Inhibition of dipeptidylpeptidase-IV by 2-S-cyanopyrrolidine inhibitors of prolyl endopeptidase

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Хорошо известна регуляторная роль протеолитических ферментов, контролирующих в организме функции эндогенных пептидов. Считается, что эти ферменты управляют деградацией белков, активацией зимогенов, синтезом активных пептидов из неактивных предшественников, а также инактивацией нейропептидов. Множество пептидаз содержится в мозге, равно как и в других тканях. Пептидазы, участвующие в белковом обмене, необходимы для нормальной жизни клеток, но некоторые пептидазы головного мозга могут быть вовлечены в процессы, специфичные для нейронов или глиальных клеток. Даже незначительные нарушения функционирования этих ферментов вызывают развитие ряда патологических состояний центральной нервной системы (ЦНС): деменции, паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и др. [1]. Производя, модифицируя и инактивируя нейропептиды, протеазы и пептидазы контролируют концентрацию этих биологических регуляторов.

Эндо- и экзопептидазы головного мозга играют решающую роль в инактивации множества мощных нейропептидов. Пролилэндопептидаза (EC 3.4.21.26, PEP), широко распространенная в тканях млекопитающих, специфически расщепляет пептидные связи на карбоксильном конце остатка пролина в пролинсодержащих эндогенных пептидах. PEP гидролизует тиролиберин, вазопрессин, нейротензин, вещество Р, ангиотензины и другие нейропептиды, регулирующие память. Активность PEP изменяется у больных болезнью Альцгеймера, синдромом Паркинсона, мышечными дистрофиями и другими нейродегенеративными заболеваниями. Дипептидилпептидаза IV типа (EC 3.4.14.5, DPP4) расщепляет пептиды с незамещенных N-концов. Этот фермент участвует в расщеплении, например, вещества Р и гонадолиберина. DPP4 также инактивирует нейропептид Y, проявляющий анксиолитическую и нейропротекторную активность [2]. В ряде патентов показано, что психотропные препараты на основе нейропептида Y можно применять в сочетании с ингибиторами DPP4, хорошо известными как препараты для терапии инсулиннезависимого диабета II типа – ситаглиптином (Merck) и вилдаглиптином (Novartis) [3]. Другие ингибиторы DPP4 используются в качестве противоопухолевых, противоревматических, анти-ВИЧ и нейропротекторных средств. Предыдущие исследования установили участие DPP4 в механизмах развития тревоги и депрессии [4].

Роль пролинспецифических ферментов в патогенезе психических заболеваний, в том числе тревожных расстройств и депрессии, изучается уже более 20 лет. В клинической картине большой депрессии наблюдают экспрессию PEP и подавление активности DPP4 [5]. В наших исследованиях была выявлена высокая антидепрессивная и анксиолитическая активность ингибиторов PEP, в 5–10 раз превышающая активность таких классических психотропных препаратов, как амитриптилин и диазепам [6]. Данные об изменениях активности пролинспецифических ферментов в клинике большой депрессии послужили основой для разработки лабораторной модели тревожно-депрессивного состояния у крыс [7, 8] и исследований активности PEP и DPP4 у больных с тревожными расстройствами при терапии феназепамом и фабомотизолом [9]. Было показано, что активность DPP4 в сыворотке крови здоровых матерей до и после родов выше, чем у небеременных здоровых женщин и повышается по мере приближения родов. Также установлено, что DPP4 участвует в процессах воспаления и нейродегенерации при ишемическом поражении ЦНС [10]. Все вышесказанное определяет перспективность целенаправленного синтеза, биохимического исследования in vitro и изучения фармакологических эффектов новых ингибиторов PEP и DPP4.

Эксперименты показали, что синтезированные нами оригинальные низкомолекулярные ингибиторы PEP и DPP4 (рис. 1) обладали выраженными ноотропными, антидепрессантными, анксиолитическими и геропротекторными свойствами [11]. Исследуя метаболизм нового ингибитора PEP сукцинилаланил-2-цианопирролидина, мы обнаружили его способность подавлять и активность DPP4. Этот феномен был исследован также на других ингибиторах PEP методами ферментативной кинетики, и некоторые N-защищенные производные 2-S-цианопирролидина ингибировали DPP4.

 

Рис. 1. Структуры ингибиторов пептидаз, исследуемых в настоящей работе.

