Development of a fluorescence contrasting immunostaining technique for visualizing 3D astrocytic ultramorphology

封面

如何引用文章

全文:

详细

Changes in astrocytic ultramorphology may underlie the development of neurodegenerative processes in their early stages. However, the mechanisms of its change are still poorly understood, since the size of the peripheral astrocytic processes forming the basis of the astrocytic synaptic coating are beyond the resolution of most optical microscopy (OM) methods. In turn, the disadvantage of promising methods of electron and scanning probe microscopy (EM and SPM) for such studies is the inability to determine the target area of the study due to the simultaneous use of fluorescence microscopy of immunocolored cells and the possibility of full-fledged 3D analysis of samples. In this paper, we consider the concept of solving the above problem by using an instrumental approach that combines the methods of SPM and OM together with ultramicrotomy as a method of restoring the 3D structure of the sample within a single hardware complex. To implement the proposed combined technique (optical-probe nanotomography, OPNT), the first stage of creating specialized fluorescent-contrasting labels based on conjugates of fluorescent semiconductor nanocrystals and single-domain antibodies has been developed in this work. This type of label will provide both immuno-staining of the “area of interest" for the restoration of 3D astrocytic ultramorphology, and contrast of astrocytes by the SPM method.

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Приоритетное направление современной нейробиологии – изучение клеточных механизмов нейродегенеративных процессов и, в частности, поиск способов выявления и предотвращения нейродегенерации на ранних стадиях развития заболеваний. При этом считается, что важную роль в нейродегенеративных процессах играет глия [1, 2], и развитие патологий мозга при старении и нейродегенеративных заболеваниях (эпилепсии, болезни Альцгеймера) начинается с изменений в астроцитах [3–5]. Известно, что астронейрональные взаимодействия лежат в основе работы головного мозга [1, 6, 7], и в норме астроциты обеспечивают нейропротекцию и метаболическую поддержку нейронов, регулируют активность нейронов и локальный кровоток [8], участвуют в регуляции синаптической передачи [1, 7, 9] и механизмах синаптической пластичности. Нарушение астронейрональных взаимодействий сопровождается снижением когнитивных функций, потерей памяти, психическими расстройствами [1]. В свою очередь, астроциты потенциально могут быть использованы в качестве мишеней для терапии, предотвращающей негативные изменения до начала развития необратимых нейродегенеративных процессов.

В соответствии с моделью трехчастного синапса в организацию синаптических связей между нейронами вовлекаются отростки астроцитарных клеток [6, 10]. Терминальные отростки астроцитов преимущественно располагаются в непосредственной близости от постсинаптического отдела, охватывая по периметру синаптическую щель [11]. Астроциты эффективно модулируют синаптическую передачу, контролируя ионный гомеостаз. В частности, тонкие астроцитарные отростки несут на мембране многочисленные транспортеры глутамата (GLT-1 и GLAST/GLT-1) [12], осуществляют удаление из синаптической щели глутамата и снабжение нейрональных терминалей глутамином [2, 9, 13–15]. Участие астроцитов в регуляторных процессах включает изменение их ультраморфологии. Астроцитарные отростки динамически реагируют на изменения в окружающей среде и за счет актинового цитоскелета способны к быстрой пространственной реорганизации [16], в частности терминальные отростки могут вытягиваться при высокой синаптической активности, обусловливая повышение эффективности захвата глутамата. Возможны и еще более тонкие ультраструктурные изменения – перемещение транспортеров GLT-1 по мембране отростка в сторону большей концентрации глутамата [17, 18].

Изменение астроцитарной ультраморфологии может лежать в основе развития нейродегенеративных процессов на их ранних стадиях. Так, на примере гиппокампа продемонстрирована связь снижения синаптической пластичности при старении с дистрофией астроцитов, в том числе с истощением фракции мелких астроцитарных отростков. Продемонстрированное ранее снижение эффективности захвата глутамата астроцитами при болезни Альцгеймера [4, 5] также с большой долей вероятности может быть обусловлено тонкими изменениями в компартменте терминальных астроцитарных отростков, в частности ингибированием экспрессии GLT-1 вблизи депозитов β-амилоида.

