Synthetic Antimicrobial Peptides. V. Histidine-containing Antifungal Peptides with a “Linear” Type of Amphipathicity

Full Text

Сокращения: АМП – антимикробные пептиды; ГА – гемолитическая активность; КТА – “круговой” тип амфипатичности; ЛТА – “линейный” тип амфипатичности; МГК – минимальная гемолитическая концентрация (концентрация пептида, которая вызывает лизис не более 4% свежих красных кровяных клеток); МПК₅₀ – минимальная подавляющая концентрация (концентрация пептида, при которой рост микроорганизмов подавляется на 50%); АГА – антигрибковая активность; САМП – синтетические антимикробные пептиды; ТИ – терапевтический индекс; ХГ – хлоргексидин; Fmoc – 9-флуоренилметоксикарбонил; HATU – 2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат; Hst – гистатин; PBS – фосфатно-солевой буфер; TFA – трифторуксусная кислота.

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия отмечается рост заболеваемости пациентов внутрибольничными грибковыми инфекциями. Дрожжеподобные грибки рода Candida – одни из наиболее распространенных возбудителей нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций кровотока [1, 2]. Длительное применение в терапии микозов различных антигрибковых средств привело к серьезной угрозе возникновения и распространения патогенных штаммов грибов, обладающих лекарственной устойчивостью к традиционно используемым препаратам [3, 4]. Поэтому важное практическое значение имеет поиск новых лекарственных средств, применение которых не приводило бы к возникновению устойчивости к ним.

Перспективными в этом плане могут оказаться выявленные в природе антимикробные пептиды (АМП), синтезирующиеся в ответ на контакт с чужеродными микроорганизмами или их внедрение [5–8]. АМП – это в основном амфифильные катионные пептиды, которые воздействуют на отрицательно заряженную мембрану микробных клеток. В результате такого воздействия развитие устойчивости патогенов к АМП в значительной степени затруднено, поскольку требует внесения серьезных изменений в структуру и электрофизиологические свойства их клеточной мембраны [5, 8–11]. Большинство известных природных АМП обладают не только высокой антимикробной активностью, но и повышенной гемолитической токсичностью. Причина такой токсичности пептидов – их относительно высокая гидрофобность, обусловленная повышенным содержанием (> 30%, а в ряде случаев и до 50%) гидрофобных аминокислотных остатков в общей аминокислотной цепи природного пептида [12, 13]. В связи с этим продолжаются поиски новых эффективных АМП, обладающих высокой антимикробной активностью и низкой гемолитической токсичностью. Перспективными в этом плане могут оказаться синтетические антимикробные пептиды (САМП), сконструированные и синтезированные de novo, не опирающиеся на структуру природных АМП, т.е. сконструированные независимо от структуры многочисленных известных природных АМП [13–21].

Ранее с использованием такого подхода нами были сконструированы САМП, c классическим широко известным и хорошо исследованным в литературе “круговым” (спиральным или кольцевым) типом амфипатичности (КТА) [22–24] (рис. 1а) и пептиды с малоизвестным “линейным” типом амфипатичности (ЛТА) [25, 26]. Было выявлено, что САМП с малоизвестным “линейным” типом амфипатичности (ЛТА) (R9F2, K9F2 и H9F2) по сравнению с аналогичными САМП с часто встречающимся в природе классическим “круговым” типом амфипатичности (КТА) (R5F5 (RFRRFFRRFF), K5F5 (KFKKFFKKFF) и H5F5 (HFHHFFHHFF)) проявляют не только пониженную гемолитическую токсичность, но и, в то же время, повышенную антигрибковую активность [26].

 

Рис. 1. Гипотетическое представление классического “кругового” (а) и “линейного” (б) типов амфипатичности α-спиральных пептидов. Прямоугольниками обозначены гидрофильные или катионные остатки аминокислот, треугольниками – гидрофобные остатки. В случае классического “кругового” типа амфипатичности (КТА) [6, 22, 23] гидрофобные и гидрофильные полярные поверхности α-спиральной молекулы пептида разделены продольной осевой линией (а). На рисунке верхняя поверхность гидрофильная, нижняя – гидрофобная (амфипатичность по типу “спинка–животик”). В случае линейного типа амфипатичности (ЛТА) гидрофобные и гидрофильные (катионные) остатки аминокислот разнесены на противоположных концах вдоль линейной оси пептида. Гидрофобная и гидрофильная полярные области в этом случае разделены поперечной линией, перпендикулярной продольной оси пептида (б), где один (левый) конец молекулы имеет гидрофильный “хвостик”, а противоположный (правый) – гидрофобную “головку”. Справа представлены двумерные проекции “спиральных колес” Шиффер и Эдмундсона [20, 24] этих же пептидов. Видно, что полярная однородность гидрофобных и гидрофильных групп в случае “линейного” типа амфипатичности (б) в проекции, представленной слева, гораздо выше, чем когда та же молекула представлена в классическом виде в виде двумерных проекций “спиральных колес” (справа).

 

Пониженная гемолитическая активность САМП-ЛТА R9F2, K9F2 и H9F2 в силу их структурированности по сравнению с САМП-КТА R5F5, K5F5 и H5F5 (рис. 1а, 1б) обусловлена пониженным содержанием гидрофобных Phe-групп в составе пептида (18 и 50% соответственно) [26]. Гемолитическая активность при действии гистидин-содержащего САМП-ЛТА H9F2 in vitro даже при достаточно высокой его концентрации в среде (500 мкМ), содержащей эритроциты, не превышала 4%, тогда как уровень гемолиза для пептида H5F5 из группы САМП-КТА при той же его концентрации в среде 500 мкМ составляла уже > 60%, т.е. гистидин-содержащие САМП-КТА по уровню их действия на эритроциты оказались более чем в 15 раз токсичнее, чем аналогичные САМП-ЛТА [26].

Среди всех исследованных САМП-ЛТА гистидин-содержащий пептид H9F2 показал не только низкий уровень гемолитической токсичности, но и максимально высокую антигрибковую активность [26]. В настоящей работе с целью оптимизации последовательности антигрибкового пептида H9F2 с “линейным” типом амфипатичности и выявления более активных антигрибковых пептидов этого ряда необходимо было исследовать влияние на антигрибковую активность более длинных или, напротив, более коротких последовательностей таких гистидин-содержащих пептидов.

Ранее антимикробная активность пептидов, содержащих гидрофобные группы на N- или C-конце пептидной последовательности, не сравнивались. Поэтому необходимо было также выяснить, как влияет на антигрибковую активность пептида гидрофобный остаток фенилаланина (Phe) при его расположении на N- или на C-конце гистидин-содержащих пептидов, какова роль гидрофобных остатков в таких пептидах, другими словами, какова, например, антигрибковая активность аналогичного гистидин-содержащего пептида, не имеющего в своем составе остатки Phe.