 

Но субстрат DPP4, как и аналогичный ингибитор, такой как глицил-2-цианопирролидин, должен иметь протонированный и заряженный N-конец, чтобы связываться с этой пептидазой. Крупные защитные группы на N-конце ингибиторов PEP, активных в отношении DPP4, казалось бы, должны препятствовать их связыванию с активным центром DPP4. Поэтому мы решили исследовать взаимодействия аминокислотных производных 2-S-цианопирролидина с PEP и DPP4, моделируя структуры соответствующих комплексов методами классической молекулярной динамики. При этом мы преследовали следующие цели: вопервых, выявить особенности взаимодействия этих веществ с активным центром PEP, и, вовторых, составить структурно обоснованное представление об их взаимодействии с активным центром DPP4, чтобы объяснить их неожиданную активность в ингибировании этого фермента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Антиамнестические свойства ингибиторов PEP хорошо известны и изучались на модели скополаминовой амнезии [12]. Наши исследования антиамнестического действия цианопирролидиновых ингибиторов PEP на скополаминовую амнезию CPAR показали, что CbzMetPrn (1 мг/кг) обладает высокой активностью, снижая активность PEP в лобной коре крыс на 17% и увеличивая латентное время на 256%. Явные признаки антиамнестической активности наблюдаются и для CbzTrpPrn, однако из-за значительного разброса показателей у отдельных животных различия не достигают достоверного уровня. Более того, в условиях скополаминовой амнезии цианопирролидиновые ингибиторы PEP оказались более активными, чем такие стандартные ноотропы, как пирацетам (300 мг/кг) и пиритинол (100 мг/кг).

При изучении метаболизма N-ацильных производных аминоацил-2-цианопирролидиновых ингибиторов PEP мы обнаружили снижение активности ДПП-4 на начальном отрезке времени. Этот неожиданный эффект был примерно в 100 раз слабее, чем у PEP, и наблюдался для ингибиторов общей формулы X-Y-2-S-цианопирролидина, где X – защитная группа, а Y – любая аминокислота кроме глицина. Наши последующие измерения IC₅₀ показали, что X-Y-2-S-пирролидиновые ингибиторы PEP могут ингибировать DPP4, если X представляет собой бензилоксикарбонильную или сукцинильную защитную группу, а Y не является остатком глицина или пролина, т.е. представляют собой L-аминокислотные остатки с боковыми цепями (табл. 1). Чтобы понять это явление, было проведено молекулярно-динамическое моделирование исследуемых соединений с PEP и DPP4. Структуры PEP и DPP4 были стабильными на всех полученных траекториях: RMSD пептидного остова не превышало 0.3 нм для каждой из них (см. рис. S2 в дополнительных материалах). Элементы вторичной структуры моделируемых белков сохранялись на всей траектории для каждого моделируемого комплекса пептидаза–ингибитор. Анализ полученных данных показывает, что цианопирролидиновые ингибиторы PEP могут устанавливаться в активном центре DPP4 с помощью водородных связей и гидрофобных взаимодействий, а различия в ингибирующей активности в отношении этих ферментов связаны со структурными особенностями их активных центров.

 

Таблица 1. Константы ингибирования PEP и DPP4

Соединение	Ki, нМ
	PEP	DPP4
HGlyPrn	–	2.5 ± 0.09
BocGlyPrn	10.0 ± 0.36	–
CbzGlyPrn	3.2 ± 0.12	–
CbzAlaPrn	4.2 ± 0.15	1917 ± 69
CbzMetPrn	1.7 ± 0.06	1917 ± 33
CbzTrpPrn	7.5 ± 0.27	2917 ± 105
CbzProPrn	0.8 ± 0.03	–
CbzProPrAl	0.8 ± 0.04	–
SucAlaPrn	2.5 ± 0.09	1583 ± 57
SucMetPrn	1.7 ± 0.07	1083 ± 39

 

Активный центр PEP состоит из четырех основных элементов, каждый из которых определенным образом участвует в связывании ингибитора. Во-первых, это каталитическая триада сериновой протеазы, состоящая из остатков Ser554, His680 и Asp641, – ее серин может взаимодействовать с нитрильной группой пролилнитрила, образуя имидат и, таким образом, ковалентно связывая ингибитор. Во-вторых, это непосредственно примыкающая к нему гидрофобная полость (далее – ближняя гидрофобная полость), связывающая пятичленный цикл пролилнитрила. Она состоит из остатков Phe476, Val644, Val580 и Trp595; на индольный фрагмент последнего и ложится пятичленный цикл пролилнитрила, направляя нитрильную группу к каталитическому серину. Индольный фрагмент Trp595 также образует водородную связь с карбонильным кислородом N-концевой защитной группы ингибитора, соответствующей –2 от пролина остатку в расщепляемом пептиде (рис. 2). В-третьих, это остаток Arg643, образующий водородную связь с карбонильной группы аминокислотного остатка ингибитора (соответствующего –1 от пролина остатку в расщепляемом пептиде). В-четвертых, это остатки Phe173, Ile591 и Met235, составляющие гидрофобную зону (далее – дальняя гидрофобная зона), которая связывает гидрофобную группу N-концевой защиты ингибитора.