Таким образом, для понимания регуляторных и дисфункциональных астронейрональных процессов огромное значение имеет изучение клеточных и молекулярных механизмов изменений в терминальных отростках астроцитов на ультраструктурном уровне на ранних стадиях развития нейродегенеративных заболеваний. Однако эти механизмы до настоящего времени недостаточно хорошо изучены, что во многом связано с тем, что размеры периферических астроцитарных отростков, формирующих основу астроцитарного синаптического покрытия (стандартная толщина ~100 нм) [16, 19], лежат за пределами разрешающей способности большинства методов оптической микроскопии. В частности, они не могут быть визуализированы с помощью широко распространенной конфокальной или двухфотонной микроскопии. Ультраструктура клеточных компонентов с разрешением от десятков до единиц нанометров может быть исследована методами микроскопии высокого разрешения (электронная (ЭМ) и сканирующая зондовая (СЗМ) микроскопия), однако у этих методик есть существенный недостаток – отсутствие возможности определения целевого участка исследования за счет одновременного использования флуоресцентной микроскопии иммуноокрашенных клеток и возможности полноценного 3D-анализа образцов. Необходимость точного выбора участка “зоны интереса” с использованием иммунного окрашивания очевидна, поскольку это в значительной степени оптимизирует экспериментальную процедуру как с точки зрения значительного сокращения времени измерений, так и существенного повышения их информативности. При этом информация о 3D-структуре периферических астроцитарных отростков не менее важна. Так, одним из ключевых параметров, определяющих физиологические свойства астроцитарных отростков (например, интенсивность обменных процессов и характер ионной динамики), является показатель отношения площади поверхности структуры к ее объему (surface-to-volume ratio, SVR) [19], который невозможно определить без 3D ультраструктурной реконструкции. Для решения указанной проблемы с успехом могут быть использованы современные методы корреляционной микроскопии [20–22], объединяющие в рамках единого аппаратного комплекса методы микроскопии высокого разрешения (ЭМ и СЗМ), оптическую микроскопию (ОМ) и методики восстановления 3D-структуры, такие как, например, ультрамикротомия (УМТ).

Однако использование данных методик для исследования астроцитарной ультраморфологии требует соответствующей адаптации методик иммунофлуоресцентного мечения астроцитов с целью как минимизации общего размера меток, так и их комбинированного использования для флуоресцентного окрашивания в режимах ОМ и контрастирования в режимах ЭМ и СЗМ. В данной работе мы предлагаем методику иммунофлуоресцентного мечения астроцитов с использованием однодоменных антител (наноантител), конъюгированных со стандартным флуоресцентным красителем, с целью использования для комбинированного исследования ультраморфологии методами электронной, оптической, сканирующей зондовой микроскопии и оптико-зондовой нанотомографии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Концепция использования конъюгатов наноантител и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов для визуализации астроцитарных структур методом оптико-зондовой нанотомографии (ОЗНТ). ОЗНТ предлагается в качестве коррелятивной методики, позволяющей в ходе одной экспериментальной процедуры получать данные о расположении “зоны интереса” методом широкопольной флуоресцентной ОМ и объемную ультраструктуру астроцитов методом СЗМ, комбинированным с УМТ. Данная методика основана на проведении последовательных УМТ-срезов заключенного в эпоксидные смолы образца и одновременном получении совмещенных данных ОМ/СЗМ от каждого среза. Далее последовательность данных 2D-ОМ/СЗМ соответствующими программными средствами восстанавливается в массив 3D-ОМ/СЗМ. Данный подход обеспечивает полноценное решение ранее указанной задачи восстановления 3D астроцитарной ультраморфологии в иммуноокрашенной “зоне интереса”. Важно отметить, что использование в качестве меток флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов дает дополнительную возможность контрастирования астроцитарных сетей на фоне остального объема образца. В действительности особенностью СЗМ является то, что данный метод “видит” все содержимое образца, а не то, что помечено специальными контрастирующими агентами, как это происходит в случае ЭМ. Предлагаемая концепция визуализации объемной ультраструктуры астроцитов отображена на рис. 1 и заключается в следующем:

  • проводится иммуномечение соответствующих участков астроцитарных сетей с использованием конъюгатов антител к определенному белку, содержащемуся в астроцитах, и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов;
  • исследуемые образцы фиксируются и иммобилизуются в эпоксидных смолах;
  • в определяемых с помощью флуоресцентной ОМ по излучению нанокристаллов “зонах интереса” проводится восстановление данных 3D-СЗМ;
  • c использованием высокого контраста нанокристаллов в режиме СЗМ проводится восстановление непосредственной ультраструктуры астроцитов в “зоне интереса”.

