Expression of muscle-specific genes in atlantic salmon fingerlings (SALMO SALAR L.) in the conditions of aquaculture under the influence of different lighting and feeding regimes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Постэмбриональный рост мышц у рыб, в отличие от роста у птиц и млекопитающих, определяется не только гипертрофией – увеличением размера существующих мышечных волокон, но также включает гиперплазию – увеличение количества мышечных волокон за счет повторного образования новых миотуб [1]. Миогенез контролируется последовательной экспрессией специфических миогенных регуляторных факторов транскрипции (МРФ): MyoD, Myf5, миогенин (MyoG) и MRF4 [1]. В процессе миогенеза ключевой ролью MyoD и Myf5 являются спецификация и пролиферация миобластов, тогда как миогенин и MRF4 отвечают за их дифференцировку [2]. Регуляция миогенеза у рыб транскрипционным фактором MyoD усложняется наличием паралогов. В результате тетраплоидизации генома в ходе эволюции ген myod1 у лососевых представлен тремя функциональными паралогами: myod1a, myod1b и myod1c, которые экспрессируются независимо друг от друга на разных стадиях развития и в различных типах волокон [3, 4]. Паралоги MyoD дифференцированно функционируют во время созревания миотуб, и это позволяет предположить, что myod1b и myod1c в первую очередь экспрессируются в пролиферирующих клетках, а myod1a – в дифференцирующихся клетках. Это свидетельствует об их субфункционализации после дупликации всего генома атлантического лосося [3].

Последовательная экспрессия МРФ приводит к экспрессии генов ряда структурных мышечных белков, в том числе миозина, основного компонента мышечных волокон. Показано, что уровень экспрессии гена тяжелой цепи миозина (myhc) отражает накопление мышечных белков и темпы роста некоторых видов рыб: форели Oncorhynchus mykiss [5], атлантического лосося Salmo salar [6], пятнистой зубатки Anarhichas minor [7], светлоперого судака Sander vitreus [8]. Также показано, что корреляция темпов роста с уровнем экспрессии гена легкой цепи миозина mlc-2 была выше у радужной форели [9] и камбалы Senegalenses sole [10].

Инсулиноподобные факторы роста (IGF-I и IGF-II) и связанные с ними сигнальные пути играют центральную роль в регуляции роста скелетных мышц у млекопитающих и рыб [11]. Циркулирующие IGF присутствуют в сыворотке крови и в основном секретируются печенью под контролем оси гипофиз/гормон роста, однако оба гормона также синтезируются локально во многих тканях, включая скелетные мышцы в ответ на внешние и пищевые стимулы [3]. IGF-I и IGF-II способствуют гипертрофическому росту мышц, стимулируя пролиферацию и дифференцировку миогенных клеток, действуя на них аутокринно и паракринно [3, 11]. В отличие от IGF-I, роль IGF-II в метаболизме и росте рыб до конца не изучена. У млекопитающих ген igf2 экспрессируется главным образом в течение эмбриогенеза, в то время как у рыб на ювенильных и взрослых стадиях жизненного цикла [12].

Рост мышц также контролируется миостатином (MSTN), относящимся к суперсемейству трансформирующего фактора роста-b (TGF-b), который функционирует как негативный регулятор развития и роста скелетных мышц [13]. MSTN ингибирует пролиферацию и дифференцировку мышечных клеток у млекопитающих [13]. Однако, согласно недавним исследованиям, механизм действия MSTN на рост у рыб, вероятно, отличается от механизма у млекопитающих. MSTN кодируется двумя генами у большинства костистых рыб и четырьмя у лососевых рыб и, как было обнаружено, экспрессируется в мышцах и других тканях. Следовательно, он может выполнять различные функции [13, 14]. У лососевых MSTN представлен генами mstn1a, mstn1b, mstn2a и mstn2b (который является псевдогеном). Исследования на лососевых рыбах показали, что механизмы регуляции роста мышц MSTN зависят от типа мышц, стадии развития и условий питания [14–16].

Определение уровня экспрессии генов МРФ, igf, mstn1, миозина в мышцах для описания процессов роста и регуляции миогенеза часто используются в исследованиях влияния температуры, состава корма и режима питания, голодания и последующего восстановления питания на рост лососёвых и других видов рыб [10, 17, 18].