Необходимо было сравнить биологические свойства таких гистидин-содержащих САМПЛТА друг с другом, а также с описанными в литературе активными гистидин-богатыми пептидными антигрибковыми препаратами, например, с 12-звенным антигрибковым пептидом P113 (AKRHHGYKRKFH) [27–29], который известен в качестве потенциального антигрибкового лекарственного препарата под названием PAC-113 (2016-132), [28], являющегося одним из наиболее коротких фрагментов природного антигрибкового белка гистатина 5 (Hst 5), обнаруженного в слюне человека [30–32]. На сегодняшний день пептид P113 (PAC-113) продемонстрировал свою эффективность и безопасность у пациентов с кандидозом полости рта [28] и уже прошел фазу IIB клинических испытаний в качестве антигрибкового препарата (компания Pacgen Biopharmaceuticals Corporation, Канада) [32].

Цель настоящей работы – синтез и сравнительный скрининг антигрибковой активности ряда сконструированных нами de novo гистидин-содержащих САМП (F2H7, F2H10, F2H13, F2H16, H10, H10F2), обладающих так называемым “линейным” типом амфипатичности, исследование их гемолитических свойств и оценка терапевтического индекса, а также сравнение полученных результатов с аналогичными данными для гистидин-богатого 12-звенного антигрибкового пептида P113 (AKRHHGYKRKFH) – потенциального лекарственного препарата, известного под названием PAC-113, одного из наиболее коротких и активных аналогов природного гистидин-богатого антигрибкового пептида Hst 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура, синтез и физико-химические свойства антимикробных пептидов. Для изучения влияния количества остатков гистидина, а также расположения гидрофобных групп в гистидин-содержащих пептидах на антигрибковую активность нами был сконструирован ряд модельных гистидин-содержащих САМП, образующих “линейный” тип амфипатичности (F2H7, F2H10, F2H13, F2H16, H10F2), а также пептиды H10, P113 и R9F2, использованные в качестве контрольных последовательностей. Структура синтезированных пептидов включала в себя последовательность аминокислот, содержащую свободную N-концевую аминогруппу (придающую пептиду дополнительный положительный заряд), и амидную группу на C-конце цепи, нейтрализующую отрицательный заряд свободной концевой карбоксильной группы (табл. 1).

 

Таблица 1. Структура пептидов

Пептид	Структура
F2H7	H-Phe-Phe-His-His-His-His-His-His-His-NH2
F2H10	H-Phe-Phe-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-NH2
F2H13	H-Phe-Phe-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-NH2
F2H16	H-Phe-Phe-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-NH2
H10	H-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-NH2
H10F2	H-His-His-His-His-His-His-His-His-His-His-Phe-Phe-NH2
P113	H-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-NH2
R9F2	H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-NH2

 

В амфифильных САМП-ЛТА F2H7, F2H10, F2H13, F2H16 и H10F2 гидрофобные Phe- и гидрофильные His-группы сгруппированы таким образом, что расположены раздельно на концах цепи пептида (табл. 1), создавая так называемый “линейный” тип амфипатичности [25, 26] (рис. 1б). Среди исследованных пептидов были выделены четыре гистидин-содержащих пептида различной длины с различным содержанием аминокислотных остатков His: F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16, т.е. пептиды, содержащие 7, 10, 13 и 16 остатков His соответственно на C-конце пептида и по два остатка Phe на N-конце пептида, которые были использованы для выявления оптимального количества остатков гистидинов, необходимых для осуществления пептидами их антимикробной и гемолитической активности.

С целью определения влияния гидрофобных остатков в составе исследуемых гистидин-содержащих пептидов на антигрибковую активность использованы три пептида: пептид H10F2 с десятью остатками His на N-конце и двумя гидрофобными остатками Phe на С-конце пептида; пептид F2H10, содержащий также десять остатков His и два остатка Phe на N-конце; декагистидин H10 как контрольный пептид без гидрофобных остатков Phe. Аргинин-содержащий пептид R9F2 по своей структуре принадлежит, так же как и остальные вышеперечисленные пептиды с остатками гистидина, к САМП-ЛТА (рис. 1б), но вместо гистидина содержит аргинин. Этот пептид был использован нами в качестве контрольного пептида для выяснения сравнительной роли влияния остатков His на антигрибковую активность. В качестве контрольного пептида был синтезирован также 12-звенный пептид P113 [28, 32], являющийся одним из наиболее коротких и активных фрагментов Hst 5 [27–29], 26-мерного антигрибкового пептида Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr (2001-5643) [30], выделенного из слюнной железы человека [30, 31] (в структуре Hst 5 подчеркнута последовательность фрагмента P113).

Синтез исследованных пептидов проводили стандартным твердофазным методом с использованием Fmoc-стратегии [33] согласно ранее опубликованной схеме [25] на пептидном синтезаторе PS3. Эффективность присоединения одного аминокислотного мономерного звена, определенная путем измерения количества удаляемых Fmoc-групп на каждой стадии конденсации, для синтезированных пептидов в среднем составила 97.2–99.8%. Конечные выходы пептидов после деблокирования, удаления с полимерного носителя и очистки методом офВЭЖХ составили ~50–67% (табл. 2). По данным офВЭЖХ и масс-спектрометрии, все выделенные пептиды соответствовали ожидаемой структуре и были гомогенными с содержанием основного вещества не менее 95%.

 

Таблица 2. Физико-химические характеристики пептидов

Пептиды	Общий выход  синтеза*, %	Время Удерживания  (τ)**, мин, 30% CH3CN	Молекулярная масса
			расч. [M + H]	эксп. [M + H]
F2H7	66.7	18.2	1271.4	1271.7
F2H10	59.1	19.0	1682.8	1682.9
F2H13	55.2	19.6	2094.3	2094.1
F2H16	49.8	20.0	2505.7	2505.4
H10	63.4	12.8	1388.5	1388.8
H10F2	61.0	22.5	1682.8	1683.0
P113	56.5	16.6	1563.8	1564.1
R9F2	56.0	21.9	1717.0	1716.5

* Конечный выход после удаления с полимерного носителя и очистки методом офВЭЖХ в расчете на первую загруженную аминокислоту на полимерном носителе.

** В условиях аналитической офВЭЖХ (условия см. в “Эксперим. части”).

 

С увеличением количества остатков гистидина в составе пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16 время их удерживания на колонке при офВЭЖХ закономерно повышалось от 18.2 до 20.0 мин (табл. 2). Причем пептид H10, не содержащий гидрофобных остатков Phe, в ряду всех исследованных пептидов имеет наименьшее время удерживания (τ = 12.8 мин). Однако следует отметить неожиданную разницу во времени удерживания пептидов F2H10 и H10F2 одинакового состава, но содержащих остатки Phe на разных концах цепи – N- или C-конце (τ = 19.0 и 22.5 мин соответственно) (табл. 2). По-видимому, наличие гидрофобных остатков Phe на N- или C-конце пептида по-разному влияет на его пространственную структуру, увеличивая или уменьшая своего рода “замаскированность” или “размытость” гидрофобных групп в самом пептиде. Так, например, в случае пептида F2H10 концевой остаток Phe на N-конце содержит гидрофильную положительно заряженную концевую аминогруппу, что в какой-то мере, вероятно, “разбавляет” или “размывает” гидрофобный кластер, образуемый двумя концевыми остатками Phe на N-конце такого пептида. Остатки Phe на C-конце цепи в случае пептида H10F2, в свою очередь, кооперативно группируясь друг с другом и с относительно нейтральной амидной группой, по-видимому, образуют, более компактный гидрофобный кластер на C-конце, что, скорее всего, в целом влияет на гидрофобные свойства пептида H10F2, увеличивая его относительную гидрофобность относительно пептида F2H10.