 

Рис. 2. Водородные связи, образуемые ингибиторами с активным центром PEP. AA – соответствующий аминокислотный остаток ингибитора, Protect – защитная группа. См. также табл. S1 в дополнительных материалах.

 

Активный центр DPP4 построен иначе. Он содержит, во-первых, каталитическую триаду Ser630, His740 и Asp708, во-вторых, ближнюю гидрофобную полость, состоящую из остатков Tyr547, Tyr631, Tyr662, Tyr666, Val656 и Trp659, чьи роли в связывании ингибитора аналогичны соответствующим элементам активного центра PEP с той разницей, что в DPP4 место Trp595 PEP занимает Tyr662, не образующий водородных связей с карбонильным кислородом N-концевой защитной группы ингибитора. Его конформация также не позволяет пятичленному циклу пролилнитрила лечь на плоскость бензольного кольца. В-третьих, активный центр DPP4 включает в себя остатки Glu205 и Glu206 (далее – отрицательный выступ), образующие водородные связи и ионные мостики с положительно заряженным N-концом ингибитора, не несущего защитной группы. Также он содержит гидрофобную полость, образуемую остатками Trp201, Val202 и Val665, в которую может входить боковая цепь N-концевого аминокислотного остатка ингибитора.

Строение активного сайта PEP благоприятствует связыванию ингибиторов, несущих гидрофобную защитную группу на N-конце, таких как BocGlyPrn или CbzGlyPrn. Все они образуют устойчивые водородные связи с Trp595 и Arg643, описанные выше (табл. 2), а их трет-бутоксикарбонильные или карбобензоксильные защитные группы взаимодействуют с дальней гидрофобной зоной, что выражается в их прочном связывании с PEP (рис. 3). Бензольное кольцо карбобензоксильной защитной группы дополнительно образует π-стэкинг-взаимодействие с остатком Phe173 (табл. 2). Сукцинильная защитная группа заряжена отрицательно, что, с одной стороны, исключает взаимодействие с дальней гидрофобной зоной PEP, но, с другой стороны, создает водородные связи и ионные мостики с остатками Arg643 и Arg252. Если же ингибитор имеет свободный и положительно заряженный N-конец, как HGlyPrn, то он лишен возможности взаимодействовать с дальней гидрофобной зоной и не может образовывать водородную связь с Trp595. Более того, это приводит к электростатическому отталкиванию N-конца от Arg643, что дестабилизирует водородную связь последнего с карбонильным углеродом. Это объясняет неспособность HGlyPrn подавлять активность PEP.

 

Таблица 2. Встречаемость π-стэкинг-взаимодействий карбобензоксильной защитной группы с активными центрами PEP и DPP4

Соединение	Встречаемость стэкинг-взаимодействий, %
	PEP Phe173	DPP4 Tyr547
CbzGlyPrn	25	–
CbzAlaPrn	23	22
CbzMetPrn	24	17
CbzTrpPrn	19	–
CbzProPrn	23	15
CbzProPrAl	53	4

 

Рис. 3. Конформации пирролидоновых ингибиторов пролилэндопептидазы (показаны темно-синим цветом) в активном центре PEP, полученные молекулярно-динамическим моделированием. Водородные связи показаны черным пунктиром. Желтым цветом изображена ближняя гидрофобная зона, голубым – гидрофобная полость, красным – негативный выступ. (а) – HGlyPrn; (б) – CbzGlyPrn; (в) – CbzMetPrn; (г) – SucMetPrn.

 

На активность ингибиторов PEP также положительно влияет конформационная жесткость аминокислотного остатка, наиболее выраженная для CbzProPrn и CbzProPrAl. Конформация остатка пролина благоприятствует стабилизации характерных водородных связей ингибитора с Trp595 и Arg643, так же как и стабилизации π-стэкинг-взаимодействия карбобензоксильной защитной группы с остатком Phe173. Сочетание этих факторов способствует повышенной активности этих ингибиторов.