 

Рис. 1. Концепция использования флуоресцентно-контрастирующих меток на основе конъюгатов наноантител (НТ) и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов (НК) для визуализации объемной ультраструктуры астроцитов методом ОЗНТ.

 

Важно отметить, что использование антител для иммунофлуоресцентного мечения – это общепринятый подход. Однако большинство доступных в настоящее время коммерческих антител, предназначенных для иммуноцитохимического окрашивания, представляют собой крупные молекулы иммуноглобулинов. Кроме того, значительная часть доступных коммерческих антител предназначена для метода непрямого иммуноцитохимического окрашивания, когда с белком интереса связываются первичные антитела, не несущие на себе флуоресцентной метки, после чего с первичными антителами связываются вторичные антитела, несущие флуорофор; на одно первичное антитело прикрепляется, как правило, несколько вторичных. Таким образом очевидно, что в целом размеры таких меток чрезвычайно большие для ультраструктурных исследований, поэтому в данном подходе предпочтительным видится использование так называемых однодоменных антител (наноантител) – антител, представляющих собой мономерный антигенсвязывающий вариабельный домен, например, VHH-E9 верблюжьих антител [23, 24]. За счет своего небольшого размера наноантитела глубже проникают в объемные образцы, чем обычные антитела [24], что должно способствовать более глубокому окрашиванию 400-мкм блока, предназначенного для дальнейшего изготовления срезов вибротома, что дает преимущество при нацеливании на менее доступные эпитопы, а также способствует более мягкому окрашиванию, сохраняющему ультраструктуру [25, 26]. Кроме того, локализация одиночной молекулы с помощью методов ЭМ и СЗМ требует специфической доставки меток в непосредственной близости от целевого белка. Вследствие большого размера иммуноглобулинов их применение для визуализации может привести к получению ошибочного результата при используемой разрешающей способности, что происходит из-за существенного расстояния между меткой и белком-мишенью. Однако предлагаемые конъюгаты наноантител обеспечат минимальную ошибку благодаря их небольшому размеру [24]. Кроме того, на данный момент в мире существуют наработки, связанные с получением высокоориентированных конъюгатов наноантител с флуоресцентными полупроводниковыми нанокристаллами [27], что дает основания считать дальнейшую разработку указанного выше подхода весьма перспективной. Однако сама по себе методика иммуноокрашивания наноантителами астроцитов до настоящего времени не разработана. На решение этой задачи и была направлена данная работа.

Разработка методики иммуноокрашивания астроцитов конъюгатами наноантител и флуоресцентных красителей. Как было показано выше, астроцитарная морфология на ультраструктурном уровне может быстро изменяться при перемене условий [16], таким образом, для получения объективной ультраморфологической картины в течение всей пробоподготовки вплоть до момента фиксации необходимо поддерживать состояние среды, максимально приближенное к нативному. Это требование и было положено в основу модификации протокола иммуноокрашивания астроцитов конъюгатами наноантител и флуоресцентных красителей.

На первом этапе при подготовке срезов гиппокампа материал в течение всего процесса резки находился в растворе, соответствующем по составу спинномозговой жидкости, а также в течение всего процесса нарезки производили карбогенизацию раствора. Поскольку при нарезке клеточные структуры подвергаются стрессу, перед фиксацией срезы инкубировали в растворе, аналогичном используемому при резке, но характеризующемся повышенным содержанием глюкозы, способствующей восстановлению ткани после стресса.

Для иммуноцитохимического окрашивания в данной работе использовали специфичные к GFAP коммерческие кроличьи поликлональные антитела (ab7260; Abcam, США) и наноантитела VHH-E9, специфичные к GFAP, конъюгированные с флуорофором малеинид-FAM, специально произведенные на базе ИБХ РАН.