По сравнению с 12-звенными гистидин-содержащими пептидами F2H10 и H10F2 с двумя остатками Phe на N- или C-концах цепи, время удерживания контрольного 12-мерного пептида P113 оказалось наименьшим (τ = 19.0, 22.5 и 16.6 мин соответственно) (табл. 2). Вероятно, такое различие в гидрофобности связано с наличием в пептиде P113 дополнительно более гидрофильных остатков Arg и Lys и меньшим содержанием остатков His, а также наличием менее гидрофобного (по сравнению с Phe) остатком тирозина (Tyr).

Гидрофобность всех исследованных пептидов по данным офВЭЖХ может быть расположена по возрастанию их времени удерживания в следующем ряду:

H10F2 > R9F2 > F2H16 > F2H13 > F2H10 > F2H7 > P113 > H10.

Видно, что наиболее гидрофобны в этом ряду пептиды H10F2 и R9F2, а пептиды P113 и H10 обладают наименьшей гидрофобностью.

Таким образом, синтез всех пептидов в указанном режиме, как и ранее [25, 26], проходит достаточно эффективно, с относительно высокими выходами, которые закономерно снижаются с увеличением длины синтезируемой цепи. Зависимость гидрофобности соответствующих гистидин-содержащих пептидов с остатками Phe на N- конце цепи пептида, по данным офВЭЖХ, закономерно возрастает с увеличением количества остатков гистидина в их составе. Также следует отметить, что гидрофобность исследованных гистидин-содержащих пептидов зависит от расположения гидрофобных остатков Phe на C- или N-конце цепи пептида: пептид H10F2 обладает большей гидрофобностью, чем аналогичный пептид F2H10.

Антигрибковая активность пептидов. Антигрибковую активность пептидов изучали на примере условно-патогенной дрожжеподобной грибковой культуры C. albicans. Каждый из пептидов в конечных концентрациях 0.3–100 мкМ добавляли к растущим культурам клеток C. albicans и наблюдали за ростом клеток. Влияние присутствия пептидов в культуральной среде на рост самой культуры клеток контролировали измерением оптической плотности (оптического поглощения при 595 нм) суспензии растущих клеток во времени в течение 24 ч [25, 26, 34]. Для оценки антигрибковой активности исследованных пептидов были определены их минимальные подавляющие концентрации (МПК₅₀), при воздействии которых доля микробных частиц составляла 50% от концентрации частиц в контрольной культуре [25, 26]. Значения МПК₅₀, характеризующие антигрибковую активность исследованных пептидов, приведены в табл. 3. На рис. 2 значения МПК₅₀ исследованных пептидов для наглядности представлены в виде диаграммы обратных значений МПК₅₀ (1/МПК₅₀), отражающих прямую антигрибковую активность пептидов (чем выше значения 1/МПК₅₀, тем выше активность).

В качестве универсальных положительных контролей для сравнения относительной антигрибковой активности исследуемых пептидов использовали известные антисептические препараты – водные растворы хлоргексидина (ХГ) и нитрата серебра (AgNO₃). Во всех исследованных случаях (за исключением пептида F2H7) антигрибковая активность гистидин-содержащих пептидов существенно (в 3 и более раз) превышала активность контрольных препаратов AgNO₃ и ХГ (табл. 3, рис. 2).

 

Рис. 2. Гистограмма обратных значений МПК₅₀ (1/МПК₅₀) пептидов по отношению к грибковым культурам клеток C. albicans после 24 ч инкубации с пептидами.

 

Из данных табл. 3 и диаграммы обратных значений МПК₅₀ (рис. 2) видно, что антигрибковая активность пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16, содержащих Phe-группу на N-конце пептида, возрастает с увеличением числа остатков His (МПК₅₀ = 8.9, 1.5, 1.5 и 1.0 мкМ соответственно) (табл. 3). Так, например, значения МПК₅₀ пептидов в этом ряду возрастают, начиная со значения 8.9 мкМ для пептида F2H7 и достигая максимума для пептида F2H16 (МПК₅₀ = 1.0 мкМ) (табл. 3). Таким образом, антигрибковая активность исследованных пептидов возрастает с увеличением длины пептида и количества остатков His в их составе в следующем ряду:

F2H7 < F2H10 < F2H13 < F2H16.

 

Таблица 3. Значения МПК₅₀ исследованных пептидов по отношению к грибковым культурам клеток C. albicans

Пептиды	МПК₅₀*, мкМ
F2H7	8.9
F2H10	1.5
F2H13	1.5
F2H16	1.0
H10	0.7
H10F2	0.9
P113	3.4
R9F2	4.6
ХГ	6.8
AgNO3	9.9

* МПК₅₀ – минимальная подавляющая концентрация (концентрация пептида, при которой рост микроорганизмов подавляется на 50%). Среднестатистическая ошибка (или стандартное отклонение значений экспериментальных данных) не превышает 15–30%.

 

Ранее антимикробную активность пептидов, содержащих гидрофобные группы на N- или C-конце пептида, не сравнивали. Поэтому неожиданным для нас оказалось то, что синтезированный нами пептид H10F2, содержащий Phe-группу на C-конце пептида, обладает не только более высокой гидрофобностью, но и более высокой антигрибковой активностью (МПК₅₀ = 0.9 мкМ) по сравнению с пептидом F2H10, содержащим Phe на N-конце цепи (МПК₅₀ = 1.5 мкМ) (табл. 3). Величина активности для пептида H10F2 (МПК₅₀ = 0.9 мкМ) сопоставима с таковой для пептида F2H16 (МПК₅₀ = 1 мкМ), проявляющего максимальную активность среди всех исследованных гистидин-содержащих пептидов с остатками Phe на N-конце. Таким образом, обнаружено, что гистидин-содержащие пептиды с гидрофобной Phe-группой на N-конце пептида проявляют существенно меньшую антигрибковую активность, чем гистидин-содержащие пептиды, у которых гидрофобная Phe-группа находится на N-конце. Более того, оказалось, что декагистидиновый пептид H10, не содержащий остатков Phe, обладает еще большей антигрибковой активностью (МПК₅₀ = 0.7 мкМ) (табл. 3), чем аналогичные декагистидин-содержащие пептиды F2H10 и H10F2 с остатками Phe на С- или N-концах (МПК₅₀ = = 1.5 и 0.9 мкМ соответственно) (табл. 3). Этот факт для нас оказался также неожиданным, поскольку, согласно литературным данным, механизм действия АМП, в том числе и гистидин-богатых пептидов, предполагает наличие у пептида амфифильности, которая необходима для взаимодействия АМП с клеточной мембраной микроорганизмов [14–16, 28]. Другими словами, для успешного проникновения через мембрану микробной клетки в составе пептида необходимо наличие не только катионных остатков аминокислот, но и гидрофобных остатков, способных взаимодействовать с гидрофобным слоем мембраны. Однако, исходя из полученных данных, видно, что остатки Phe на С- или N-концах гистидин-содержащих пептидов в нашем случае не только способствуют проявлению антигрибковой активности, а напротив, даже “мешают” или “препятствуют” проявлению такой активности, например, в случае пептида F2H10 в большей, а в случае пептида H10F2 – в меньшей степени. Таким образом, видно, что пептид H10, который не содержит никакие “препятствующие” проявлению антигрибковой активности гидрофобные остатки Phe, проявляет максимальную антигрибковую активность, превосходящую активность пептидов F2H10 и H10F2, содержащих остатки Phe.