Строение активного центра DPP4 требует от ингибитора наличия свободного и положительно заряженного N-конца, с которым может взаимодействовать отрицательный выступ, что и наблюдается для HGlyPrn. Напротив, BocGlyPrn или CbzGlyPrn и другие ингибиторы, содержащие N-концевые защитные группы, не только не могут взаимодействовать с отрицательным выступом DPP4, но и вступают с ним в стерическое противоречие: защитная группа не помещается в отводимом ей месте. Все это препятствует связыванию таких соединений с DPP4. Впрочем, в случае CbzAlaPrn и, особенно, CbzMetPrn соединение принимает такую конформацию, в которой карбоксибензоильная защитная группа взаимодействует с остатком Tyr547 (табл. 2), а алифатическая боковая цепь погружается в гидрофобную полость. Это частично компенсирует общую слабость связывания, делая CbzMetPrn в разы более активным ингибитором DPP4, чем CbzAlaPrn и, тем более, CbzTrpPrn (табл. 1). Отрицательно заряженная сукцинильная защитная группа SucAlaPrn и, особенно, SucMetPrn, с одной стороны, отталкивается от отрицательного выступа, но, с другой стороны, может образовывать водородные связи с остатком Arg125, входящим в состав отрицательного выступа. Сольватация сукцинильной защитной группы и формирование ею водородных связей в сочетании с погружением боковой цепи остатка метионина в гидрофобную полость аналогичным SucMetPrn образом упрочает связывание SucMetPrn относительно SucAlaPrn. Но кулоновское отталкивание сукцинильной защитной группы и отрицательного выступа делает SucMetPrn менее активным ингибитором DPP4, нежели CbzMetPrn (рис. 4).

 

Рис. 4. Конформации пирролидоновых ингибиторов пролилэндопептидазы (показаны темно-синим цветом) в активном центре DPP4, полученные молекулярно-динамическим моделированием. Водородные связи показаны черным пунктиром. Желтым цветом изображена ближняя гидрофобная зона, голубым – гидрофобная полость, красным – негативный выступ. (а) – HGlyPrn; (б) – CbzGlyPrn; (в) – CbzMetPrn; (г) – SucMetPrn.

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез производных 2-S-цианопирролидина (общие сведения). Все реагенты лабораторного качества и N-бензилоксикарбонил-L-пролил-L-пролиналь (CbzProPrAl) были получены от Sigma-Aldrich (США). Температуры плавления определяли на автоматическом приборе EZ-Melt (Stanford Research Systems, США) без поправки.

Протекание всех реакций отслеживали с помощью тонкослойной хроматографии, проводившейся на предварительно покрытых пластинах Merck (силикагель 60 F254, 0.25 мм) и визуализированной путем гашения флуоресценции в УФ-свете (254 нм). Оптическое вращение определяли с использованием поляриметра DIP-1000 (Jasco, Япония) при 25°С и длине волны 589 нм. Спектры ¹H-ЯМР получены на ЯМР-спектрометрах Bruker Avance II (400 МГц) и Bruker Fourier 300 (300 МГц) (Bruker, Германия). Масс-спектры получены на масс-спектрометре HP GS/MS 5890/5972 (Hewlett-Packard, США).

Все синтезированные соединения были очищены до хроматографической чистоты посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе LC20AD (Shimadzu, Япония), длина волны 214 нм, колонка Waters Symmetry C18, 3.5 мкМ, 2.1 × 150 мм, скорость потока 0.4 мл/мин. В качестве элюентов использовали 0,1%-ный раствор ТФУ в воде (А) и 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (Б) при градиенте 5–95% элюента Б за 15 мин.

Общая процедура синтеза N-защищенных карбонитрилов дипептидов. N-защищенные карбонитрилы дипептидов использовались в настоящей работе как сами по себе, так и в качеcтве предшественников для синтеза других исследуемых соединений. Общая процедура синтеза этих соединений показана на рис. 5.

 

Рис. 5. Общая процедура синтеза N-защищенных карбонитрилов дипептидов. R₁ – боковая цепь аминокислоты, R₂ – трет-бутил или бензил.

 

Суспензию 1.3 г (11 ммоль) пролина, 1.6 г (11 ммоль) K₂CO₃ и 0.1 г тетрабутиламмонийгидроксида в 10 мл диоксана перемешивали 15 мин, добавляли 10 ммоль N-оксисукцинимидного эфира N-защищенной L-аминокислоты и перемешивали в течение 10 ч. Затем реакционную смесь разбавляли водой (25 мл), перемешивали 1 ч и экстрагировали этилацетатом с эфиром (1 : 1, 15 мл), водный раствор подкисляли 1 М HCl до pH 2–3 и экстрагировали этилацетатом (сначала 50 мл, затем 20 мл). Полученные экстракты объединяли и промывали насыщенным раствором NaCl, высушивали над MgSO₄ и упаривали, получая N-защищенный аминоацилпролин.