Свет – жизненно важный абиотический фактор, который оказывает существенное воздействие на развитие и рост рыб. Прямо или косвенно он влияет на плавательную активность, пищевое поведение, миграцию и размножение рыб, а у лососёвых и на наступление периода смолтификации, посредством влияния на эндогенные ритмы и уровни циркулирующих гормонов роста [19–21]. В аквакультуре удлинение светового дня используется для увеличения скорости роста рыб [22–24]. Удлиненные фотопериоды могут оказывать положительное воздействие на пищевое поведение и рост рыб посредством стимуляции гипоталамо-гипофизарной оси в их мозге, что приводит к увеличению выработки и секреции гормона роста и инсулиноподобного фактора роста [25, 26]. В ответ на изменение продолжительности дня концентрация гормонов и факторов роста меняется, что влияет на регуляцию миогенеза и пролиферацию миогенных клеток [26, 27].

Ранее, в исследованиях влияния фотопериода на молодь лосося при заводском выращивании в условиях северных широт было показано, что постоянное освещение способствовало ускорению роста особей, что сопровождалось изменением уровня экспрессии генов мышечных белков [28–30]. Но продолжительность периода интенсивного роста была ограничена сезонным понижением температуры. В условиях южных регионов появляется возможность выращивания молоди лосося при температуре воды в диапазоне 8–18^oC, в отсутствие зимних периодов низких температур, что позволяет рыбе питаться и расти круглый год. Однако отсутствует период белых ночей, характерный для северных широт. Исходя из этого, был поставлен эксперимент по влиянию постоянного освещения на рост и развитие сеголеток лосося Salmo salar L. (0+) в условиях аквакультуры в южном регионе России (Республика Северная Осетия-Алания).

Изучение экспрессии основных регуляторных факторов миогенеза и генов, контролирующих рост мышц, а также их паралогов в мышцах рыб, выращенных в условиях вариабельности внешних факторов (фотопериода и рациона кормления), позволит получить новые данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе роста рыб. Целью данной работы было изучение уровня экспрессии генов миогенеза у сеголеток атлантического лосося в процессе роста, выращиваемых в условиях постоянной температуры воды при воздействии двух режимов фотопериода (постоянного и естественного) в сочетании с разным режимом кормления.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование влияния разных режимов освещения на рост и развитие сеголеток лосося проводили на предприятии ООО “Остров аквакультура” (Республика Северная Осетия-Алания).

Эксперимент подробно расписан в работе Мурзиной с соавт. [31]. Сеголетки лосося (выклев 10–15 марта 2022 г., производитель Benchmark Genetics, Исландия) содержались в выростных лотках объемом 2.5–2.7 м³, (изначально в количестве 4900 особей/лоток) в условиях непрерывного освещения с августа до начала эксперимента (сентябрь). Кормление проводилось каждые два часа в круглосуточном режиме. С начала сентября сеголеток поделили на три экспериментальные группы по 2 лотка (при средней массе рыб 2.9 грамма в каждом лотке):

• группа № 1 (“24С КК”) – постоянный режим освещения (24С:0Т), круглосуточное кормление (КК);
• группа № 2 (“ЕстФ КД”) – естественный фотопериод (ЕстФ), кормление в светлое время суток (с 06:00 до 18:00 в сентябре, с 08:00 до 18:00 в октябре, с 08:00 до 17:00 в ноябре), через каждые два часа (КД);
• группа № 3 (“24С КД”) – постоянный режим освещения (24С), кормление в светлое время суток так же, как у рыб из группы № 2 (КД).

Лотки с постоянным освещением были оборудованы LED лампами 36W, 6500K. Освещение над поверхностью воды для групп рыб № 1 и № 3 при освещении лампами в темное время суток составило 450–650 lx. Использовали коммерческий корм; расчет объёма корма проводили согласно нормам с учетом биомассы. Температура воды была постоянной – 12.5 ^оС. Отход молоди рыб на конец эксперимента составил 24%, 33% и 19% особей в группах “24С КК”, “ЕстФ КД” и “24С КД”, соответственно. Для исследования отбирали сеголеток лосося 6 сентября (до эксперимента), 6 октября и 9 ноября; из каждой группы было взято до 15 особей из лотка. Средние масса и длина особей, взятых для анализа, представлены в таблице 1 [32].