Аргинин-содержащий пептид R9F2, обладающий также “линейным” типом амфипатичности (рис. 1б), проявляет существенно (в 5 раз) меньшую антигрибковую активность (МПК₅₀ = 4.6 мкМ) (табл. 3), чем аналогичный гистидин-содержащий пептид H10F2 (МПК₅₀ = 0.9 мкМ) (табл. 3), что свидетельствует о преимущественной значимости остатков His в структуре пептида для проявления его относительно высокой антигрибковой активности. Ранее нами было показано, что тот же аргинин-содержащий пептид R9F2 гораздо эффективнее воздействует на бактериальные клетки, чем на клетки грибов, причем гораздо эффективнее, чем аналогичный гистидин-содержащий пептид H9F2 [25, 26]. Вероятно, воздействие гистидин-содержащих пептидов на клетки грибов происходит по другому механизму [35, 36], чем при воздействии на бактериальные клетки [14–16].

Согласно литературным данным [28, 32, 35, 36], один из представителей гистатинов (гистидин-богатых пептидов) – Hst 5 – связывается с белками клеточной стенки C. albicans (Ssa1/2), с гликанами и поглощается клетками посредством переносчиков грибковых полиаминов. Попав внутрь грибковых клеток, Hst 5 может влиять на функции митохондрий и вызывать окислительный стресс, однако конечная причина гибели клеток – дисрегуляция объема и дисбаланс ионов, вызванный осмотическим стрессом. Но поскольку специфической активностью по отношению к C. albicans обладает не только Hst 5, но и остальные гистатины, содержащие в своем составе остатки гистидинов, вполне уместно предположить, что на поверхности дрожжевых клеток C. albicans имеются специфические рецепторы к гистидин-богатым пептидам. Другими словами, причина проникновения гистидин-богатых пептидов (гистатинов), в том числе исследованных нами гистидин-содержащих САМП (F2H7, F2H10, F2H13, F2H16, H10F2, H10), как можно предположить, – это не их катионные свойства, а наличие рецепторов, специфических к гистидин-богатым пептидам. Проникновение в клетку в данном случае, скорее всего, должно идти не по электростатическому, а по рецептор-опосредованному механизму, хотя, как утверждается в некоторых случаях, электростатические взаимодействия также играют немаловажную роль в первоначальном связывании с отрицательно заряженной поверхностью клеток C. albicans [28, 37].

Важность электростатических взаимодействий наряду с рецептор-опосредованными взаимодействиями подчеркивается в случае антигрибкового пептида P113 (AKRHHGYKRKFH) (20202654), полученного из белка Hst 5 слюны человека [27], который сохраняет антигрибковую активность, сопоставимую с активностью исходной молекулы Hst 5. Утверждается, что механизм антигрибковой активности пептида P113 аналогичен механизму Hst 5 [27]. Предполагается, что первоначально положительно заряженные остатки P113 связываются с отрицательно заряженной поверхностью условно-патогенных дрожжевых клеток C. albicans посредством электростатических взаимодействий с последующим связыванием с белком клеточной стенки Ssa2 и транслокацией в цитоплазму [37]. При этом утверждается, что две катионные аминокислоты Lys2 и Lys10 в составе пептида P113 играют важную роль в транспорте в цитозоль [37]. Однако антигрибковая активность исследованного нами пептида H10 (МПК₅₀ = = 0.7 мкМ) (табл. 3), содержащего лишь остатки His, оказалась намного (почти в 5 раз) выше, чем антигрибковая активность пептида P113. В случае пептида P113 сам факт электростатического взаимодействия АМП с клеточной стенкой или мембраной дрожжевой клетки, скорее всего, важен, однако в случае пептида H10 взаимодействие десяти остатков His с рецепторами клеточной стенки, вероятно, перекрывает по своей активности электростатические взаимодействия, которые дополнительно присутствуют в пептиде P113 благодаря остаткам Arg и Lys. Три остатка His в составе пептида P113, вероятно, недостаточны для эффективного взаимодействия с гистидин-специфичными рецепторами, хотя электростатические взаимодействия, обусловленные катионными аминокислотными остатками Arg и Lys, в этом случае дополняют рецептор-опосредованные взаимодействия. И, как видно на примере исследованных нами пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16, увеличение количества остатков гистидинов в пептидах действительно последовательно увеличивает их антигрибковую активность (табл. 3).

Таким образом, был проведен скрининг антигрибковой активности гистидин-содержащих пептидов с разной структурой. Антигрибковая активность (АГА) исследованных пептидов может быть расположена в следующем ряду по возрастанию их активности:

H10 > H10F2 ≥ F2H16 > F2H10 ≫ P113 > R9F2,

где АГА пептидов P113 и R9F2 самая низкая.

Результаты проведенного скрининга показывают, что антигрибковая активность исследованных пептидов зависит не только от содержания остатков гистидина в составе пептида, повышаясь с увеличением числа гистидинов в пептиде, но и от расположения гидрофобных остатков Phe. Гистидин-содержащие пептиды с гидрофобными остатками Phe на C-конце способны проявлять большую антигрибковую активность, чем аналогичные пептиды с остатками Phe на N-конце. Среди всех исследованных пептидов наибольшей антигрибковой активностью обладает пептид H10, не содержащий гидрофобных остатков Phe, который по своей антигрибковой активности эффективнее аналогичных гистидин-содержащих пептидов F2H10 и H10F2 с остатками Phe на N- или C-конце, а также пептида F2H16, содержащего максимальное количество остатков His, и который почти в 5 раз эффективнее известного в литературе антигрибкового пептида P113 – одного из самых коротких активных фрагментов природного гистидин-богатого антигрибкового белка Hst 5.

