата тканеассоциированными лимфоидными кластерами [22–24]. В той работе нами был показан преимущественно локальный характер ранних стадий аллергического иммунного ответа и его связь с экстрафолликулярной В- и Т-клеточной активацией [40]. Однако, поскольку модели в этих двух работах были существенно разные как по методике (в настоящей работе интраназально, в предыдущей подкожно), так и по использованию адъюванта (в настоящей работе BaP, в прошлой – без адъюванта), прямого противоречия между этими двумя работами нет. Различия легко объяснить, принимая во внимание особое адъювантное воздействие ВаР на иммунный ответ [11–13]. Также важно, что именно при интраназальном, но не подкожном, способе введения, уже на ранних этапах осуществляется доставка антигена в селезенку [46], что, вероятно, обусловлено особыми свойствами легочных В-лимфоцитов и свойствами самого альвеолярного барьера.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Животные. В работе использовали самок мышей линии BALB/c 7–8-недельного возраста, вес 18–22 г. Животные были получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий (Андреевка, Россия). Животных содержали при 12-часовом цикле свет–темнота и кормили ad libitum, в качестве подстилки использовали древесные опилки. Общее число животных составило 30, по 6 в опытных группах и интактной.

Иммунизация и забор образцов. В качестве модельного антигена использовали овальбумин, OVA (>98% чистоты, Art. A5503, фракция V; Sigma-Aldrich, Германия). Содержание LPS в пересчете на 10 мкг антигена составляло 0.04 EU согласно LAL-тесту. Антиген вводили интраназально в физиологическом растворе в объеме 50 мкл, в количестве 0.3 мкг на введение. Части животным также вводили BaP в дозе 4 нг в смеси с антигеном интраназально в общем объеме 50 мкл. В опыте участвовало по две группы животных, забитых на разные сроки, которым вводили антиген без BaP, и две группы животных, которым вводили антиген и BaP, n = 6 в каждой группе. Результаты сопоставляли с параметрами интактной группы неиммунизированных мышей. Введение OVA и BaP осуществляли под изофлурановой анестезией 3 раза в неделю в течение первых двух недель и по 2 раза в неделю в течение последующих 7 недель. Максимальная продолжительность протокола составляла 9 недель (63 дня). Часть животных умерщвляли через 3 недели (21 день) после начала иммунизации, оставшуюся часть – в конце протокола.

У животных брали образцы крови для получения сыворотки из подглазничного синуса. Полученные образцы инкубировали при 20°С, затем центрифугировали при 600 g для отделения тромба и хранили при –20°С до дальнейшего использования.

Для взятия органов – ткани легких, региональных лимфатических узлов, селезенки – животных забивали методом цервикальной дислокации. Порезанные на небольшие кусочки образцы ткани легких инкубировали 30 мин с раствором, содержащим 1% коллагеназы D и 0.1 ед. ДНКазы I (Sigma-Aldrich, Германия). Далее осуществляли гомогенизацию перетиранием с помощью пестика в лунке 24-луночного планшета. Образцы региональных лимфоузлов и селезенки гомогенизировали без использования ферментов.

Иммуноферментный анализ. Для иммуноферментного анализа использовали 96-луночные планшеты (Costrar, США). Для формирования подложки при определении продукции специфического IgE в лунки вносили раствор OVA в PBS (pH 7.2) в концентрации 20 мкг/мл, далее инкубировали планшет в течение ночи при 4°С. Между стадиями осуществляли трехкратную отмывку буфером PBS, содержащим в составе 0.05% Тween-20. Блокирование осуществляли в течение часа 5%-ным раствором БСА в PBS, который вносили в объеме 100 мкл. Затем наносили сыворотки в разных разведениях в том же блокирующем буфере. Инкубацию с сыворотками осуществляли в течение суток при 4°С. На следующей стадии наносили конъюгат антител к мышиным IgE (клон 23G3, Abcam, США), меченный пероксидазой хрена (ПХ), в разведении 1 : 2000. Реакцию проявляли с использованием субстрата на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в концентрации 1 мМ и перекиси водорода в концентрации 4 мМ. Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра Multiscan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 450 нм, вычитая из нее значение оптической плотности при 620 нм как фоновое. В качестве отрицательного контроля в каждом планшете в восемь лунок не вносили сыворотки (фон). За титр сыворотки принимали то ее наибольшее разведение, при котором соответствующая ей оптическая плотность в реакции становилась равной фоновой плюс три стандартных отклонения.

Продукцию специфического IgG₁ оценивали в целом аналогично, но со следующими отличиями: при формировании подложки вносили раствор OVA с концентрацией 5 мкг/мл, для детекции использовали первичный конъюгат – антитела к мышиным IgG₁ (клон RMG1-1, BioLegend, США) в разведении 1 : 5000 и вторичный конъюгат стрептавидин-ПХ (BioLegend, США) в разведении 1 : 7000.