 

Таблица 1. Средняя масса рыб, используемых для анализа

Группа	6 сентября		6 октября		9 ноября
	Масса, г	Длина, см	Масса, г	Длина, см	Масса, г	Длина, см
“24С КК”	3.85 ± 0.45	7.42 ± 0.27	5.59 ± 0.30	8.01 ± 0.43	11.87 ± 1.74	10.88 ± 0.53
“ЕстФ КД”			5.92 ± 0.58	8.12 ± 0.23	9.19 ± 1.37	9.19 ± 0.47
“24С КД”			6.11 ± 0.91	8.05 ± 0.40	11.93 ± 1.33	10.13 ± 0.39

 

Экспрессия исследуемых генов

Тотальная РНК была выделена из образцов белых скелетных мышц рыб с использованием набора “RNA-extract” (Евроген, Россия). Затем суммарную РНК обрабатывали ДНКазой (Силекс, Россия). Целостность и качество РНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и спектрофотометрически при коэффициенте поглощения 260/280 нм (NanoPhotometer С40-Touch, Implen, Германия). РНК подвергали обратной транскрипции с использованием MMLV-обратной транскриптазы (Евроген, Россия). В дальнейшем синтезированную кДНК использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Анализ проводили с использованием системы CFX96 Touch system (BioRad, США). Праймеры для гена тяжелой цепи миозина (myhc), легкой цепи миозина (mlc-2), референсного гена (фактора элонгации-1 (ef1a)), генов миогенных регуляторных факторов (миогенина (myog), паралогов myod1 (myod1a, myod1b, myod1c), myf5, igf1 и igf2, а также паралогов миостатина (mstn1a и mstn1b), подбирали с помощью программы Nucleotide BLAST. Последовательности праймеров приведены в таблице 2. Амплификацию 2 мкл кДНК проводили с использованием 5 мкл набора “5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I” (Евроген, Россия). Протокол ПЦР был следующим: денатурация ДНК – 5 минут при 95 °C; повторяющиеся циклы (42): денатурация ДНК – 20 с при 95 °C, отжиг праймеров – 30 с при 60 °C и элонгация – 30 с при 72 °C. Каждый образец был загружен в триплетах. Специфичность реакции ПЦР проверяли по кривым плавления, полученным в соответствии с протоколом диссоциации от 65 °C до 97 °C. Относительные уровни экспрессии исследуемых генов определяли методом порогового цикла (Ct) и нормализовали по уровню экспрессии референсного гена фактора элонгации (ef1a) с использованием метода 2^-ΔCt [33]. Данные выражали в единицах относительной экспрессии исследуемого гена (у.ед.).

 

Таблица 2. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР-РВ

Ген	Последовательность5’-3’	Размер ампликона, п. о.	Номер в GenBank
ef1a	F: TTGCTGGTGGTGTTGGTGAG R: AAACGCTTCTGGCTGTAGGG	154	AF321836.1
myog	F: GTGGAGATCCTGAGGAGTGC R: CTCACTCGACGACGAGACC	147	DQ452070
myod1a	F: TGGACTGCCTATCAAACATCC R: TCTCACTCGCTATGGAACC	123	AJ557148
myod1b	F: ATTTCGTTCCCTGTCACCTCTG R: ATGTGTTCGTCTTCGTTGTAATGG	152	AJ557150
myod1c	F: ACGGCGAAAACTACTACCCTTC R: TAGCTGCTTCGTCTTGCGGA	133	DQ366709.1
myf5	F: ACGCCATCCAGTACATCGAG R: AGTCAACCATGCTGTCGGAG	132	DQ452070
myhc	F: TCTCATCCATAGACGCCATC R: AGTTGACTGCCAAGAAGAGG	159	DN164736
mlc-2	F: TCAACTTCACCGTCTTCCTCAC R: GCCCACAGGTTCTTCATCTCC	190	NM_001123716.1
mstn1a	F: GATTACACGCCATCAAGTCC R: CTCCATCCTTATTGTCATCTCC	159	AJ344158
mstn1b	F: TCTGAGTTTTATGGTTGCTTTCGG R: TTGTGACTTGATGGCGTGTAATC	151	NM_001123634.1
igf1	F: ACAGAGCGTAGGACAGCACAG R: CCACAGAGGCACCAGGTAAGG	169	NM_001123623.1
igf2	F: GGAAAACACAAGAATGAAGGTCAA R: CCACCAGCTCTCCTCCACATA	128	NM_001123647.1