Гемолитическая активность пептидов. При создании САМП в качестве потенциальных лекарственных препаратов одним из важных факторов, помимо высокой эффективности синтеза и повышенной антимикробной активности, является их относительно низкая токсичность по отношению к высшим организмам, в частности низкая гемолитическая активность создаваемых САМП. Ранее нами было показано, что САМП ЛТА по сравнению с САМП КТА обладают не только повышенной антигрибковой активностью, но и намного меньшей гемолитической активностью, поскольку в силу своего структурного строения таких пептидов (рис. 1а, 1б) содержание гидрофобных остатков у САМП ЛТА намного меньше, чем у САМП КТА [26]. Эксперименты, проведенные с лизисом эритроцитов, показали, что исследованные нами гистидин-содержащие САМП ЛТА (табл. 1 и 4) при их относительно высокой (400 мкМ) концентрации в среде, содержащей эритроциты, в большинстве случаев демонстрируют довольно низкую (не превышающую 10%) гемолитическую активность, за исключением пептида F2H16, для которого уровень лизиса эритроцитов составил 18.1% (табл. 4).

 

Таблица 4. Гемолитическая активность исследуемых пептидов

Пептиды	Гемолиз*, %
F2H7	1.2
F2H10	4.2
F2H13	6.1
F2H16	18.1
H10	0.4
H10F2	8.7
P113	0.1
R9F2	6.8

* Гемолиз проводили при концентрации пептидов 400 мкМ в среде эритроцитов.

 

Гемолитическая активность увеличивающихся по длине САМП ЛТА F2H7, F2H10, F2H13, F2H16 составляет 1.2, 4.2, 6.1 и 18.1% соответственно (табл. 4), а значения МПК₅₀ для этих же пептидов – 8.9, 1.5, 1.5 и 1.0 мкМ соответственно (табл. 3). Другими словами, в данном случае видно, что увеличение антигрибковой активности пептидов в представленном ряду сопровождается одновременно увеличением их гемолитической активности и достигает максимального значения гемолитической токсичности 18.1% у пептида F2H16, который в этом же ряду обладает максимальной антигрибковой активностью (МПК₅₀ = = 1.0 мкМ) (табл. 3). Такая закономерность увеличения гемолитической и антигрибковой активности, скорее всего, связана с увеличением гидрофобности представленных пептидов (τ = 18.2, 19.0, 19.6, 20.0 мин соответственно) (табл. 2). Аналогичное влияние гидрофобности АМП на их антимикробную и гемолитическую активность ранее также было отмечено в литературе [14, 15, 38, 39].

Таким образом, гемолитическая активность (ГА) для увеличивающихся по длине пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16, как и в случае их антигрибковой активности, увеличивается в ряду:

F2H7 < F2H10 < F2H13 < F2H16.

Такая же закономерность увеличения гемолитической и антигрибковой активности с увеличением гидрофобности исследуемых пептидов наблюдается и для пептидов F2H10 и H10F2 одинакового состава, но с разным расположением Phe-групп на концах цепи. Наиболее гидрофобный пептид H10F2 по сравнению с пептидом F2H10 (τ = 22.5 и 19.0 мин соответственно) (табл. 2) показывает как наибольшую антигрибковую (МПК₅₀ = = 0.9 и 1.5 мкМ) (табл. 3), так и наибольшую гемолитическую активность (8.7 и 4.2%) (табл. 4).

Однако в некоторых случаях можно наблюдать и обратную зависимость между антибактериальной и гемолитической активностями. Так, например, видно, что наиболее активный антигрибковый пептид H10 (МПК₅₀ = 0.7 мкМ) (табл. 3) в то же время обладает и наименьшей (практически нулевой) гемолитической активностью, равной 0.4%, сравнимой с общим фоном гемолиза самих эритроцитов в среде без каких-либо реагентов (табл. 4). Такая низкая гемолитическая активность пептида H10 по сравнению с другими пептидами, вероятно, связана с отсутствием в его составе гидрофобных остатков Phe и в связи с этим с довольно низкой гидрофобностью этого пептида (τ = 12.8 мин) (табл. 2). Таким образом, гистидин-содержащий пептид H10, несмотря на свою относительно низкую гидрофобность, помимо своей повышенной антимикробной активности показал также и относительно низкую гемолитическую токсичность по отношению к эритроцитам.

Контрольный пептид P113, так же как и пептид H10, обладает наименьшей (практически нулевой) гемолитической активностью, равной 0.1% (табл. 4), сравнимой с общим фоном гемолиза самих эритроцитов, что также, вероятно, связано с низкой гидрофобностью этого пептида (τ = 16.6 мин) (табл. 2). Однако антигрибковая активность пептида P113 существенно ниже, чем у пептида H10 (МПК₅₀ = 3.4 и 0.7 мкМ соответственно) (табл. 3).

Гемолитическая активность (ГА) всех исследованных пептидов может быть представлена по возрастанию их активности в следующем ряду:

F2H16 > H10F2 > R9F2 > F2H13 > F2H10 > F2H7 > H10 > P113,

т.е. пептиды H10 и P113 по своей ГА в представленном ряду стоят на последнем месте и наименее токсичны по отношению к лизису эритроцитов.

Таким образом, повышенная или пониженная гемолитическая активность исследованных гистидин-содержащих пептидов не всегда коррелируют с их пониженной или повышенной антигрибковой активностью. Увеличение длины пептида приводит не только к увеличению их гидрофобности и антигрибковой активности, но также и к увеличению их гемолитической токсичности. Напротив, среди всех исследованных пептидов гистидин-содержащий пептид H10 показал не только самую высокую антигрибковую, но и наименьшую гемолитическую активность. Описанный в литературе гистидин-богатый пептид P113 также обладает минимальной гемолитической активностью, однако его антигрибковая активность почти в 5 раз ниже, чем у пептида H10. Пептиды F2H16 и H10F2 хотя и демонстрируют сравнительно высокую антигрибковую активность, сопоставимую с активностью пептида H10, но уровень их гемолитической токсичности (особенно для пептида F2H16) остается относительно высоким.

Терапевтический индекс. Увеличение антимикробной активности АМП часто сопровождается увеличением их гемолитического действия, т.е. способности разрушать эритроциты [14, 15, 40, 41]. Активный в отношении микроорганизмов препарат может оказаться, в свою очередь, также и довольно токсичным. В таком случае терапевтический потенциал антимикробных агентов оценивается на основе селективности их действия на исследуемые патогенные микроорганизмы по сравнению с аналогичным их действием на эритроциты в виде терапевтического индекса (ТИ), т.е. как отношение величины минимальной гемолитической концентрации (МГК) к величине МПК, где МГК – концентрация пептида, вызывающая лизис определенной доли свежих красных кровяных телец [26, 42].