Суспензию 10 ммоль N-защищенного аминоацилпролина, 1 г (13 ммоль) гидрокарбоната аммония, 0.3 мл пиридина и 3 мл (13 ммоль) ди-трет-бутилпирокарбоната в 10 мл ацетонитрила перемешивали в течение 16 ч, затем разбавляли водой (30 мл) и экстрагировали последовательно смесью эфира с гексаном (1 : 1, 20 мл) и этилацетатом (сначала 50 мл, затем 20 мл). Этилацетатные экстракты объединяли, промывали насыщенным раствором NaCl и высушивали над MgSO₄. Растворитель упаривали, а остаток растирали в смеси эфира с гексаном, получая амид N-защищенного аминоацилпролина в виде кристаллического порошка [13].

К охлажденному до 5°С раствору 6.5 ммоль амида N-защищенного аминоацилпролина в 10 мл пиридина добавляли порциями 1.7 мл (13 ммоль) бензолсульфохлорида. Реакционную смесь перемешивали при 15–17°С в течение 16 ч, затем растворитель упаривали в вакууме, а остаток растворяли в этилацетате. Полученный раствор последовательно промывали водой, 5%-ным раствором H₂SO₄, водой, насыщенным раствором NaCl и высушивали над MgSO₄. Растворитель упаривали, а остаток кристаллизовали из эфира, получая целевой нитрил N-защищенного аминоацилпролина в виде белого кристаллического порошка [14].

N-трет-Бутилоксикарбониламино-глицил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (BocGlyPrn). Белый порошок (2.1 г, 87%); т. пл. 62°C; [α]²⁰_D = −50° (c 1, C₂H₅OH).

N-Бензилоксикарбониламино-глицил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (CbzGlyPrn). Белый порошок (2.4 г, 83%); т. пл. 60°C; [α]²⁰_D = = −108° (c 1, C₂H₅OH); MS (ESI⁺): m/z 288.1 [M + H]⁺.

N-Бензилоксикарбониламино-L-аланил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (CbzAlaPrn). Белый порошок (2.4 г, 80%); т. пл. 59°C; [α]²⁰_D = −182° (c 1, C₂H₅OH).

N-Бензилоксикарбониламино-L-метионил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (CbzMetPrn). Белый порошок (2.8 г, 78%); т. пл. 73°C; [α]²⁰_D = = −95° (c 0,5, CH₃OH); ¹H-ЯМР (CDCl₃, 250 MГц): 7.35 (с, 5H), 5.84 (д, 1H), 5.08 (м, 2H), 4.72 (м, 1H), 4.66 (м, 1H), 3.77 (д, 2H), 2.56 (м, 2H), 2.20 (м, 2H), 2.12 (с, 3H), 2.06–1.82 (м, 2H); MS (ESI⁺): m/z 362.1 [M + H]⁺.

N-Бензилоксикарбониламино-L-триптофил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (CbzTrpPrn). Белый порошок (3.4 г, 81%); т. пл. 70°C; [α]²⁰_D = = −3.5° (c 1, DMF).

N-Бензилоксикарбониламино-L-пролил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (CbzProPrn). Белый порошок (2.7 г, 81%); т. пл. 135°C; [α]²⁰_D = = −72° (c 1, C₂H₅OH); MS (ESI⁺): m/z 328.1 [M + H]⁺.

L-Глицил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (HGlyPrn). К раствору 1.3 г (5 ммоль BocGlyPrn) в 5 мл дихлорметана приливали 5 мл трифторуксусной кислоты и выдерживали при комнатной температуре до исчезновения пятна исходного продукта на ТСХ (~1 ч). Затем раствор выдерживали в вакууме до прекращения отгонки трифторуксусной кислоты, к остатку приливали 10 мл 1 М раствора HCl в уксусной кислоте и снова упаривали досуха. Остаток кристаллизовали растиранием в эфире, полученный порошок отфильтровывали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Белый порошок (0.7 г, 79%); т. пл. 149°C; [α]²⁰_D = −139° (c 1, C₂H₅OH).

Синтез N-сукцинилированных карбонитрилов дипептидов (общая процедура). К раствору 5 ммоль N-трет-бутилоксикарбонилированного аминоацилпролина в 5 мл дихлорметана приливали 5 мл трифторуксусной кислоты и выдерживали при комнатной температуре до исчезновения пятна исходного продукта на ТСХ (~1 ч). Затем раствор выдерживали в вакууме до прекращения отгонки трифторуксусной кислоты, к остатку приливали 10 мл 1 М раствора HCl в уксусной кислоте и снова упаривали досуха. Остаток кристаллизовали растиранием в эфире, полученный порошок гидрохлорида L-аланилпролилнитрила отфильтровывали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. К раствору 0.41 г (2 ммоль) гидрохлорида L-аланилпролилнитрила в 3 мл дихлорметана приливали раствор 0.22 г (2.2 ммоль) янтарного ангидрида в 3 мл дихлорметана, добавляли 0.25 мл триэтиламина. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 3–5 ч, контролируя по ТСХ, затем последовательно промывали 5%-ным раствором лимонной кислоты, водой, насыщенным раствором NaCl, высушивали над MgSO₄ и упаривали. Получали целевой продукт в виде смолы. Смолу растирали в эфире, после чего эфир декантировали и кристаллизовали оставшуюся смолу из смеси этилацетата с гексаном.