Примечание. Последовательности прямого (F) и обратного (R) праймеров (5’-3’), п. о. – пары оснований; ef1a – фактор элонгации 1a (референсный ген); myf5 – фактор миогенеза 5; myod1 – фактор детерминации миобластов 1; myog – миогенин; myhc – тяжелая цепь миозина; mstn – миостатин; igf – инсулиноподобный фактор роста.

 

Исследование выполнено на научном оборудовании ЦКП КарНЦ РАН.

Статистический анализ

Полученные данные были обработаны общепринятыми методами вариационной статистики. Данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро–Уилкса. В связи с отсутствием нормальности распределения статистически значимые различия определяли с помощью непараметрического критерия Краскела–Уоллиса (Kruskal–Wallis test), апостериорные сравнения между группами проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна–Уитни с поправкой на множественное сравнение. Различия считали статистически значимыми при p < 0.05. Результаты представлены в виде бокс-плотов с обозначением медиан, верхнего и нижнего квартилей, а также усов, обозначающих минимум и максимум.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данные, представленные на рис. 1a, свидетельствуют о том, что уровень экспрессии гена myhc был наименьшим в группе “ЕстФ КД” по сравнению с группами круглосуточного освещения: в октябре – по сравнению со значением в группах “24С КК” и “24С КД”, в ноябре – по сравнению с группой “24С КК”. Уровень экспрессии гена myhc увеличивался к ноябрю в мышцах рыб из всех исследуемых групп: в “24С КК” – по сравнению с первым и вторым месяцем исследования, в “ЕстФ КД” – по сравнению с предыдущим месяцем, в “24С КД” – по сравнению с первым месяцем исследования (рис. 1a).

 

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии генов (у. ед.) myhc (a), mlc‑2 (b), myf5 (c), myog (d) в белых мышцах атлантического лосося, выращиваемого в группах с разными режимами освещения и кормления на протяжении периода исследования: сентябрь – значения до эксперимента; группа 1 – “24С КК” – режим освещения постоянный, кормление круглосуточное; группа 2 – “ЕстФ КД” естественный фотопериод, кормление в светлое время суток; группа 3 – “24С КД” – режим освещения постоянный, кормление в светлое время суток. Различия достоверны при p < 0.05 (критерий Краскела–Уоллиса, критерий Манна–Уитни с поправкой на множественное сравнение): * – в сравнении с группой 1, # – в сравнении с группой 2, a – по сравнению со значениями в сентябре, b – по сравнению со значениями в октябре в соответствующей группе.

 

Уровень экспрессии гена mlc-2 был наиболее низким в ноябре в группе “ЕстФ КД” по сравнению с группами круглосуточного освещения “24С КК” и “24С КД” (рис. 1b). При этом следует отметить, что значения данного показателя в группах с круглосуточным освещением в ноябре увеличивались по сравнению с предыдущим месяцем.

Установлены различия в экспрессии генов миогенных регуляторных факторов (МРФ). В ноябре уровень экспрессии гена myf5 был наименьшим в группе “ЕстФ КД” по сравнению с группами круглосуточного освещения (рис. 1c). Значение показателя увеличивалось к ноябрю только в группах с дополнительным освещением. Уровень экспрессии гена myog был выше в группе “24С КД” по сравнению с “24С КК” в ноябре (рис. 1d). За период исследования динамика показателя наблюдалась только в группе “24С КК”: в октябре значение увеличивалось по сравнению с предыдущим месяцем, а в ноябре – уменьшалось.