Эффективность иммуноокрашивания астроцитов конъюгатами наноантител и флуоресцентных красителей методом флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные изображения срезов мозговой ткани, окрашенных конъюгатами коммерческих антител и наноантителами, приведены на рис. 2а и 2б соответственно). Оба способа окрашивания продемонстрировали тканевую архитектуру гиппокампа и морфологию астроцитарных клеток, соответствующие нормальным. Анализ полученных изображений с использованием программного обеспечения Fiji (Fiji/ImageJ2 – общедоступное программное обеспечение для обработки и анализа изображений, www.fiji.sc) показал, что плотность выявляемых при иммуноокрашивании астроцитов в зоне stratum radiatum составляет 49 ± 4 и 52 ± 3 на 250 000 мкм2 при использовании коммерческих антител и наноантител соответственно (рис. 2в). Сравнение выявляемой при различных окрашиваниях морфологии астроцитов посредством анализа Шолля (определение числа астроцитарных отростков, детектируемых по мере удаления от астроцитарной сомы) показало совпадение в пределах статистической ошибки Шолль-профилей, полученных с изображений с разным окрашиванием (рис. 2г). Таким образом, можно сделать вывод о равной на макроуровне эффективности иммуноокрашивания, достигаемого при помощи коммерческих антител-иммуноглобулинов и наноантител.

 

Рис. 2. Визуализация астроцитов гиппокампа мыши C57Bl6 (зона stratum radiatyum). (а) – Иммуноцитохимическое окрашивание с использованием антител IgG-GFAP; (б) – иммуноцитохимическое окрашивание с использованием наноантител E9-GFAP; (в) – плотность астроцитов в зоне stratum radiatum (число астроцитов на 250 000 мкм2) при окрашивании IgG-GFAP и E9-GFAP; (г) – профиль 2D-анализа Шолля (количество пересечений астроцитарных отростков с концентрическими сферами с центром в середине клеточной сомы) одиночных астроцитов при окрашивании IgG-GFAP и E9-GFAP.

 

Полученные результаты демонстрируют эффективность разработанной методики пробоподготовки в целом и иммуноокрашивания с использованием изготовленных наноантител VHH-E9 в частности, что открывает перспективы разработки аналогичной методики, но уже с использованием флуоресцентно-контрастирующих агентов на основе флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов. Нанокристаллы типа “ядро/оболочка” (например, CdSe/ZnS) обладают узким симметричным пиком флуоресценции (в отличие от органических красителей), высокой яркостью флуоресценции и уникально высокой фотостабильностью [28]. Кроме того, их высокая твердость и непрозрачность для электронных пучков делает их крайне привлекательными для использования в качестве контрастирующих агентов для СЗМ и ЭМ. Важно отметить, что создание методики иммуноокрашивания/контрастирования с использованием конъюгатов изготовленных наноантител VHH-E9 и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов – важнейшая задача работ по внедрению методики ОЗНТ в область исследования 3D астроцитарной ультраморфологии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Животные. В работе использовали трех самцов мышей линии C57BL/6 в возрасте 6 месяцев весом 29 ± 0.5 г, предоставленных НПП “Питомник лабораторных животных” ФИБХ РАН (Пущино, Россия). Для получения биоматериала мышей умерщвляли путем декапитации, предварительно проводили анестезию изофлураном (1-хлор-2,2,2-трифторэтилдифторметиловый эфир), выполняли декапитацию, извлекали гиппокамп, который впоследствии закрепляли в специальном агаровом блоке для соблюдения необходимой ориентации, позволяющей минимально повредить функциональные связи и максимально сохранить структуру клеток.

Изготовление срезов гиппокампа. После извлечения гиппокампы переносили в раствор, соответствующий по составу спинномозговой жидкости, содержащий (в мМ) 92 N-метил-D-глюкамина (NMDG), 2.5 KCl, 1.25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 глюкозы, 2 тиомочевины, 5 Na-аскорбата, 3 Na-пирувата, 0.5 CaCl2 · 2H2O и 10 MgSO4 · 7H2O. Срезы толщиной 350 мкм изготавливали с помощью вибрационного микротома (Microm HM650 V; Thermo Fisher Scientific, США). Для восстановления ионного равновесия срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем (в мМ) 127 NaCl, 2.5 КСl, 1.25 NaH2PO4, 2 MgCl2, 1 СаСl2, 25 NaHCO3 и 25 D-глюкозы. Все растворы имели осмолярность 295 ± 5 мОсм, pH 7.4 и были насыщены карбогеном (95% O2 и 5% CO2).