N-Сукцинил-L-аланил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (SucAlaPrn). Белый порошок (1.1 г, 81%); т. пл. 124°C; [α]²⁰_D = −178° (c 1, C₂H₅OH); MS (ESI⁺): m/z 290.1 [M + Na]⁺.

N-Сукцинил-L-метионил-2S-пирролидин-2-карбонитрил (SucMetPrn). Белый порошок (1.1 г, 80%); т. пл. 135°C; [α]²⁰_D = −72° (c 1, C₂H₅OH).

Ингибирующая активность производных 2-S-цианопирролидина. В работе использовали препараты PEP и DPP–IV, выделенные из мозга крысы, как описано ранее [15], с модификациями. Вкратце, гомогенат мозга крысы осаждали сульфатом аммония, затем проводили ионообменную хроматографию на DEAE-Sephadex A-50, гель-хроматографию на Sephadex G75 и высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке MonoQ с использованием FPLC. По данным электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия полученные препараты ферментов представляли собой гомогенные мономеры с молекулярными массами 75 кДа (PEP) и 110 кДа (DPP4) соответственно. Очищенные ферменты концентрировали ультрафильтрацией и хранили при 80°C.

Активность ферментов измеряли по гидролизу синтетических субстратов, при котором высвобождался 7-амино-4-метилкумарин (AMC), определяемый флуорометрически: спектр флуоресценции свободного AMC отличается от такового для АMC, ацилированного пептидом. Концентрацию AMC определяли после 30 мин инкубации при 37°C по величине флуоресценции на спектрофлуорометре LS-5B (Perkin-Elmer, США) с параметрами: возбуждение при 380 нм, флуоресценция при 460 нм, щель 2.5 нм. Удельную активность пептидаз A рассчитывали по формуле:

$A=\frac{E-C}{S-B}·\frac{1}{tV}$,

где E – флуоресценция пробы (380/460 нм); C – флуоресценция смеси, содержащей по 0.05 мл субстрата и фермента, 1.9 мл Tris-HCl-буфера и 1 мл ацетатного буфера (pH 4.0); S – флуоресценция смеси, содержащей 0.05 мл субстрата, 1.93 мл Tris-Hcl-буфера, 1 мл ацетатного буфера (рН 4.0) и 0.02 мл раствора AMC концентрации 2 нМ; B – флуоресценция смеси, содержащей 0.05 мл субстрата, 1.95 мл Tris-HCl-буфера и 1 мл ацетатного буфера (pH 4.0); t – время инкубации, V – объем образца в мл.

Ферментативную реакцию останавливали добавлением в инкубационную смесь 1 мл ацетатного буфера (pH 4.0). Инкубационную смесь составляли из 0.05 мл ферментного препарата в 0.02 М Tris-HCl-буфере (pH 7.5) соответствующего типа, 0.05 мл раствора субстрата в DMSO концентрации 1 мг/мл и 1.9 мл Tris-HCl-буфера. Активность PEP измеряли по гидролизу Z-Ala-Pro-AMC. При этом использовали Tris-HCl-буфер (pH 8.0), содержащий по 1 мМ ЭДТА-Na₂, дитиотреитола и NP-40. Активность DPP4 измеряли по гидролизу Gly-Pro-AMC. При этом использовали Tris-HCl-буфер (pH 7.5). Обработку результатов выполняли в пакете GraphPad PRISM 4.0, полученные активности ингибиторов представлены в табл. 1.