Наиболее высокие значения экспрессии генов всех трёх паралогов myod1 установлены в группе “24С КД” в ноябре (рис. 2). При этом межгрупповые различия для генов myod1a и myod1b выявлены по отношению к двум другим группам, а у myod1c только к группе “24С КК”. Динамика экспрессии генов паралогов myod1 в разных экспериментальных группах имела различный характер (рис. 2). В группе “24С КК” наблюдалось увеличение уровня экспрессии в октябре (myod1a, myod1с) и снижение в ноябре (myod1a, myod1b). В группе “ЕстФ КД” уровень экспрессии myod1a и myod1b в ноябре снижался по сравнению с предыдущим месяцем, а уровень myod1с повышался. В группе “24С КД” уровень экспрессии myod1a и myod1c увеличивался к ноябрю.

 

Рис. 2. Относительный уровень экспрессии генов (у. ед) myod1a (a), myod1b (b), myod1c (c) в белых мышцах атлантического лосося, выращиваемого в группах с разными режимами освещения и кормления на протяжении периода исследования: сентябрь – значения до эксперимента; группа 1 – “24С КК” – режим освещения постоянный, кормление круглосуточное; группа 2 – “ЕстФ КД” естественный фотопериод, кормление в светлое время суток; группа 3 – “24С КД” – режим освещения постоянный, кормление в светлое время суток. Различия достоверны при p < 0.05 (критерий Краскела–Уоллиса, критерий Манна–Уитни с поправкой на множественное сравнение): * – в сравнении с группой 1, # – в сравнении с группой 2, a – по сравнению со значениями в сентябре, b – по сравнению со значениями в октябре в соответствующей группе.

 

Согласно представленным данным уровень экспрессии генов миостатина отличался как между группами, так и между месяцами (рис. 3). В ноябре выявлен рост экспрессии mstn1a во всех группах, при этом в группе “ЕстФ КД” он был ниже по сравнению с группой “24С КК” (рис. 3a). Различий в уровне экспрессии гена mstn1b между группами не было установлено, однако выявлено увеличение данного показателя в группе “24С КД” к ноябрю (рис. 3b).

 

Рис. 3. Относительный уровень экспрессии генов (у. ед) mstn1a (a), mstn1b (b) в белых мышцах атлантического лосося, выращиваемого в группах с разными режимами освещения и кормления на протяжении периода исследования: сентябрь – значения до эксперимента; группа 1 – “24С КК” – режим освещения постоянный, кормление круглосуточное; группа 2 – “ЕстФ КД” естественный фотопериод, кормление в светлое время суток; группа 3 – “24С КД” – режим освещения постоянный, кормление в светлое время суток. Различия достоверны при p < 0.05 (критерий Краскела–Уоллиса, критерий Манна–Уитни с поправкой на множественное сравнение): * – в сравнении с группой 1, a – по сравнению со значениями в сентябре, b – по сравнению со значениями в октябре в соответствующей группе.

 

Среди генов igf зафиксирована межгрупповая разница только у igf2 (рис. 4b), согласно которой уровень экспрессии гена igf2 в мышцах рыб в октябре был ниже в группе “ЕстФ КД” по сравнению с группой “24С КК”. Также следует отметить, что экспрессия генов igf по-разному изменялась на протяжении эксперимента (рис. 4). Уровень экспрессии гена igf1 увеличивался постепенно к ноябрю, а гена igf2 – сначала увеличивался, затем уменьшался в ноябре, одинаково во всех исследуемых группах.

 