Иммуноцитохимическое окрашивание. Общая методика окрашивания при применении коммерческих или наноантител VHH-E9 состоит из следующих этапов. Для проведения иммуноцитохимического окрашивания срезы гиппокампа фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в течение 60 мин при 37°С, затем дважды промывали фосфатным буферным раствором (PBS, pH 7.4). Фиксированные срезы инкубировали в блок-растворе (PBS с 0.3% Triton-X100, 0.1% Tween 20 и 5%-ным раствором BSA) при комнатной температуре в течение 90 мин для пермеабилизации. После пермеабилизации срезы инкубировали в растворе первичных антител в PBS с 0.01% Tween 20 в течение 60 ч при 25°С, трижды промывали PBS (3 смены по 10 мин) и в случае коммерческих первичных антител инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч при 25°С в темноте.

Для окрашивания использовали наноантитела VHH-E9 (специфичные к глиальному фибриллярному кислому белку GFAP, конъюгированные с флуорофором малеинид-FAM, произведенные на базе ИБХ РАН) или первичные кроличьи моноклональные антитела против глиального фибриллярного кислого белка GFAP (ABIN3043832) + вторичные антимышиные поликлональные антитела Alexa Fluor® 594 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (кат. № AB_2338871; Jackson ImmunoResearch, США).

Наноантитела VHH-E9, специфичные к GFAP, конъюгированные с флуорофором малеинид-FAM, произведены на базе ИБХ РАН. Для этого нуклеотидная последовательность, кодирующая наноантитело VHH-E9 к GFAP с добавленной на 3'-конце последовательностью, кодирующей 6 гистидинов и цистеин, была синтезирована (ДНК-синтез, Россия) и клонирована в экспрессионную плазмиду pET22 по сайтам рестрикции XbaI и BamHI. Для получения штамма-продуцента pET22-VHHE9 были трансформированы клетки Escherichia coli штамма Rosetta-gami (DE3) (Novagen, США). Наработку белка проводили при помощи автоиндукции в питательной среде LB без NaCl c добавлением 25 мМ (NH4)2SO4, 50 мМ KH2PO4, 50 мМ Na2HPO4, 1 мМ MgSO4, 0.5% глицерина, 0.05% глюкозы и 0.2% лактозы. Наноантитела очищали из осветленных клеточных лизатов при помощи металл-хелатной хроматографии на колонках HisTrap FF (Cytiva, США) с последующей гель-фильтрацией на колонке 16/60 HiPrep Sephacryl S200 HR (Cytiva, США). Для флуоресцентного мечения наноантитела использовали малеимид-FAM (Lumiprobe, Россия). К раствору VHH-E9 (1 мг/мл) в PBS добавляли 10 мM раствор флуоресцентной метки в DMSO в 20-кратном молярном избытке и оставляли в атмосфере аргона при 3°С на 18 ч. Для удаления непрореагировавшего красителя образец очищали на колонке PD-10 (Cytiva, США).

Наноантитела VHH-E9 непосредственно конъюгированы с флуорофором, коммерческие антитела ab7260 (Abcam, США) предназначены для непрямого иммуноцитохимического окрашивания, в качестве вторичных антител использовали коммерческие ослиные антикроличьи поликлональные антитела Alexa Fluor® 488 (AB_2313584; Jackson ImmunoResearch, США). Оптимальное разведение наноантител VHH-E9 (1 : 100) было определено на серии образцов посредством титрования, для коммерческих антител использовали разведение, рекомендуемое для иммуноцитохимического исследования в описании продукта.

Для визуализации использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп Axiovert 200M (Carl Zeiss Inc., Германия), объективы PlanApo 20× и 40×, цифровую камеру AxioСаmHR.

2D-Анализ Шолля. Анализ морфологии астроцитов, визуализированных при различных способах окрашивания, осуществляли посредством теста Шолля с использованием программного обеспечения FiJi (Fiji/ImageJ2, www.fiji.sc) [29–31]. Тест предполагает построение концентрических окружностей с увеличивающимся радиусом (5– 50 мкм с шагом 1 мкм) из центра сомы астроцита с регистрацией числа пересечения окружностей каждого радиуса с астроцитарными отростками для каждой клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Развитие комбинированных методик, объединяющих в себе методы высокоразрешающей микроскопии типа ЭМ и СЗМ, оптической микроcпектроскопии и методик восстановления 3D-ультраструктуры образца необходимо для изучения клеточных и молекулярных механизмов изменений в терминальных отростках астроцитов на ультраструктурном уровне на ранних стадиях развития нейродегенеративных заболеваний. Такого рода исследования требуются для понимания регуляторных и дисфункциональных астронейрональных процессов, лежащих в основе развития нейродегенеративных заболеваний.