Проточная цитометрия. Гомогенизированные образцы органов и тканей использовали для проточной цитометрии. Образцы вначале отмывали в PBS центрифугированием при 300 g. Полученный клеточный осадок ресуспендировали и окрашивали красителем Zombie Aqua (BioLegend, США) в разведении 1 : 1000 согласно рекомендации производителя (20 мин при комнатной температуре). Краситель селективно окрашивал мертвые клетки, что было необходимо для их отсечки в процессе последующего анализа. Затем образцы вновь центрифугировали и ресуспендировали в FACS-буфере (PBS с добавлением 0.5% БСА и 0.01% азида натрия). Суспензию клеток пропускали через фильтр с диаметром пор 80 мкм, затем окрашивали антителами (BioLegend, США) в разведениях, рекомендованных производителем. Использовали следующие антитела: антитела к мышиным CD138, меченные BV421 (клон 281-2); антитела к мышиным CD38, меченные FITC (клон 90); антитела к мышиным CD95, меченные PE (клон SA367H8); антитела к мышиным B220, меченные PECy7 (клон RA3-6B2); антитела к мышиным CD19, меченные APC (клон 6В5). Проточную цитометрию проводили на приборе MACS Quant Tyto (Miltenyi Biotech, Гладбах, Германия). Данные обрабатывали в программе FlowJo V10 (BD Biosciences, США).

Анализ клеточных субпопуляций осуществляли так, как показано на рис. 2. В-лимфоциты определяли как CD19⁺CD138^–, зрелые плазматические клетки как CD19^–CD138⁺, незрелые плазматические как CD19⁺CD138⁺. Плазмабласты экстрафолликулярного ответа определяли как CD19⁺B220^– [33], они различались по экспрессии CD38 и CD95. В-лимфоциты типичных герминальных центров определяли как CD19⁺B220⁺CD38^– CD95⁺ [34], В-лимфоциты – предшественники герминального центра – как CD19⁺B220⁺CD38⁺ CD95⁺ [35].

Статистическая обработка полученных данных. Все результаты представлены в виде средних значений и соответствующих величин стандартного отклонения. Статистическую значимость различий между группами определяли с использованием ANOVA-теста с поправкой на множественное сравнение. Значения p по данному тесту, эквивалентные p < 0.05 с поправкой на множественное сравнение, считали статистически достоверными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Адъювантное воздействие BaP на синтез IgE в низкодозовой модели аллергии оказался связанным со стимуляцией дифференцировки В-лимфоцитов в сторону В-клеток фенотипа герминального центра в селезенке, но не в региональных лимфатических узлах или ткани легких. Локальная активация В-лимфоцитов в легких была сопряжена с индукцией экстрафолликулярного ответа под действием поллютанта в ткани легких. При этом происходила стимуляция формирования зрелых плазматических клеток, но не незрелых плазмабластов, в селезенке. Механизмы, связанные с продукцией IgE в данной модели, таким образом, существенно отличаются от механизмов, описанных нами ранее для безадъювантной модели с подкожным введением антигена.

Таким образом, в настоящей работе была продемонстрирована модель аллергического воспаления, индуцируемого BaP, которую можно использовать для дальнейшего изучения механизмов действия аэрополлютантов на иммунную систему. Практическая значимость результатов настоящей работы заключается в том, что они показывают необходимость разработки таких лекарственных средств для предотвращения формирования IgE-продуцирующих В-лимфоцитов, которые блокировали бы переключение на синтез IgE как в В-лимфоцитах экстрафолликулярных фокусов, так и в В-лимфоцитах герминальных центров.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы работы выражают благодарность научному сотруднику лаборатории клеточных взаимодействий ФГБУН ГНЦ ИБХ РАН за помощь при работе на приборе – проточном цитометре MACS Quant Tyto.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект № 23-25-10044) за 2023–2024 гг. и поддержке бюджета города Москвы.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В настоящей работе использовали лабораторных животных – самок мышей линии BALB/c. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC) Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (протокол № 147/2021).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Авторы ДБЧ, МАС участвовали в проведении экспериментов с лабораторными животными, ИФА и измерениях методом проточной цитометрии; авторы ОАШ, ГВФ и ААГ участвовали в отборе проб и подготовке клеток для проточной цитометрии; авторы РАВ и ОДК участвовали в анализе исходных данных, статистической обработке данных; автор ДБЧ также участвовал в подготовке гистограмм и рисунков данных, общем планировании работы, подготовке исходного варианта статьи; автор ГВФ участвовал в редактировании и корректировке окончательного варианта статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

作者简介

D. Chudakov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

编辑信件的主要联系方式.
Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

O. Shustova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

M. Streltsova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. Generalov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

R. Velichinskii

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

O. Kotsareva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

G. Fattakhova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS

Email: boris-chudakov@yandex.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

参考

补充文件