Для оценки селективности действия пептидов нами были определены величины МГК пептидов и вычислены значения их ТИ (табл. 5). За величину МГК в нашем случае мы принимали концентрацию пептида, которая вызывала лизис 4% свежих красных кровяных клеток. Поскольку уровень гемолитической активности пептида H10 даже при максимальной его концентрации (400 мкМ) в среде приближается к нулю, а дальнейшее увеличение его концентрации приводит к снижению растворимости пептида, то подсчитать точное значение МГК, определяемую как концентрация пептида, которая вызывает лизис 4% свежих красных кровяных клеток, для данного пептида путем повышения его концентрации в среде не удается. В этом случае значение МГК для пептида H10 оценивали как величину > 1000 мкМ, а ТИ принимали как величину > 1400 (1000/0.7 = ~1400) (табл. 5). Аналогичный расчет использовали и при оценке селективности воздействия для пептида P113, который также при максимально высокой концентрации пептида 400 мкМ в среде, содержащей эритроциты, проявляет довольно низкую (практически нулевую) гемолитическую активность, равную 0.1% (табл. 4). Величину МГК для этого пептида также принимали > 1000 мкМ, а величину ТИ, соответственно, принимали > 300 (1000/3.4 = ~300) (табл. 5).

 

Таблица 5. Минимальная гемолитическая концентрация (МГК) и терапевтический индекс (ТИ) исследуемых пептидов

Пептиды	МГК*, мкМ	ТИ**
F2H7	700	79
F2H10	350	233
F2H13	370	247
F2H16	60	60
H10	≫ 1000	> 1400
H10F2	200	222
P113	≫ 1000	> 300
R9F2	300	65

* МГК – минимальная гемолитическая концентрация – такая концентрация пептида (мкМ), которая вызывает лизис 4% свежих красных кровяных клеток. Средняя ошибка приведенных значений МГК, ТИ и СГ не превышает величину 15–20%.

** ТИ – терапевтический индекс для каждой культуры микроорганизмов по отдельности, выраженный в виде отношения значения МГК к МПК₅₀. Большие значения ТИ указывают на большую селективность пептида.

 

В случае увеличивающихся по длине пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16 наблюдается повышение их антигрибковой активности и одновременное увеличение их гемолитической активности, рассчитанной как МГК (МПК₅₀ = 8.9, 1.5, 1.5 и 1.0 мкМ) (табл. 3 (МГК = 700, 350, 370 и 60 мкМ соответственно) (табл. 5). Первый из этих факторов увеличивает, а последний – снижает селективность этих препаратов. В результате селективность пептида F2H7 (ТИ = 79) (табл. 5) с наименьшей антигрибковой активностью (МПК₅₀ = = 8.9 мкМ) (табл. 3) становится сопоставимой с селективностью пептида F2H16 (ТИ = 60) (табл. 5), обладающего максимальной в представленном ряду антигрибковой активностью (МПК₅₀ = 1.0 мкМ) (табл. 3). В то же время селективность промежуточных по своей антигрибковой активности пептидов F2H10 и F2H13 (МПК₅₀ = 1.5 и 1.5 мкМ) (табл. 3) становится существенно выше (ТИ = 233 и 247) (табл. 5), чем селективность для крайних по активности в этом же ряду пептидов F2H7 и F2H16 (ТИ = 79 и 60) (табл. 5). Другими словами, дальнейшее увеличение длины гистидин-содержащих пептидов (более чем на 16 остатков гистидина) с целью повышения их антигрибковой активности в данном случае, вероятно, нецелесообразно, поскольку гемолитическая токсичность пептидов в представленном ряду увеличивается быстрее, чем их антигрибковая активность, и, как результат, селективность таких пептидов начинает снижаться. Таким образом, в плане терапевтической значимости в представленном ряду пептидов оптимальны пептиды F2H10 или F2H13, обладающие более высокой селективностью, чем более короткие или более протяженные пептиды F2H7 или F2H16.

При сравнении антигрибковых и гемолитических свойства двух одинаковых по составу пептидов F2H10 и H10F2, но с разным расположением гидрофобных Phe-групп на концах, видно, что более эффективен по отношению к C. albicans пептид H10F2 (МПК₅₀ = 0.9 мкМ) (табл. 3), но в то же время и более токсичен по отношению к эритроцитам (МГК = 200 мкМ) (табл. 5), а менее эффективный пептид F2H10 (МПК₅₀ = 1.5 мкМ) (табл. 3), напротив, менее токсичен (МГК = 350 мкМ) (табл. 4). В итоге селективности обоих пептидов сопоставимы (ТИ = 222 и 233 соответственно) (табл. 5). Тем не менее пептид H10F2 по своей терапевтической значимости более предпочтителен, поскольку обладает большей антигрибковой активностью и для достижения соответствующего биологического эффекта требует использования меньшей концентрации в среде.

При сравнении антигрибковых и гемолитических свойств гистидин-содержащих САМП ЛТА с аналогичными по структуре пептидами, содержащими другие катионные аминокислотные остатки (например, аргинин), можно отметить, что аргинин-содержащий САМП ЛТА R9F2 проявляет более низкую гемолитическую активность (МГК = 300 мкМ) (табл. 5) по сравнению с близким по структуре гистидин-содержащим САМП ЛТА H10F2 (МГК = 200 мкМ) (табл. 5). Тем не менее селективность пептида R9F2 (ТИ = 65) (табл. 5) более чем в 3 раза ниже селективности пептида H10F2 (ТИ = 222) (табл. 5) вследствие более чем в 5 раз меньшей антигрибковой активности аргинин-содержащего пептида R9F2 по сравнению с пептидом H10F2 (МПК₅₀ =4.6 и 0.9 мкМ соответственно) (табл. 3). Таким образом, гистидин-содержащий САМП ЛТА не только более активен по отношению к грибковой культуре, но и обладает большей селективностью воздействия по сравнению с аргинин-содержащим пептидом аналогичной структуры.

С точки зрения селективности воздействия особо следует обратить внимание на пептид H10, для которого наблюдается как наибольшая антигрибковая активность (МПК₅₀ = 0.7 мкМ) (табл. 3), так и минимальная гемолитическая токсичность (МГК > 1000 мкМ) (табл. 5). В результате селективность такого пептида среди всех исследованных пептидов максимально высокая (ТИ > 1400) (табл. 5). Пептид P113 также обладает минимальной гемолитической токсичностью (МГК > 1000 мкМ) (табл. 5). Тем не менее антигрибковая активность пептида P113 (МПК₅₀ = 3.4 мкМ) (табл. 3) почти в 5 раз ниже, чем активность пептида H10. Таким образом, хотя контрольный пептид P113 обладает низкой гемолитической токсичностью, сопоставимой с таковой для пептида H10, и относительно высокой селективностью (ТИ > 300) (табл. 5), тем не менее пептид H10 характеризуется более чем в 4 раза превосходящей селективностью воздействия (ТИ > 1400) (табл. 5).

В отношении селективности, выраженной величиной ТИ, исследованные пептиды по возрастанию значений их ТИ могут быть представлены в следующем ряду:

H10 ≫ P113 > F2H13 ≥ F2H10 ≥ H10F2 > F2H7 ≥ R9F2 ≥ F2H16.

Исходя их такого сравнения, видно, что на первом месте по селективности воздействия стоят пептиды H10 и P113, затем пептиды F2H13, F2H10 и H10F2, на последнем месте – пептид F2H16.