В качестве перспективной методики такого рода в данной работе предложена концепция применения методики ОЗНТ, позволяющей в ходе одной экспериментальной процедуры получать данные о расположении “зоны интереса” методом широкопольной флуоресцентной ОМ и объемную ультраструктуру астроцитов методом СЗМ, комбинированным с УМТ. Данная методика основана на проведении последовательных УМТ-срезов заключенного в эпоксидные смолы образца и одновременном получении совмещенных данных ОМ/СЗМ от каждого среза. Далее последовательность данных 2D-ОМ/СЗМ соответствующими программными средствами восстанавливается в массив 3D-ОМ/СЗМ. Данный подход обеспечивает полноценное решение ранее указанной задачи – восстановление 3D астроцитарной ультраморфологии в иммуноокрашенной “зоне интереса”.

Один из необходимых шагов по внедрению методики ОЗНТ в область исследования 3D астроцитарной ультраморфологии – создание специализированных флуоресцентно-контрастирующих меток на основе конъюгатов флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов и однодоменных антител. Главное достоинство таких систем – узкий симметричный пик, высокая яркость и фотостабильность флуоресценции полупроводниковых нанокристаллов, что важно для иммуноокрашивания “зоны интереса”, а также их высокая твердость и непрозрачность для электронных пучков, что делает их крайне привлекательными для использования в качестве контрастирующих агентов как для СЗМ, так и для ЭМ.

Предлагаемая концепция визуализации объемной ультраструктуры астроцитов заключается в следующем:

  • проводится иммуномечение соответствующих участков астроцитарных сетей с использованием конъюгатов антител к определенному белку, содержащемуся в астроцитах, и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов;
  • исследуемые образцы фиксируются и иммобилизуются в эпоксидных смолах;
  • в определяемых с помощью флуоресцентной ОМ по излучению нанокристаллов “зонах интереса” проводится восстановление данных 3D-СЗМ;
  • с использованием высокого контраста нанокристаллов в режиме СЗМ проводится восстановление непосредственной ультраструктуры астроцитов в “зоне интереса”.

Важно отметить, что для создания подобных меток необходимо использование конъюгатов нанокристаллов и наноантител (однодоменных антител), которые за счет своего небольшого размера значительно глубже проникают в объемные образцы, чем обычные антитела, что должно способствовать более глубокому и мягкому, сохраняющему ультраструктуру, окрашиванию образца.

В рамках данного исследования была разработана предварительная методика иммуноокрашивания астроцитов конъюгатами верблюжьих наноантител VHH-E9, специфичных к глиальному фибриллярному кислому белку GFAP, и красителя малеимид-FAM. Полученные результаты демонстрируют эффективность разработанной методики пробоподготовки в целом и иммуноокрашивания с использованием изготовленных VHH-E9 наноантител в частности, что открывает перспективы разработки аналогичной методики, но уже с использованием флуоресцентно-контрастирующих агентов на основе флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов.

Полученные в работе результаты станут первым шагом в разработке методики адресного мечения астроцитов универсальными флуоресцентно-контрастирующими метками на основе конъюгатов наноантител и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов для анализа их наноструктуры при помощи коррелятивной технологии оптико-зондовой нанотомографии (ОЗНТ) с использованием уникальной научной установки (http://ckp-rf.ru/usu/486825/), объединяющей в себе возможности 3D-СЗМ и ОМ [32–34].