Рис. 4. Относительный уровень экспрессии генов (у. ед) igf1 (a), igf2 (b) в белых мышцах атлантического лосося, выращиваемого в группах с разными режимами освещения и кормления на протяжении периода исследования: сентябрь – значения до эксперимента; группа 1 – “24С КК” – режим освещения постоянный, кормление круглосуточное; группа 2 – “ЕстФ КД” естественный фотопериод, кормление в светлое время суток; группа 3 – “24С КД” – режим освещения постоянный, кормление в светлое время суток. Различия достоверны при p < 0.05 (критерий Краскела–Уоллиса, критерий Манна–Уитни с поправкой на множественное сравнение): * – в сравнении с группой 1, a – по сравнению со значениями в сентябре, b – по сравнению со значениями в октябре в соответствующей группе.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Выявлены различия между исследуемыми группами рыб по уровням экспрессии генов миозина и МРФ, которые позволяют предположить влияние режимов освещения и кормления на процессы роста мышц. Установлены различия между экспериментальными группами по экспрессии myhc уже через месяц после начала исследования. Уровень экспрессии гена myhc был наименьшим в группе “ЕстФ КД” по сравнению с группами круглосуточного освещения (“24С КД” и “24С КК”) и в октябре, и ноябре. В ноябре так же установлен низкий уровень экспрессии mlc-2 у рыб в группе с естественным освещением. Уровни экспрессии генов myhc и mlc-2 могут быть использованы как показатели, отражающие процессы синтеза белка и его накопления и темпы прироста мышечной массы в целом [6, 9, 16]. Относительно низкие значения данных показателей соответствуют более низким темпам роста рыб, выращиваемых при естественном освещении: средний прирост массы на группу за весь период исследования составил 14.1 ± 0.1 г, 12.2 ± 0.2 г, 13.1 ± 0.2 г у рыб с режимами “24С КК”, “ЕстФ КД” и “24С КД” соответственно [32]. Различия в уровне экспрессии гена myhc в первый месяц исследования согласуются с данными по активности ЦО у сеголетков в этом же эксперименте [32]. Уровень активности ЦО в мышцах особей был выше у особей из групп с постоянным освещением (“24С КД” и “24С КК”) по сравнению с группой “ЕстФ КД”. Таким образом, возможно, что доступность корма и высокий уровень аэробного обмена позволяют рыбам, выращиваемым при постоянном освещении, использовать энергию не только для поддержания основного обмена веществ, но и в процессах биосинтеза в мышцах, которые требуют большого количества АТФ. Ранее нами было показано на сеголетках и двухлетках лосося, выращиваемых в условиях рыбоводного завода на Северо-западе России, что рыбы из групп с дополнительным освещением отличались от групп без дополнительного освещения более высоким уровнем экспрессии гена myhc, что так же соответствовало темпам роста этих рыб [28–30].

Постэмбриональный мышечный рост у рыб осуществляется за счет процессов гиперплазии и гипертрофии под контролем специфических миогенных регуляторных факторов – MyoD1, Myf5, миогенина (MyoG). Ранее было показано, что уровень экспрессии генов, регулирующих миогенез (myod, myf5, myog и mrf4), коррелирует с механизмами роста мышц во время развития рыб [15, 34]. Так, на ранних стадиях мышечного роста увеличение уровней экспрессии myod и myf5 в недифференцированных миогенных клетках-предшественниках (МКП) напрямую связано с их интенсивной пролиферацией и последующей клеточной гиперплазией (образованием миотуб и их дифференцировкой в новые мышечные волокна) [15]. Гены myog и mrf4 экспрессируются позже и связаны с терминальной дифференцировкой и слиянием миобластов с существующими миофибриллами в процессе гипертрофии мышечных волокон [15]. Согласно результатам исследования, для группы “24С КК” через месяц после начала исследования установлено увеличение экспрессии myog, myod1a и myod1c, также и для группы “24С КД” установлено повышение уровня myod1c, для группы “ЕстФ КД” значения этих показателей по сравнению с первым месяцем не изменялись. Полученные нами результаты указывают на влияние продолжительности освещения на различия в регуляции процессов миогенеза уже через месяц применения разных режимов фотопериода.

Высоким значениям экспрессии myhc и mlc-2 в мышцах рыб в группах с круглосуточным освещением “24С КК” и “24С КД” по сравнению с таковыми значениями у особей из группы “ЕстФ КД” с естественным освещением в ноябре соответствовал высокий уровень экспрессии myf5. Кроме того, для рыб “24С КК” и “24С КД” уровень экспрессии myf5 в ноябре повышался. Эти результаты соответствуют ранее полученным данным для двухлеток атлантического лосося, согласно которым уровни экспрессии myf5 и myhc, были выше наряду с темпами роста у рыб, выращиваемых в заводских условиях при круглосуточном освещении в отличии от растущих без дополнительного освещения [29]. Ранее в исследовании, проведенном на молоди атлантической трески, было показано, что экспрессия гена myf5 и темпы роста были достоверно выше у рыб в группе с круглосуточным освещением по сравнению с рыбами, которые росли при естественном режиме фотопериода [35].