Таким образом, скрининг антигрибковой и гемолитической активности гистидин-содержащих САМП показал, что среди всех исследованных пептидов пептид H10 обладает не только наибольшей антимикробной и наименьшей гемолитической активностью, но и наибольшей селективностью (ТИ > 1400), превосходящую более чем в 4 раза селективность известного из литературы гистидин-богатого антигрибкового пептида P113. Пептид H10 может быть представлен как один из перспективных антигрибковых пептидных препаратов не только в плане его высокой антигрибковой активности, низкой гемолитической токсичности и, соответственно, его высокой терапевтической значимости, но и в плане экономичности его синтеза по сравнению с другими представленными пептидами, в том числе пептидом P113, поскольку аминокислотная последовательность пептида Н10 гомогенна и состоит лишь из одних аминокислотных остатков гистидина. Пептиды F2H13, F2H10 и H10F2 обладают сопоставимой друг с другом высокой селективностью (ТИ = 247, 233 и 222 соответственно) (табл. 5) и также могут использоваться для дальнейших исследований в качестве потенциальных антигрибковых пептидных препаратов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы. В работе использовали реактивы для пептидного синтеза (Sigma, Fisher Scientific, Bachem, Protein Technologies, США); полистирольный полимер 855013 Novabiochem® NovaSyn®TG Sieber resin, функционализированный 9-Fmoc-аминоксантен-3-илоксильным фрагментом, 200 ммоль/г (Merck Schuchardt OHG, Германия); защищенные аминокислотные мономеры (Protein Technologies, США); конденсирующий реагент HATU – 2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат (кат. № 023926, Oakwood Products Inc., США).

Синтез антимикробных пептидов. Пептиды были синтезированы твердофазным методом с использованием Fmoc-стратегии [33] аналогично опубликованной ранее схеме [25] на пептидном синтезаторе PS3 (Protein Technologies, США). Содержание основного вещества в синтезированных пептидах по данным офВЭЖХ составляло не менее 95%.

Штамм условно-патогенного гриба Candida albicans ЭМТК 34 поддерживали и нарабатывали в Коллекции экстремофильных микроорганизмов и типовых культур Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Образец крови для получения эритроцитов был предоставлен медицинской лабораторией Гемотест (г. Новосибирск).

Аналитическую офВЭЖХ проводили на хроматографе LC-20 AD (Shimadzu, Япония) с использованием детектора SPD-M20A (Shimadzu, Япония) на колонке Gemini 5 мкм NX-C18, 110 Å, 4.6 × 250 мм (Phenomenex Inc., США), уравновешенной 0.1%-ным раствором TFA, в линейном градиенте концентрации ацетонитрила 0–30% в течение 30 мин при скорости потока 1 мл/мин, УФ-детекция при длине волны 210, 220, 240 и 260 нм.

Молекулярные массы пептидов (табл. 2) определяли с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (REFLEX III, Bruker Daltonics, Германия) и ESI-MS (LC/MS XCT Ultra, Agilent Technologies, США) в Центре масс-спектрометрического анализа Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

Антимикробная активность пептидов. Растворы пептидов определенной концентрации для оценки антимикробной активности готовили из сухих навесок. Для пептидов F2H7, F2H10, F2H13, F2H16, H10F2 и R9F2, которые содержали по два остатка Phe, дополнительно проводили определение концентрации путем измерения поглощения в ближней УФ-области спектра с использованием значения молярного коэффициента поглощения при длине волны 260 нм, равного 330 л моль^–1 см^–1, который ранее был определен, исходя из соответствующих растворов пептидов, приготовленных из сухих навесок. Исходные растворы пептидов с концентрацией 1– 2 мМ хранили при –15°С в темноте не более месяца. Непосредственно перед экспериментом растворы разбавляли до нужной концентрации средой Сабуро. Исходная концентрация пептидов для приготовления проб для дальнейшего испытания их гемолитической активности составляла 2–4 мМ в воде.

Для работы использовали взвесь ночных бульонных культур, выращенных на стандартных питательных средах. Количество микроорганизмов (титр) во взвеси определяли по оптической плотности при длине волны 595 нм.

Для оценки антигрибкового действия пептидов проводили совместное инкубирование клеточных культур с исследуемыми пептидными препаратами в 96-луночных планшетах для культивирования. Ночные бульонные культуры C. albicans ресуспендировали в среде Сабуро, доводя количество микроорганизмов до посевной дозы ~5 × 10⁵ КОЕ/мл. В лунки последовательно вносили раствор исследуемых препаратов, а затем клеточную суспензию в соотношении 1 : 9 по объему (общий объем 200 мкл) в конечных концентрациях 0.3–50 мкМ. В качестве отрицательного контроля вместо тестируемого пептида вносили аналогичный объем среды Сабуро. В качестве положительного контроля вместо тестируемого пептида вносили аналогичный объем водных растворов ХГ или AgNO₃ в соответствующих разведениях, так же как и для пептидов, в конечных концентрациях 0.3– 50 мкМ. Инкубацию проводили в течение 24 ч при 37°С и 560 об/мин на шейкер-инкубаторе (Kuhner LT-X, АБТЕК, Россия). В нулевой точке и через 2, 4, 5, 6, 7, 8 и 24 ч после начала инкубации измеряли оптическую плотность суспензии на планшетном спектрофотометре iMark™ (Bio-Rad, США) при длине волны 595 нм. Результаты выражали в виде среднего значения оптической плотности клеточной суспензии в трех независимых экспериментах, выполненных в двух повторах. Среднестатистическая ошибка (или стандартное отклонение значений экспериментальных данных) при этом не превышала 15–30%. Стандартное отклонение (S) рассчитывали по формуле:

$S=\sqrt{\frac{1}{n}}{\sum }_{i=1}^n{\left(x_i-x_m\right)}^2$,

где n – число измерений, x_i  – i-тый элемент выборки, x_m – среднее арифметическое значение выборки.

Расчет МПК₅₀. Исходя из полученных средних значений оптической плотности суспензий клеточных культур, определяли величины относительной степени роста культуры микробных клеток (N_p/N₀) в виде отношения оптической плотности микробных частиц после добавления пептидного препарата (N_p) к оптической плотности в контрольной культуре (N₀). Концентрацию пептида, при которой величина относительной степени роста культуры микробных клеток составляла 50%, определяли по кривым зависимости величины относительной степени роста культуры микробных клеток (N_p/N₀) в процентах от концентрации пептидов [25, 43].