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-14-00168 (https://rscf.ru/project/22-14-00168/).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры проводили в соответствии с этическими регламентами Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Исследования одобрены институтской комиссией по содержанию и использованию лабораторных животных (протокол № 337/2021).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

作者简介

К. Mochalov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

О. Sutyagina

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; ul. Vavilova 26, Moscow, 119334

А. Altunina

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; Institutskiy per. 9, Dolgoprudny, 141701

D. Solovieva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

А. Efimov

V.I. Shumakov Federal Research Center of Transplantology and Artificial Organs

Email: voleinik@mail.ru

Laboratory of Bionanotechology

俄罗斯联邦, ul. Shchukinskaya 1, Moscow, 123182

V. Zhuchkov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

S. Chumakov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry

Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

V. Oleinikov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry; National Research Nuclear University “MEPhI” (Moscow Engineering Physics Institute)

编辑信件的主要联系方式.
Email: voleinik@mail.ru
俄罗斯联邦, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997; Kashirskoe shosse 31, Moscow, 115409

参考

  1. Verkhratsky A., Rodríguez J.J., Parpura V. // Cell Tissue Res. 2014. V. 2. P. 493–503. https://doi.org/10.1007/s00441-014-1814-z
  2. Verkhratsky A., Zorec R., Rodríguez J.J., Parpura V. // Curr. Opin. Pharmacol. 2016. V. 26. P. 74–79. https://doi.org/10.1016/j.coph.2015.09.011
  3. Popov A., Brazhe A., Denisov P., Sutyagina O., Li L., Lazareva N., Verkhratsky A., Semyanov A. // Aging Cell. 2021. V. 20. P. e13334. https://doi.org/10.1111/acel.13334
  4. Kelly P., Hudry E., Hou S.S., Bacskai B.J. // Front. Aging Neurosci. 2018. V. 10. P. 1–8. https://doi.org/10.3389/fnagi.2018.0021
  5. Hefendehl J.K., LeDue J., Ko R.W., Mahler J., Murphy T.H., MacVicar B.A. // Nat. Commun. 2016. V. 7. P. 13441. https://doi.org/10.1038/ncomms13441
  6. Allen N.J., Barres B.A. // Nature. 2009. V. 7230. P. 675–677. https://doi.org/10.1038/457675a
  7. Verkhratsky A., Nedergaard M. // Physiol. Rev. 2018. V. 1. P. 239–389. https://doi.org/10.1152/physrev.00042.2016
  8. Takano T., Tian G.-F., Peng W., Lou N., Libionka W., Han X., Nedergaard M. // Nat. Neurosci. 2006. V. 9. P. 260–267. https://doi.org/10.1038/nn1623
  9. Garwood C.J., Ratcliffe L.E., Simpson J.E., Heath P.R., Ince P.G., Wharton S.B. // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2017. V. 4. P. 281–298. https://doi.org/10.1111/nan.12338
  10. Araque A., Parpura V., Sanzgiri R.P., Haydon P.G. // Trends. Neurosci. 1999. V. 5. P. 208–215. https://doi.org/10.1016/s0166-2236(98)01349-6
  11. Papouin T., Dunphy J., Tolman M., Foley J.C., Haydon P.G. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. V. 1715. P. 20160154. https://doi.org/10.1098/rstb.2016.0154
  12. Rimmele T.S., Rosenberg P.A. // Neurochem. Int. 2016. V. 98. P. 19–28. https://doi.org/10.1016/j.neuint.2016.04.010
  13. Verkhratsky A., Zorec R., Rodriguez J.J., Parpura V. // Opera Med. Physiol. 2016. V. 1. P. 13–22.
  14. Dossi E., Vasile F., Rouach N. // Brain Res. Bull. 2018. V. 136. P. 139–156. https://doi.org/10.1016/j.brainresbull.2017.02.001
  15. Heller J.P., Rusakov D.A. // Glia. 2015. V. 63. P. 2133–2151. https://doi.org/10.1002/glia.22821
  16. Hennebelle M., Champeil-Potokar G., Lavialle M., Vancassel S., Denis I. // Nutr. Rev. 2014. V. 72. P. 99–112. https://doi.org/10.1111/nure.12088
  17. Perez-Alvarez A., Navarrete M., Covelo A., Martin E.D., Araque A. // J. Neurosci. 2014. V. 34. P. 12738–12744. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2401-14.2014