Антиамнестическая активность производных 2-S-цианопирролидина. Исследования выполняли на 42 самцах беспородных белых крыс массой 180-220 г возраста 2 мес, полученных из питомника лабораторных животных филиала “Столбовая” ФГБУН НЦБМТ ФМБА. В качестве модели обучения использовали условный рефлекс пассивного избегания (CPAR). Во время обучения крысу помещали на небольшую платформу перед входом в темную камеру установки Lafayette Instrument USP (США), состоящей из двух соединенных между собой ярко освещенной и темной камер. Камеры разделяет дверца, через которую животное может свободно перемещаться из освещенной камеры в темную. В темной камере пол представляет собой металлическую сетку, по которой пропускаются импульсы электрического тока. Сразу после входа в темную камеру крыса получала болезненную стимуляцию электрическим током силой 0.5 мА через напольный электрод длительностью 10 с или до тех пор, пока крыса не выбежала из камеры. Крысу считали обученной, если она не заходила в темную камеру в течение следующих 30 с. В случае входа в темную камеру обучение повторяли. Через 24 ч проводили тест на рефлекторное воспроизведение. В этом случае крысу помещали на освещенное место и регистрировали латентное время (LT) ее входа в темную камеру. Время наблюдения составляло 3 мин. Критерием рефлекторного воспроизведения считали LT входа в темную камеру; также подсчитывали количество особей, не заходящих в темную камеру в течение 3 мин. Амнезию моделировали внутрибрюшинным введением крысам 1 мг/кг скополамина, блокатора М-холинорецепторов, за 15 мин до вызывания CPAR. Исследуемый ингибитор PEP вводили внутрибрюшинно за 30 мин до начала исследования CPAR в соответствующих дозах. В каждую экспериментальную группу животных входило от 8 до 16 крыс.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 10.0 (TIBCO Software, США). Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка с последующей оценкой однородности дисперсий по критерию Левена. В случае нормального распределения в экспериментальных группах и соблюдения однородности дисперсий между группами дальнейшую обработку проводили с использованием метода параметрической статистики t-критерия Стьюдента.

Животных содержали в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 2.2.1.3218-14 “Санитарно-эпидемиологические требования к проектированию, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник (вивариев)”. Перед декапитацией крыс анестезировали уретаном (1500 мг/кг внутрибрюшинно).

Молекулярно-динамическое моделирование. В молекулярно-динамическом моделировании использовали структуру пролилэндопептидазы человека (PEP), извлеченную из полученной методом рентгеноструктурного анализа структуры с разрешением 1.56 Å (PDB ID: 3DDU) [16], и структуру дипептидилпептидазы 4 типа человека (DPP4), извлеченную из полученной тем же методом структуры с разрешением 1.76 Å (PDB ID: 5T4B) [17], причем для моделирования каждого фермента было взято по одной субъединице, а содержащиеся в них лиганды были изъяты. В выбранных таким образом структурах ферментов устанавливали докингом структуры моделируемых соединений, применяя пакет rDock [18] с 1000 запусков оптимизационного процесса так, чтобы расположение остатка пролилнитрила относительно остатков серина, гистидина и аспарагиновой кислоты каталитической триады и в PEP, и в DPP4 было таким же, как для остатка пролина тетрапептида GFRP, образовавшего комплекс с мутантной PEP свиньи, структура которой с разрешением 2.35 Å (PDB ID: 1UOO) была получена в работе [19]. Полученные конформации были отсортированы по их сродству к мишени, оцененному программой rDock. Положения и конформации ингибиторов с наивысшими предсказанными сродствами были установлены в описанных выше структурах PEP и DPP4. В ходе моделирования остаток пролилнитрила был ковалентно связан с каталитическим остатком серина с образованием имидата [20], как и остаток пролиналя, образующего полуацеталь [21] (рис. 2).

Все расчеты молекулярной динамики и анализ полученных траекторий проводили с использованием пакета GROMACS [22, 23] версий 5.0.4 и 5.1.4. Аминокислотные остатки и производные пролилнитрила моделировали с использованием силового поля parm99sb [24]. При этом оптимизированные трехмерные структуры и молекулярные электростатические потенциалы вновь параметризуемых остатков и соединений получали квантово-химическими расчетами методом Хартри–Фока с базисом 6-31G*. Точечные заряды вычисляли в модели RESP [25].

Все моделирования выполняли при температуре 300 К с периодом привязки 0.1 пс под управлением термостата масштабирования скоростей с добавочным стохастическим членом [26] и периодических граничных условиях с изотропным постоянным давлением, поддерживаемым баростатом Берендсена [27] с периодом привязки 5 пс. Электростатические взаимодействия обрабатывали посредством сети частиц Эвальда [28] с шагом сетки 0.125 нм и четвертым порядком интерполяции. Моделируемые системы были центрированы в тетрагональных ячейках соответствующих размеров (8.4 × 7.5 × 7.5 нм для PEP и 8.4 × × 8.4 × 8.4 нм для DPP4), заполненных молекулами воды TIP4P_EW [29]. Остаточный отрицательный заряд системы был компенсирован ионами калия с оптимизированными параметрами [30], которыми случайным образом заменяли молекулы воды. Временной шаг интегрирования во всех вычислениях составлял 2 фс, координаты записывали в файл траектории каждые 25 пс. Для ограничения длин связей с атомами водорода использовали алгоритм LINCS [31]. Протяженность траектории для каждой смоделированной системы составляла 200 нс.