Фотометрический метод оценки гемолитической активности антимикробных пептидов в отношении эритроцитов человека. Гемолитическую активность исследуемых пептидов тестировали в отношении свежих эритроцитов человека согласно ранее опубликованным методикам [25, 42, 44]. Метод основан на измерении оптической плотности при длине волны 540 нм в надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования суспензии эритроцитов, поскольку при разрушении эритроцитов вышедший из клеток гемоглобин придает среде характерную красную окраску, сохраняющуюся после осаждения эритроцитов. Свежие эритроциты человека трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS: 10 мМ Na₂HPO₄, 1.76 мМ K₂HPO₄, pH 7.4), содержащим 173 мМ NaCl и 2.7 мМ KCl. К 80 мкл суспензии эритроцитов в PBS добавляли растворы пептидов в виде двукратных серийных разведений до конечного объема 100 мкл и концентрации суспензии эритроцитов 4% (по объему, за 100% принимали объем суспензии осажденных центрифугированием эритроцитов), инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После центрифугирования и отделения осадка измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 540 нм. За 100% гемолиза принимали оптическую плотность раствора, полученную при действии на эритроциты 10%-ного раствора тритона Х-100. За 0% принимали оптическую плотность, полученную при действии на эритроциты “холостого” буферного раствора, не содержащего пептидных проб. Гемолитический анализ проводили дважды с использованием одного образца крови человека. Данные представлены как среднее значение ± стандартные отклонения трех независимых экспериментов. Средняя ошибка эксперимента при этом не превышала 15–20%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами были сконструирован и синтезирован ряд новых гистидин-содержащих САМП ЛТА F2H7, F2H10, F2H13, F2H16 и H10F2 с “линейным” типом амфипатичности, а также неамфифильный по своей структуре пептид H10, не имеющий гидрофобных остатков и содержащий исключительно относительно гидрофильные остатки гистидина. Исследована антигрибковая и гемолитическая активность синтезированных пептидов. Проведено сравнение полученных результатов с аналогичными данными для известного из литературы гистидин-богатого 12-звенного антигрибкового пептида P113 (AKRHHGYKRKFH) (2020-2654) – потенциального лекарственного препарата под названием PAC-113, одного из наиболее коротких и активных аналогов природного антигрибкового пептида Hst 5.

Показано, что представленные гистидин-содержащие САМП ЛТА способны эффективно подавлять рост условно-патогенных грибов Candida albicans и обладают низкой гемолитической активностью, в большинстве случаев не превышающей 10% даже при их относительно высокой (400 мкМ) концентрации в среде, содержащей эритроциты.

Антигрибковая активность исследованных пептидов возрастает с увеличением количества остатков гистидина в их составе, достигая максимального значения для гистидин-содержащего пептида F2H16 (МПК₅₀ = 1.0 мкМ).

Показано, что с увеличением длины цепи пептидов растет также их гемолитическая токсичность. В отношении терапевтической значимости оптимальными в представленном ряду гистидин-содержащих САМП ЛТА оказались пептиды F2H10 и F2H13, обладающие более высокой селективностью, чем короткий или более протяженный пептиды F2H7 или F2H16. Терапевтический индекс (ТИ) для этих пептидов составил 233, 247, 79 и 60 соответственно.

Гистидин-содержащие производные пептидов с гидрофобными остатками Phe на N-конце пептида (F2H10) по сравнению с аналогичными пептидами одинакового состава, но содержащими остатки Phe на C-конце (H10F2), обладают меньшей гидрофобностью, проявляют меньшую антигрибковую активность и меньшую гемолитическую токсичность.

Показано, что декагистидиновый пептид, не содержащий остатков Phe (H10), обладает еще большей антигрибковой активностью (МПК₅₀ = = 0.7 мкМ), чем аналогичные пептиды F2H10 и H10F2 с остатками Phe на С- или N-концах (МПК₅₀ = 1.5 и 0.9 мкМ соответственно). Этот факт для нас оказался неожиданным, поскольку, согласно литературным данным, механизм действия АМП, в том числе и гистидин-богатых пептидов, предполагает наличие у пептида амфифильности, которая необходима для взаимодействия АМП с клеточной мембраной микроорганизмов [14–16, 28].

Вероятно, в данном случае взаимодействие гистидин-содержащих САМП с клеточной мембраной и клеточными стенками грибов мало связано с амфипатичностью пептидов, а преимущественно обусловлено рецептор-опосредованными взаимодействиями, связанными с наличием на поверхности клеток грибов рецепторов, специфических к гистидин-богатым пептидам, таких как, например, белки клеточной стенки C. albicans (Ssa1/2) [28, 32, 35, 36].

Пептид H10 по своей антигрибковой активности оказался эффективнее не только всех остальных гистидин-содержащих пептидов, в том числе и пептида F2H16 с 16 остатками гистидина, но и в 4–5 раз эффективнее антигрибкового пептида P113 (AKRHHGYKRKFH) (2020-2654) (МПК₅₀ = = 3.4 мкМ) – короткого активного фрагмента природного Hst 5, хорошо известного из литературы.

Вероятно, три остатка His в составе пептида P113 недостаточны для эффективного взаимодействия с рецепторами, и электростатические взаимодействия с катионными аминокислотными остатками Arg и Lys в этом случае лишь дополняют рецептор-опосредованные взаимодействия, но не позволяют при этом достичь той антигрибковой активности, как у пептида H10, содержащего все десять остатков His.

На примере исследованных пептидов F2H7, F2H10, F2H13 и F2H16 было показано, что увеличение количества остатков His в пептидах действительно последовательно увеличивает их антигрибковую активность.

Показано, что, благодаря своей относительно низкой гемолитической и высокой антигрибковой активности, представленные гистидин-содержащие САМП ЛТА F2H10, F2H13, F2H16, H10F2 обладают относительно высокими значениями ТИ (ТИ > 60).

Среди всех исследованных пептидов H10 и P113 обладают минимальными (практически нулевыми) значениями гемолитической активности.

Вследствие своей более высокой антигрибковой активности селективность пептида H10 (ТИ > > 1400) превышает селективность пептида P113 (ТИ > 340) более чем в 4 раза.

Таким образом, скрининг антигрибковой и гемолитической активности гистидин-содержащих САМП показал, что среди всех исследованных пептидов H10 обладает не только наибольшей антимикробной и наименьшей гемолитической активностью, но и наибольшей селективностью (ТИ > 1400), превосходящей более чем в 4 раза селективность известного из литературы гистидин-богатого антигрибкового пептида P113.

Пептид H10 может быть представлен как один из перспективных антигрибковых пептидных препаратов не только благодаря его высокой антигрибковой активности, низкой гемолитической токсичности и, соответственно, высокой терапевтической значимости, но и вследствие экономичности его синтеза по сравнению с другими исследованными пептидами, в том числе пептидом P113, поскольку аминокислотная последовательность пептида Н10 гомогенна и состоит лишь из аминокислотных остатков гистидина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Штаммы микроорганизмов взяты из Коллекции экстремофильных микроорганизмов и типовых культур Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование поддержано в рамках государственного задания Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН № 121031300042-1.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных кем-либо из авторов данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

N. V. Amirkhanov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of RAS

Author for correspondence.
Email: nariman@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. Akad. Lavrentieva 8, Novosibirsk, 630090

A. V. Bardasheva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of RAS

Email: nariman@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. Akad. Lavrentieva 8, Novosibirsk, 630090

V. N. Silnikov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of RAS

Email: nariman@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. Akad. Lavrentieva 8, Novosibirsk, 630090

N. V. Tikunova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of RAS

Email: nariman@niboch.nsc.ru
Russian Federation, prosp. Akad. Lavrentieva 8, Novosibirsk, 630090

References

Supplementary files