  18. Murphy-Royal C., Dupuis J.P., Varela J.A., Panatier A., Pinson B., Baufreton J., Groc L., Oliet S.H. // Nat. Neurosci. 2015. V. 2. P. 219–226. https://doi.org/10.1038/nn.3901
  19. Patrushev I., Gavrilov N., Turlapov V., Semyanov A. // Cell Calcium. 2013. V. 54. P. 343–349. https://doi.org/10.1016/j.ceca.2013.08.003
  20. Caplan J., Niethammer M., Taylor R.M., Czymmek K.J. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2011. V. 21. P. 686–693. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2011.06.010
  21. Spiegelhalter C., Tosch V., Hentsch D., Koch M., Kessler P., Schwab Y., Laporte J. // PLoS One. 2010. V. 5. P. e9014. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009014
  22. Miranda A., Gómez-Varela A.I., Stylianou A., Hirvonen L.M., Sánchez H., De Beule P.A.A. // Nanoscale. 2021. V. 13. P. 2082–2099. https://doi.org/10.1039/d0nr07203f
  23. Rothbauer U., Zolghadr K., Tillib S., Nowak D., Schermelleh L., Gahl A., Backmann N., Conrath K., Muyldermans S., Cardoso M.C., Leonhardt H. // Nat. Methods. 2006. V. 3. P. 887–889. https://doi.org/10.1038/nmeth953
  24. Perruchini C., Pecorari F., Bourgeois J.P., Duyckaerts C., Rougeon F., Lafaye P. // Acta Neuropathol. 2009. V. 118. P. 685–695. https://doi.org/10.1007/s00401-009-0572-6
  25. Muyldermans S. // Annu. Rev. Biochem. 2013. V. 82. P. 775–797. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-063011-092449
  26. Fang T., Lu X., Berger D., Gmeiner C., Cho J., Schalek R., Ploegh H., Lichtman J. // Nat. Methods. 2018. V. 15. P. 1029–1032. https://doi.org/10.1038/s41592-018-0177-x
  27. Wu M., Petryayeva E., Medintz I.L., Algar W.R. // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1199. P. 215–239. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1280-3_17
  28. Sukhanova A., Venteo L., Devy J., Artemyev M., Oleinikov V., Pluot M., Nabiev I. // Lab. Inves. 2002. V. 82. P. 1259–1261. https://doi.org/10.1097/01.lab.0000027837.13582.e8
  29. Milosivic N.T., Ristanovic D. // J. Theor. Biol. 2007. V. 245. P. 130–140.
  30. Wu C.C., Reilly J.F., Young W.G., Morrison J.H., Bloom F.E. // Cereb. Cortex. 2004. V. 14. P. 543–554. https://doi.org/10.1093/cercor/bhh016
  31. Ferreira T.A., Blackman A.V., Oyrer J., Jayabal S., Chung A.J., Watt A.J., Sjöström P.J., van Meyel D.J. // Nat. Methods. 2004. V. 11. P. 982–984. https://doi.org/10.1038/nmeth.3125
  32. Efimov A.E., Agapov I.I., Agapova O.I., Oleinikov V.A., Mezin A.V., Molinari M., Nabiev I., Mochalov K.E. // Rev. Sci. Instrum. 2017. V. 88. P. 023701. https://doi.org/10.1063/1.4975202
  33. Mochalov K.E., Chistyakov A.A., Solovyeva D.O., Mezin A.V., Oleinikov V.A., Vaskan I.S., Molinari M., Agapov I.I., Nabiev I., Efimov F.E. // Ultramicroscopy. 2017. V. 182. P. 118–123. https://doi.org/10.1016/j.ultramic.2017.06.022
  34. Efimov A.E., Bobrovsky A.Y., Agapov I.I., Agapova O.I., Oleinikov V.A., Nabiev I.R., Mochalov K.E. // Tech. Phys. Lett. 2016. V. 42. P. 171–174. https://doi.org/10.1134/S1063785016020231

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. The concept of using fluorescent-contrasting labels based on conjugates of nanoantibodies (NT) and fluorescent semiconductor nanocrystals (NC) for visualization of the volumetric ultrastructure of astrocytes using the OZNT method.

下载 (57KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Visualization of astrocytes in the hippocampus of C57Bl6 mice (stratum radiatyum zone). (a) Immunocytochemical staining using IgG-GFAP antibodies; (b) immunocytochemical staining using E9-GFAP nanoantibodies; (c) astrocyte density in the stratum radiatum zone (number of astrocytes per 250,000 μm2) with IgG-GFAP and E9-GFAP staining; (d) 2D Sholl analysis profile (number of intersections of astrocytic processes with concentric spheres centered in the middle of the cell soma) of single astrocytes with IgG-GFAP and E9-GFAP staining.

下载 (147KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».