Уровни экспрессии генов myog, а также паралогов myod1 были самыми высокими в мышцах рыб из группы “24С КД” в ноябре: по уровню экспрессии myod1a и myod1b значения были отличны от двух других групп, а по экспрессии myog и myod1с отличия наблюдались только с группой “24С КК”. При этом обращает на себя внимание различия в характере изменений экспрессии генов. Уровень экспрессии myod1a и myod1b уменьшался в ноябре у рыб “ЕстФ КД” и “24С КК”, а у рыб из третьей группы уровень не изменялся. Кроме того, уровень экспрессии myog в группе “24С КК” к ноябрю уменьшался. Возможно, имеет значение совокупное влияние освещения и рациона питания. Ранее было показано влияние состава питания на экспрессию МРФ [10, 17], что позволяет предположить, что в данном случае различия в процессах регуляции миогенеза могли быть связаны с различиями в общем метаболизме рыб. Так, согласно липидному анализу, наблюдались различия по показателям липидного обмена между рыбами из разных групп в данном эксперименте [31], а именно по маркерным показателям смолтификации, которые количественно были более выражены у рыб в группах “24С КК” и “ЕстФ КД” по сравнению с “24С КД”. При этом эффект совокупного и устойчивого действия фотопериода и кормления, стимулирующий подготовку к смолтификации сеголеток атлантического лосося, выращиваемых в условиях аквакультуры, достигался при их сочетании в круглосуточном режиме [31]. Так же ранее было показано, что смолты дикого атлантического лосося отличаются от пестряток не только по уровню энергетического и липидного обмена, но и по экспрессии генов МРФ, а именно низким уровнем транскриптов myod1a, myod1b и myog [36].

Обращает на себя внимание различие в характере экспрессии паралогов myod1 как между экспериментальными группами, так и на протяжении исследования. Это указывает на функциональные различия между myod1a, myod1b и myod1с, по-видимому, связанные с изменением регуляции миогенеза у рыб под воздействием разных режимов освещения и рациона питания.

По уровню экспрессии гена mstn1 различия наблюдались также на второй месяц исследования. Уровень экспрессии mstn1a был наименьшим в мышцах рыб в группе “ЕстФ КД” несмотря на то, что значения показателя повышались во всех группах ко второму месяцу исследования. Это соответствовало уровню экспрессии myhc, mlc-2 и myf5. Миостатин – негативный регулятор развития мышц позвоночных, ингибирующий пролиферацию и дифференцировку миобластов [37, 38]. Вероятно, MSTN экспрессируется в ответ на высокие уровни МРФ, регулируя интенсивность процессов гиперплазии и гипертрофии мышечных волокон для предотвращения бесконтрольного роста мышц [15, 16]. Что касается экспрессии второго паралога mstn1b, то существенных различий по данному показателю между группами и на протяжении исследования установлено не было. Это указывает на функциональные особенности паралогов в данных экспериментальных условиях (фотопериод, режим кормления, постоянная температура).