Анализ траекторий включал в себя анализ водородных связей и стэкинг-взаимодействий, которые выполняли так же, как в работе [32]. При выполнении анализа кадры полученных молекулярно-динамических траекторий были кластеризованы методом GROMOS [33] с отсечкой 1 нм по конформации ингибитора пептидазы и аминокислотных остатков белка, удаленных от него не более чем на 1 нм, причем атомы водорода не учитывали. Центроид наиболее населенного кластера, выделенного из множества кадров, использовали для описания конформации соответствующего ингибитора в сайте связывания и визуализации. Стабильность структур пептидаз отслеживали посредством расчета среднеквадратического отклонения (RMSD) атомов пептидного остова (N, C_α, C, O) от исходной структуры и выявления элементов вторичной структуры в каждом кадре каждой полученной траектории с помощью программы DSSP [34].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Протеолиз включен во все процессы, связанные с превращением белка с момента его синтеза и до полного гидролиза. Все без исключения структурные и функциональные белки, ферменты, гормоны пептидной природы, многочисленные по строению и функциям регуляторные пептиды находятся под контролем пептидгидролаз, что ставит в зависимость клеточный метаболизм и организм в целом от состояния протеолитических ферментов.

PEP и DPP4 – наиболее изученные пролинспецифические ферменты, участвующие в патогенезе ряда заболеваний. Они расщепляют пептидные связи, образованные карбоксильной группой остатка пролина и другой аминокислотой. Обе пептидазы способны с гораздо меньшей эффективностью гидролизовать связь после остатка аланина. Для PEP и DPP4, по сравнению с другими ферментами, известно наибольшее количество разнообразных специфических ингибиторов. Большой интерес к поиску ингибиторов этих ферментов объясняется исключительной ролью последних в регуляции метаболизма. К таким ингибиторам относятся альдегидные и нитрильные аналоги субстратов пептидаз, обладающие потенциалом для медицинского применения. Так, нитрильные аналоги субстратов PEP и DPP4 успешно используются в лечении болезни Альцгеймера и диабета.

В настоящей работе мы объяснили выявленную способность нитрильных ингибиторов PEP подавлять активность DPP4, применяя методы докинга и молекулярно-динамического моделирования. Приложение этих методов позволило нам смоделировать структуры комплексов изучаемых соединений с активными центрами PEP и DPP4 и, основываясь на сравнении полученных структур, показать, каким образом некоторые N-защищенные пептидоподобные ингибиторы PEP способны подавлять активность DPP4, хотя пептидоподобным ингибиторам аминопептидаз необходима свободная N-концевая аминогруппа. Этот феномен также может объяснять и данные по снижению активности DPP4 после введения животным ингибиторов PEP. Используемый нами подход может быть использован для прогнозирования структуры новых перспективных ингибиторов PEP и DPP4, обладающих высокой фармакологической активностью. Применение аминокислотных производных 2-S-цианопирролидина открывает перспективу создания новых эффективных препаратов, воздействующих на пептидергическое звено регуляции функциональных систем в норме и при различных патологических процессах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность Вычислительному центру МГУ им. М.В. Ломоносова за предоставленную возможность провести расчеты молекулярной динамики на суперкомпьютере “Ломоносов-II”.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Российской Федерации (Постановление № 211 от 16.03.2013 г.), соглашение № 02.A03.21.0011.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все манипуляции с экспериментальными животными проводили в соответствии с международными и российскими нормативными документами: приказом Минздрава РФ № 199н от 1 апреля 2016 г. и директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза о защите животных, используемых в научных целях.

Эксперименты одобрены Комиссией по биомедицинской этике Института фармакологии им. В.В. Закусова (протокол № 1 от 20 января 2017 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Автор ВФП синтезировал и охарактеризовал все изученные соединения. Автор ННЗ провел исследования по кинетике взаимодействия ингибиторов с ферментами и внес вклад в подготовку текста статьи. Автор ГИМ провел все вычислительные исследования и подготовил текст статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

About the authors

G. I. Makarov

South Ural State University

Author for correspondence.
Email: makarovgi@susu.ru
Russian Federation, prosp. Lenina 76, Chelyabinsk, 454080

N. N. Zolotov

Research Zakusov Institute of Pharmacology

Email: makarovgi@susu.ru
Russian Federation, ul. Baltiyskaya 8, Moscow, 125315

V. F. Pozdnev

Institute of Biomedical Chemistry

Email: makarovgi@susu.ru
Russian Federation, ul. Pogodinskaya 10/8, Moscow, 119121

References

Supplementary files