Различий по уровню экспрессии igf1 в мышцах рыб между группами не наблюдалось. Значения этого показателя повышались за период исследования во всех группах рыб, что согласуется с активным ростом рыб и увеличением их массы. По уровню экспрессии igf2 различия установлены в первый месяц исследования: несмотря на то, что значения показателя повышались в октябре во всех группах, в группе с естественным освещением они были наименьшими с достоверной разницей по отношению к группе “24С КК”. К ноябрю уровень экспрессии igf2 снижался до уровня в сентябре у рыб во всех экспериментальных группах. Таким образом, наблюдаются различия в процессе регуляции экспрессии igf1 и igf2. Возможно, это связано с различиями их ролей в регуляции роста. Инсулиноподобный фактор роста-II имеет высокую структурную гомологию с IGF-I и экспрессия генов обоих митогенов, по-видимому, регулируются гормоном роста [39]. Оба IGF также действуют через один и тот же рецептор, что позволяет предположить, что они выполняют перекрывающиеся физиологические функции у рыб [12, 40]. В нескольких исследованиях было показано, что IGF-I и IGF-II имеют значение (функционируют) на разных стадиях миогенеза [41]. Так, на клеточной культуре миоцитов дорады Sparus aurata показано, что после инкубации с IGF-II увеличивалась экспрессия myod2 и myf5, генов, включенных в пролиферацию, а IGF-I вызывал повышение mrf4 и myog, включенных в поздние стадии развития, соответствующие дифференциации клеток [41, 42]. Так же igf2 и igf1 по-разному экспрессируются в мышцах рыб во время голодания и насыщения [43, 44]. Во время восстановления питания после голодания у атлантического лосося наблюдалось снижение экспрессии igf2 в мышах, тогда как экспрессия igf1 увеличивалась и соответствовала повышению экспрессии mlc-2, myhc и myog и дальнейшему приросту массы тела [43]. Снижение мРНК igf2 и увеличение экспрессии igf1 в мышцах также совпало с периодом увеличения удельного темпа роста тилапии при восстановлении питания [45]. Это говорит о том, что снижение выработки IGF-II в мышцах может играть определенную роль в компенсаторном росте. Эти результаты позволили предположить, что экспрессия igf1 и igf2 по-разному регулируется в мышцах при изменении пищевого статуса рыбы [45]. Так же и в нашей работе на второй месяц исследования увеличение уровня экспрессии igf1 и снижение igf2 в мышцах рыб из всех экспериментальных групп соответствовало повышению уровня экспрессии гена myhc. Полученные результаты позволяют предположить разную роль IGF-I и IGF-II в период активного роста, и в целом в онтогенезе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, различия в режимах освещения и питания отражались на экспрессии генов МРФ, а, следовательно, и процессах регуляции миогенеза. Выявленные различия в экспрессии генов myog и паралогов myod1 между группами с круглосуточным освещением, но разным режимом питания (круглосуточно и в дневное время) позволили предположить различия в процессах регуляции миогенеза, вызванные изменением времени питания. Установлено, что igf1 и igf2 имеют разный характер экспрессии в период интенсивного роста лосося, что предполагает различия их ролей в регуляции процесса роста рыб в онтогенезе. Поскольку экспрессия myod1a, myod1b и myod1с изменялась по-разному между экспериментальными группами и за период исследования, можно предположить, что паралоги одного и того же гена имеют функциональные различия в регуляции миогенеза в зависимости от режимов освещения и питания.

Представленные в настоящей работе данные расширяют современные знания о молекулярных механизмах регуляции мышечного роста, а также закономерностях роста у рыб при влиянии факторов среды.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают глубочайшую благодарность главному рыбоводу предприятия М. Горбунову за курирование эксперимента, проведение необходимых рыбохозяйственных мероприятий, сбор биоматериала, компетентные консультации и рекомендации в ходе реализации исследования. Исследование было выполнено на научном оборудовании ЦКП КарНЦ РАН.

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Oбсуждение результатов исследования (М.В.К., М.А.Р., Н.С.Ш., С.А.М., А.Е.К., Н.Н.Н.), написание и подготовка публикации (М.В.К., М.А.Р., Н.С.Ш., С.А.М., Н.Н.Н.); пробоподготовка и проведение лабораторного анализа образцов (М.А.Р., М.Ю.К.), анализ и статистическая обработка полученных данных (М.А.Р.), постановка и ведение эксперимента (А.Е.К.), руководитель проекта (Н.Н.Н.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ, принципам Базельской декларации и рекомендациям биоэтического комитета ИБ КарНЦ РАН, протокол № 01 от 11.09.2023 г.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа проведена при финансовой поддержке проекта Российского научного фонда № 19–14–00081-П “Влияние физических факторов на эффективность искусственного (заводского) воспроизводства молоди атлантического лосося Salmo salar: физиолого-биохимическая и молекулярно-генетическая характеристика”.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что какой-либо конфликт интересов отсутствует.

About the authors

M. V. Kuznetsova

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

M. A. Rodin

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

N. S. Shulgina

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

M. Yu. Krupnova

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

A. E. Kuritsyn

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

S. A. Murzina

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

N. N. Nemova

Institute of Biology of the Karelian Research Centre of the Russian Academy of Sciences

Email: kuznetsovamvi@yandex.ru
Russian Federation, Petrozavodsk

References

Supplementary files